專利名稱：一種丁酸梭菌的清液發酵培養基及其發酵培養方法
技術領域：
本發明涉及一種丁酸梭菌的清液發酵培養基及其發酵培養方法，屬于微生物發酵技術領域。
背景技術：
丁酸梭菌iflostridium butyricum)，即丁酸梭狀芽孢桿菌，又名酪酸菌。它是梭狀芽孢菌屬中的一個種，主要存在于奶酪、天然酸奶、人與動物的腸道與糞便中、某些樹葉、 土壤等自然環境中。丁酸梭菌是一種直的或彎曲的革蘭氏陽性厭氧內生芽孢桿菌，對環境變化具有一定的抗性，這些特點使丁酸梭菌具有作為優良益生菌的潛力。另一方面，丁酸梭菌通過動物腸道時，能耐胃酸及膽汁酸鹽，很好地保證了其性能的發揮。在臨床醫學和畜牧業方面廣泛應用于整腸藥物、保健食品、飼料添加劑、微生物肥料等，是一種較理想的具有廣泛開發前景的微生態制劑。1999年2月由聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)聯合召開的第52次食品添加劑專家委員會強調指出丁酸梭菌是人的正常腸道菌。此后，人們廣泛的關注和研究了酪酸梭菌的形態特征、生理特點、生化特點及其商業應用。1940年，丁酸梭菌在日本實現了商業化生產并被應用于臨床。最初，它被用作整腸劑，廣泛用于腸道菌群失調，急慢性腹瀉，腸易激綜合癥，抗生素相關性腸炎等疾病的治療，取得了顯著療效。此后，它先后被作為處方藥、非處方藥、獸藥、飼料添加劑、食品添加劑等廣泛使用。在韓國，酪酸梭菌也已經被用于牛、豬及家禽的飼料添加劑，丁酸梭菌能單獨作為飼料添加劑使用，也能與乳酸菌、 芽孢菌、雙歧桿菌等益生菌復配使用，能增強其功效。益生菌類微生態制劑在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善環境等方面的積極作用已經得到了公認，但是目前真正符合生產要求的高質量微生態制劑產品還很少。丁酸梭菌由于生物學特性，在臨床上具有非常顯著的治療效果，而且因其具有芽孢形態，有較高的實用價值。下述專利CN1144873C、CN1184308C、US5. 292 523 (1994)、US4. 892 731(1990)、 JP63-146825 (1986)、JP61-6625 (1984)、JP06-166825 (1994)、JP05-227898 (1993)涉及到丁酸梭菌的發酵和制備方法，這些現有技術存在一些缺點，1、就培養方式而言，大量運用復合培養基，或者其他含有大量不溶性成分培養基，引起后處理困難，成本高昂，單位菌粉活菌含量低，雜質較多；2、就培養效果而言，發酵液菌數較少，芽孢率較低。
發明內容
本發明為克服現有技術的缺點，提供一種丁酸梭菌的清液發酵培養基及其發酵培養方法，全部添加的是可溶性碳氮源和金屬鹽，無培養基沉淀，利用率高，菌液后處理簡單， 菌粉有效含量高，方便保存，從總體上大幅降低處理成本。本發明的一種丁酸梭菌的清液發酵培養基的技術方案，包括下述組份葡萄糖 0. 8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)， 玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉 0. 2 0. 45% (w /ν) ； PH 值為 7 8。進一步的技術方案是
所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的技術方案，組份是葡萄糖0. 8% (w/v)，胰蛋白胨 0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸銨0. 05 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0.洲(w /ν) ；PH值7。所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基，組份是葡萄糖2. 5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基，組份是葡萄糖1. 5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 12% (w/v)，玉米漿粉0. 33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。本發明一種用于丁酸梭菌的清液發酵培養基促芽孢生成的金屬鹽，包括下述組份硫酸錳 0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸鎂 0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵 0. 01 0. 08% (w/v)
ο進一步的技術方案是
所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基促芽孢生成的金屬鹽，組份是硫酸錳0. 05%(W/ ν)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v)。本發明一種用于丁酸梭菌的清液發酵培養基的增殖培養基(RCM)，組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；調節 pH7. 1 士 0. 1。進一步的技術方案是
所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的增殖培養基(RCM)，配方組成為酵母浸膏3g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、 半胱氨酸鹽酸鹽0. 5 g、0. 5%美藍0. 2mL、蒸餾水IOOOmL ；調節ρΗ7· 1 士 0. 1。本發明一種丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，包括以下步驟
(1)甘油管冷藏菌種活化取甘油管冷藏菌種接種于裝有增殖培養基(RCM)的試管中， 上覆液體石蠟，培養基提前滅菌，然后靜置培養形成芽孢；
(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于水浴中處理；
(3)三角瓶一級種子培養再分別將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中；具有促芽孢生成的金屬鹽的發酵培養基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉，硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵，并保持一定PH值；
