專利名稱：一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法
技術領域：
本發明涉及脂肪酶的修飾技術領域，具體涉及一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法。
背景技術：
脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶；EC 3. 1. 1. 3)是一類特殊的酰基水解酶，能在油水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、內酯合成、多肽合成、高聚物合成以及手性藥物等有機合成反應，是使用最為廣泛的酶之一。主要應用于食品、化學、油脂化學品、農業化學、造紙、洗滌和生物表面活性劑的合成及生物柴油生產等工業。脂肪酶的工業化應用主要有兩個障礙，一是成本高，二是脂肪酶的穩定性與活性問題。在解決這些難題方面，眾多研究者對脂肪酶的穩定性和活性提高進行了研究，主要集中在酶的固定化和化學修飾方面。化學修飾改造酶的分子結構操作復雜，而且酶易在改造的過程中失活。采用胰蛋白酶對脂肪酶進行酶學修飾，操作簡單，條件溫和，不僅可以顯著提高游離脂肪酶的活力，也可以顯著提高固定化脂肪酶的活力。酶蛋白的活性中心氨基酸殘基的組成，是酶具有催化作用的決定性因素，而酶活性中心與底物的結合是酶具有活力的主要因素。酶活性中心易于與底物結合，則酶活力高， 反之酶活力低。用胰蛋白酶對脂肪酶進行酶學修飾，胰蛋白酶以脂肪酶為底物，對脂肪酶的肽鍵進行特異性的作用，利用肽鏈的有限水解，有利于脂肪酶的活性中心與底物結合并且形成準確的催化部位，使脂肪酶的活性得到提高。本發明提供一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，在一定的條件用胰蛋白酶對脂肪酶進行處理，可以顯著提高其水解活力。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法。本發明在一定的條件用胰蛋白酶對脂肪酶進行處理后得到催化活力提高的脂肪酶，可以顯著提高脂肪酶的水解活力。本發明提供一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，包括以下步驟
(1)胰蛋白酶用PH2.5-4. 0的HCl溶液配制為l_5mg/mL的酶溶液，置于0_4°C冷藏備
用；
(2)采用胰蛋白酶對游離脂肪酶或固定化脂肪酶進行處理，分別對應如下(a)和(b)
(a)將游離脂肪酶和所述酶溶液加入到pH為7-8的緩沖液中，于25-37°C恒溫條件下處理20-60min，其中游離脂肪酶和胰蛋白酶的蛋白質質量比例為1:1-1:5。
(b)將固定化脂肪酶和所述酶溶液加入到pH為7-8的緩沖液中，于25-37°C恒溫條件下處理20-60min，采用過濾或抽濾的方法分離出固定化脂肪酶，其中固定化脂肪酶和胰蛋白酶按質量比為50:1-25:1。
上述方法中，步驟(1)所述胰蛋白酶的酶活力為2300_2800U/mg。上述方法中，步驟(1)所述胰蛋白酶為Sigma公司的產品，從豬胰中提取，酶活力為2500U/mg，蛋白質含量99. 9%。上述方法中，步驟(2)所述脂肪酶為Platase 20000L脂肪酶，液體酶，為諾維信 (中國)生物技術有限公司的產品，酶活力為570U/mL，蛋白質含量為％ig/mL。上述方法中，步驟(2)中所述緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。上述方法中，步驟(2)所述固定化脂肪酶為用大孔樹脂HPD-600作為載體對諾維信(中國)生物技術有限公司的Platase 20000L游離脂肪酶進行固定得到的固定化酶。上述方法，步驟(2)處理后的脂肪酶采用橄欖油乳化法測定活力，在pH7-8的條件下測定。橄欖油乳化法測定脂肪酶活力的乳化液制備條件為橄欖油(化學純): 聚乙烯醇溶液(V:V)=1 :3，600W下超聲;3min，可形成均一穩定的乳化液。脂肪酶活力測定步驟為分別移取細1磷酸緩沖液(pH7. 0,0. 05mol/L)和游離脂肪酶50 μ L (固定化酶25mg)于50mL 錐形瓶中，置于37°C恒溫水浴振蕩器中預熱lOmin，然后加入4mL乳化液，ISOrpm振蕩反應 20min，加入15mL 95%乙醇停止反應。空白為用50 μ L緩沖液代替酶液。用0. 05mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定反應產生的脂肪酸，酚酞為指示劑。酶活定義為在上述條件下，每分鐘生成1 μ mol脂肪酸所需的酶量為1個活力單位，用U/ml表示。酶活
權利要求
1.一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，具體包括如下步驟(1)胰蛋白酶用PH2.5-4. 0的HCl溶液配制為l_5mg/mL的酶溶液，置于0_4°C冷藏備用；(2)將游離脂肪酶和所述酶溶液加入到pH為7-8的緩沖液中，于25-37°C恒溫條件下處理20-60min，其中游離脂肪酶和胰蛋白酶的蛋白質質量比例為1:1-1:5。
2.根據權利要求1所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，步驟(1) 中，所述胰蛋白酶的酶活力為2300-2800U/mg。1
3.根據權利要求1所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，步驟(1) 中，所述胰蛋白酶為Sigma公司的產品，從豬胰腺中提取，酶活力為2500U/mg。
4.根據權利要求1所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，步驟(2) 中，所述游離脂肪酶為諾維信(中國)生物技術有限公司的Platase 20000L脂肪酶。
5.根據權利要求1所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，所述緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
6.一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，具體包括如下步驟胰蛋白酶用PH2. 5-4. 0的HCl溶液配制為l-5mg/mL的酶溶液，置于0_4°C冷藏備用；將固定化脂肪酶和所述酶溶液加入到PH為7-8的緩沖液中，于25-37°C恒溫條件下處理20-60min，采用過濾或抽濾的方法分離出固定化脂肪酶，其中固定化脂肪酶和胰蛋白酶按質量比為50:1-25:1。
7.根據權利要求6所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，步驟(1) 中，所述胰蛋白酶的酶活力為2300-2800U/mg。1
8.根據權利要求6所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，步驟(1) 中，所述胰蛋白酶為Sigma公司的產品，從豬胰腺中提取，酶活力為2500U/mg。
9.根據權利要求6所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是，步驟(2) 中，所述固定化脂肪酶為采用大孔樹脂HPD-600作為載體對諾維信(中國)生物技術有限公司的Platase 20000L游離脂肪酶進行固定得到的固定化酶。
10.根據權利要求6所述的一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，其特征是所述緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
全文摘要
本發明提供一種提高脂肪酶活力的酶學修飾方法，該方法將胰蛋白酶用HCl溶液配制一定濃度的酶溶液，游離脂肪酶或固定化脂肪酶和蛋白酶按一定比例加入到一定pH值的緩沖溶液中，混勻后在恒溫水浴鍋溫育一段時間后，用橄欖油乳化法在37℃下測定脂肪酶的活力，與未經蛋白酶處理的脂肪酶的活力相比較得出修飾后的脂肪酶的活力提高率。本發明步驟簡單，易于操作，可以顯著提高游離脂肪酶和固定化脂肪酶的的酶活(游離脂肪酶活力提高率可達32%，固定化脂肪酶活力提高率可達38%)，反應條件溫和，不會因為極端條件導致脂肪酶的變性失活。
文檔編號C12N9/20GK102242090SQ20111010965
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者劉自琴, 劉艷豐, 王娟, 黃惠華 申請人:華南理工大學