(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中發酵；
(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥，即可制得高純菌粉。進一步的技術方案是
所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，在所述步驟中 (1)甘油管冷藏菌種活化取-25 -18°c冷藏的甘油管菌種180 230 μ L接種于裝有6 12mL增殖培養基(RCM)的試管中，上覆1 3cm液體石蠟，培養基提前滅菌，33 38°C條件下靜置培養40 50h以形成芽孢；所述增殖培養基(RCM)包括下述組成重量份 酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、 氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍0. 1 3mL、 蒸餾水 800 1200mL ；調節 pH7. 1 士0. 1,100 120°C，20 min 滅菌備用；
(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于70 90°C水浴中處理9 12min；
(3)三角瓶一級種子培養再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養16_20h到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中；
所述具有促芽孢生成的金屬鹽的發酵培養基，配方組成為葡萄糖0. 8 2. 5% (w/v)， 胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/v)， 碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 2 0. 45% (w /ν)； PH值為7 8 ；硫酸錳0. 01 0. l%(w/v)，硫酸鎂0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵0. 01 0. 08% (w/v)；
(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中，接種量3% 5%， 控溫33 40°C，攪拌轉速45 60rpm，發酵過程中PH值降低到6. 5以下，補加18 25% 碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發酵結束，且發酵Mh以內流加碳源，流加0. 55 1. 5% (w/ ν)碳源;
(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥中進風溫度130 160°C，出口溫度 50 75°C，即可制得高純菌粉。所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，在所述步驟中
(1)甘油管保藏菌種活化取-20°C保藏的甘油管菌種200 μ L接種于裝有9mL增殖培養基(RCM)的試管中，上覆2cm液體石蠟，培養基提前滅菌，37°C條件下靜置培養48h以形成芽孢；所述RCM培養基配方如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10g、葡萄糖 5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g、0. 5%美藍0. 2mL、蒸餾水 IOOOmL ；調節 pH7. 1 士0. 1，115°C，20 min 滅菌備用；
(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于80°C水浴中處理IOmin；加熱可以促進芽孢萌發，有利于菌體生長一致性和防止雜菌污染；
(3)三角瓶一級種子培養再分別以3%的接種量將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養16_20h到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中葡萄糖 1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v)，酵母浸粉1.8% (w/v)，硫酸銨0.1 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 124% (w/v)，玉米漿粉 0. 33% (w /ν)，硫酸錳 0. 05% (w/v)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5;
(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中，接種量3% 5%， 控溫37°C，攪拌轉速50rpm，發酵過程中PH值降低到6. 5以下，補加20%碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發酵結束，且發酵Mh以內流加碳源，流加1% (w/v)碳源；
(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥中進風溫度150°C，出口溫度70°C， 即可制得高純菌粉。本發明的主要優點如下
(1)本發明丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法中，添加可溶性碳氮源和金屬鹽，無培養基沉淀，利用率高，菌液后處理簡單，菌粉有效含量高，方便保存，從總體上大大降低成本。厭氧發酵通過在培養基上覆石蠟，石蠟可重復循環利用，不需要通入惰性氣體， 環保節約。(2)分段流加培養方式，進一步提高丁酸菌含量，進而提高芽孢形成率，采用本發明生產丁酸梭菌，大大提高發酵菌數和芽孢得率，發酵液菌數可達2. 3 X 109CfU/ml，芽孢得率95%以上。(3)加熱優選種子培養基方式，使得菌體生長一致。(4)發酵結束后用噴霧干燥方式，能快速高效獲得大量高含量菌粉。
具體實施例方式實施例1 本發明的丁酸梭菌的清液發酵培養基組份是葡萄糖1. 5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 12% (w/v)，玉米漿粉 0.33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。實施例2 本發明的丁酸梭菌的清液發酵培養基組份是葡萄糖0. 8% (w/v)，胰蛋白胨0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸銨0. 05 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0.洲(w /ν) ；PH值7。實施例3 本發明的丁酸梭菌的清液發酵培養基組份是葡萄糖2. 5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。實施例4 本發明一種用于丁酸梭菌的清液發酵培養基促芽孢生成的金屬鹽，包括下述組份硫酸錳0. 01 0. l%(w/v)，硫酸鎂0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵0. 01 0. 08% (w/v)。本實施例組份是硫酸錳0. 05% (w/v)，硫酸鎂0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v)。實施例5 本發明一種用于丁酸梭菌的清液發酵培養基的增殖培養基(RCM)，組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5,0. 5%美藍 0. 1 3mL、蒸餾水800 1200mL ；調節pH7. 1 士0. 1。本實施例配方組成為酵母浸膏3g、 牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、0. 5%美藍0. 2mL、蒸餾水IOOOmL;調節pH7. 1 士0. 1。實施例6 本發明一種丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，有以下步驟
(1)甘油管冷藏菌種活化取甘油管冷藏菌種接種于裝有增殖培養基(RCM)的試管中， 上覆液體石蠟，培養基提前滅菌，然后靜置培養形成芽孢；
(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于水浴中處理；加熱可以促進芽孢萌發，有利于菌體生長一致性和防止雜菌污染；
(3)三角瓶一級種子培養再分別將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養到對數期作為種子液接種到發酵培養基中；具有促芽孢生成的金屬鹽的發酵培養基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉，硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵，并保持一定PH值；
(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中發酵；
(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥，即可制得高純菌粉。本發明所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，在所述步驟中，參數選值范圍為
(1)甘油管冷藏菌種活化取-25 _18°C冷藏的甘油管菌種180 230μ L接種于裝有6 12mL增殖培養基(RCM)的試管中，上覆1 3cm液體石蠟，培養基提前滅菌，33 38°C條件下靜置培養40 50h以形成芽孢；所述增殖培養基(RCM)組成重量份如下酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；調節 pH7. 1 士0. 1，100 120°C，20 min 滅菌備用；
(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于70 90°C水浴中處理9 12min；
(3)三角瓶一級種子培養再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養16_20h到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中；
所述具有促芽孢生成的金屬鹽的發酵培養基，包括下述組份葡萄糖0. 8 2. 5% (w/ ν)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/ ν)，碳酸氫鈉0.05 0.25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 2 0. 45% (w / ν)，PH值為7 8 ；硫酸錳0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸鎂0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸亞鐵0.01-0. 08% (w/v)；
(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中，接種量3% 5%， 控溫33 40°C，攪拌轉速45 60rpm，發酵過程中PH值降低到6. 5以下，補加18 25% 碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發酵結束，且發酵Mh以內流加碳源，流加0.55 1.5% (w/ ν)碳源;
(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥中進風溫度130 160°C，出口溫度 50 75°C，即可制得高純菌粉。 具體實施方案是所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，在所述步驟中
(1)甘油管保藏菌種活化取-20°C保藏的甘油管菌種200 μ L接種于裝有9mL增殖培養基(RCM)的試管中，上覆2cm液體石蠟隔絕空氣，石蠟和培養基提前滅菌(115°C滅菌 20分)，制備四管，37°C條件下靜置培養48h以形成芽孢；所述增殖培養基(RCM)配方組成如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g、0. 5%美藍0. 2mL、蒸餾水IOOOmL ；調節ρΗ7· 1 士0. 1 ；
(2)加熱優選選生長健壯樣本，將上述培養液各自混勻后置于80°C水浴中處理 IOmin ；加熱可以促進芽孢萌發，有利于菌體生長一致性和防止雜菌污染；
(3)三角瓶一級種子培養再分別以3%的接種量(即6ml)將上述菌液轉接到裝有200ml 已滅過菌的優化后培養基的250ml三角瓶中(上覆液體石蠟)，共接種3瓶，37°C培養16_20h 到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中葡萄糖1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v), 酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 124% (w/v)，玉米漿粉0. 33% (w / ν)，硫酸錳 0. 05% (w/v)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5 ；
(4)液體發酵將培養1 左右三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中，發酵罐裝液系數70%，上覆2 ml左右液體石蠟，隔絕空氣，接種量350 ml ( 3% 5%)，控溫37°C，攪拌轉速50rpm，發酵過程中PH值降低到6. 5以下，補加20%碳酸鈉(質量分數)控制PH值為 6. 5，直到發酵結束，且發酵Mh以內流加碳源，流加1%(w/v)碳源，即葡萄糖70g，30h以后，每隔池鏡檢染色，觀察芽孢形成95%以上，放罐；
(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質預處理，控制噴霧干燥中進風溫度150°C，出口溫度70°C，即可制得高純菌粉，收集菌粉保存。
本發明權利要求保護范圍不僅限于上述實施例。
權利要求
1.一種丁酸梭菌的清液發酵培養基，其特征在于，包括下述組份葡萄糖0. 8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨 0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉 1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨 0. 05 0. 2 % (w/ ν)，碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 2 0. 45% (w / ν) ； PH值為7 8。
2.根據權利要求1所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基，其特征在于，組份是葡萄糖 0. 8% (w/v)，胰蛋白胨0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸銨0. 05 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 05 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0.洲(w /ν) ；PH值7。
3.根據權利要求1所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基，其特征在于，組份是葡萄糖 2.5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸銨0.2 % (w/v)，碳酸氫鈉0.25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。
4.根據權利要求1所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基，其特征在于，組份是葡萄糖1.5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 12% (w/v)，玉米漿粉 0. 33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。
5.一種用于權利要求1所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基促芽孢生成的金屬鹽，其特征在于，包括下述組份硫酸錳0. 01 0. 1%(w/v)，硫酸鎂0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵 0. 01 0. 08% (w/v)。
6.根據權利要求5所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基促芽孢生成的金屬鹽，其特征在于，組份是硫酸錳0. 05% (w/v)，硫酸鎂0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵0. 03% (w/v)。
7.一種用于權利要求1所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的增殖培養基(RCM)，其特征在于，組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、 0. 5% 美藍 0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；調節 pH7. 1 士 0. 1。
8.根據權利要求7所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的增殖培養基(RCM)，其特征在于，配方組成為酵母浸膏3g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、 氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、0.5%美藍0.2mL、蒸餾水IOOOmL ； 調節 pH7. 1 士 0. 1。
9.一種丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，其特征在于，包括以下步驟(1)甘油管冷藏菌種活化取甘油管冷藏菌種接種于裝有增殖培養基(RCM)的試管中， 上覆液體石蠟，培養基提前滅菌，然后靜置培養形成芽孢；(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于水浴中處理；(3)三角瓶一級種子培養再分別將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中；具有促芽孢生成的金屬鹽的發酵培養基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉，硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵，并保持一定PH值；(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中發酵；(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥，即可制得高純菌粉。
10.根據權利要求9所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，其特征在于， 在所述步驟中(1)甘油管冷藏菌種活化取-25 _18°C冷藏的甘油管菌種180 230 μ L接種于裝有6 12mL增殖培養基(RCM)的試管中，上覆1 3cm液體石蠟，培養基提前滅菌，33 38°C條件下靜置培養40 50h以形成芽孢；所述增殖培養基(RCM)組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍0. 1 3mL、蒸餾水 800 1200mL ；調節 ρΗ7· 1 士0. 1，100 120°C，20 min 滅菌備用；(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于70 90°C水浴中處理9 12min；(3)三角瓶一級種子培養再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養16_20h到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中；所述具有促芽孢生成的金屬鹽的發酵培養基，組份為葡萄糖0.8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆漿粉0. 2 0. 45% (w /ν) ； PH值為7 8 ；硫酸錳0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸鎂0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸亞鐵0. 01 0. 08% (w/ ν)；(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中，接種量3% 5%， 控溫33 40°C，攪拌轉速45 60rpm，發酵過程中PH值降低到6. 5以下，補加18 25% 碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發酵結束，且發酵Mh以內流加碳源，流加0. 55 1. 5% (w/ ν)碳源;(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥中進風溫度130 160°C，出口溫度 50 75°C，即可制得高純菌粉。
11.根據權利要求9或10所述的丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法，其特征在于，在所述步驟中(1)甘油管保藏菌種活化取-20°C保藏的甘油管菌種200 μ L接種于裝有9mL增殖培養基(RCM)的試管中，上覆2cm液體石蠟，培養基提前滅菌，37°C條件下靜置培養48h以形成芽孢；所述增殖培養基(RCM)配方組成如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨 10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g、0. 5%美藍 0. 2mL、蒸餾水 IOOOmL ；調節 pH7. 1 士0. 1，115°C，20 min 滅菌備用；(2)加熱優選將上述培養液混勻后置于80°C水浴中處理IOmin；加熱可以促進芽孢萌發，有利于菌體生長一致性和防止雜菌污染；(3)三角瓶一級種子培養再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉接到滅過菌的優化后培養基的三角瓶中，培養16_20h到對數期能作為種子液接種到發酵培養基中葡萄糖 1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v)，酵母浸粉1.8% (w/v)，硫酸銨0.1 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 124% (w/v)，玉米漿粉 0. 33% (w /ν)，硫酸錳 0. 05% (w/v)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5 ；(4)液體發酵將培養好的三角瓶一級種子培養基接入發酵罐中，接種量3% 5%， 控溫37°C，攪拌轉速50rpm，發酵過程中PH值降低到6. 5以下，補加20%碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發酵結束，且發酵Mh以內流加碳源，流加1% (w/v)碳源；(5)噴霧干燥發酵液用均質機均質，控制噴霧干燥中進風溫度150°C，出口溫度70°C， 即可制得高純菌粉。
全文摘要
本發明涉及丁酸梭菌的清液發酵培養基，有葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉等，PH值為7～8。用于丁酸梭菌的清液發酵培養基促芽孢生成的金屬鹽有硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵。用于丁酸梭菌的清液發酵培養基的增殖培養基有酵母浸膏、牛肉浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、三水合乙酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽、0.5%美藍、蒸餾水；調節pH7.1。丁酸梭菌的清液發酵培養基的發酵培養方法步驟包括甘油管冷藏菌種活化、加熱優選、三角瓶一級種子培養、液體發酵、噴霧干燥。本發明優點是生產丁酸梭菌具有操作簡單、發酵菌數和芽孢得率高，后處理簡單，菌粉樣品雜質少，有效活菌數高，總體上節約成本等優點。
文檔編號C12N1/20GK102363754SQ20111011692
公開日2012年2月29日 申請日期2011年5月7日 優先權日2011年5月7日
發明者彭楠, 梁運祥, 王績, 葛向陽, 趙旭冬, 趙述淼 申請人:華中農業大學