專利名稱：冬凌草素的生物轉化合成方法
技術領域：
本發明涉及一種有機化合物的合成方法，特別是涉及一種冬凌草素貝殼杉烯型二萜類化合物的生物轉化合成方法。
背景技術：
冬凌草學名碎米椏，拉丁名為Tfe力 /osia rMseasi (Hamst)，又名冰凌草、延命草、 彩花草等，冬凌草為唇形科香茶屬多年生草本或亞灌木，具有清熱解毒、消炎止痛、健胃活血之效。主要分布于河南省太行、王屋山區，由于亂采濫挖，導致其自然資源近于枯竭。冬凌草植物中含有單萜、倍半萜、二萜、三萜類化合物，以及含有Fe、Ca、Zn、Se 等多種微量元素和丙氨酸、天冬氨酸等多種氨基酸等活性成分，冬凌草素包括冬凌草甲素(rubescenin A=oridonin)、冬凌草乙素(rubescensin B= ponicidin)、冬凌草丙素 (rubescensin C)和冬凌草丁素(pubescence D)等，均屬于貝殼杉烯型二萜類化合物，其中的主要有效成分為冬凌草甲素。冬凌草甲素是一種具有抗癌、抗菌、抗病毒、消炎、殺蟲、鎮痛等作用的化合物，其中①抗癌方面對S-180、肝癌、食管癌及網組織細胞肉瘤等均有對抗作用；②抗菌方面對 19種細菌有中等程度的抑制作用，對革蘭氏陽性菌效果較好；③殺蟲效果對鱗翅目幼蟲有抑制其生長的作用。冬凌草甲素毒性很低，可用于醫療和保健功能領域。但是，這類化合物在天然植物中含量很低，且化學結構復雜，利用化學方法進行全合成非常困難，且不經濟。由此嚴重地限制了對其進一步的開發和利用。關于冬凌草素方面的相關專利文獻報道1、申請號為200610017358.0、發明名稱為“新對映貝殼杉烯類二萜化合物及其衍生物、其制備方法和用途”的發明專利，公開了的制備方法為將冬凌草地上部分用有機溶劑浸泡，于40-60°C下，浸泡3小時-3天，然后濃縮除去大部分溶劑，濃縮液經大孔吸附樹脂和硅膠反復層析分離即得濟源冬凌草素A。該對映貝殼杉烯二萜可作為不對稱有機化合物和藥物合成的理想中間體，還可作為抗腫瘤、 抗炎、免疫等藥物使用。將其與羥基化合物縮合得到各種縮醛衍生物；將其與胺基化合物反應得到各種氨基衍生物；將其與酰鹵、酸酐反應得到各種酰基化衍生物。2、申請號為 200610065836. 5、發明名稱為“一種冬凌草素結構化制劑組合物”的發明專利，該發明專利公開的組合物中含有冬凌草素、冬凌草素共溶劑、油性載體、水和表面活性劑。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種冬凌草素貝殼杉烯型二萜類化合物的生物轉化合成方法。采用本發明技術方案培養制備冬凌草素，不受自然資源的限制，并且有利于保護生態環境。本發明技術方案易于工業化生產，培養時間較短，產物收率較高，生產成本較低。為了解決上述問題，本發明采用的技術方案是
本發明提供一種冬凌草素的生物轉化合成方法，所述合成方法包括以下步驟a、固體培養基的制備
以1升固體培養基為基準，固體培養基的組成成分中含有硫酸鎂160 360 mg，磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉之和70 370mg，硝酸鉀860 4250mg， 硝酸銨725 4650mg，氯化鈣180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸 1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸鋅 2. 1 32. 3mg，鉬酸鈉 0. 0125 0. 0725mg，硫酸銅0. 0125 0. 0725mg，氯化鈷0. 0125 0. 0725mg，碘化鉀0. 0215 2. 65mg，硫酸亞鐵 6. 5 65. 5mg, EDTA 鈉鹽 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 鐵鹽 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一種或任兩種0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一種或任兩種或任三種0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，瓊脂 4500 33000mg ；
按照上述1升固體培養基組成中各成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂，加入配制的溶液中進行溶化，調節溶液的PH值為4. 5 7. 0，然后將調節后所得溶液進行分裝，經滅菌后得到固體培養基；
b、取冬凌草的葉片、葉芽或根莖外皮消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于 15 30°C條件下培養12 56天，培養后得到愈傷組織；
c、將步驟b得到的愈傷組織置于索氏提取器或圓底燒瓶中，用有機溶劑回流提取2 6小時或浸泡提取6 48小時，提取后除去有機溶劑，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟a中所述固體培養基的組成成分中還含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和煙酸0. 025 2. 5mg。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟a中所述EDTA鈉鹽為EDTA 二鈉 Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA鐵鹽為乙二胺四乙酸鐵銨。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟a中所述滅菌是在98 kPa、 120°C 125°C條件下，滅菌20 40 min。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟c中所述有機溶劑為醇類有機物、醚類有機物或酯類有機物；
所述醇類有機物為甲醇、質量濃度為95%的乙醇或無水乙醇，醇類有機物的用量為所得愈傷組織重量的10 20倍；
所述醚類有機物為乙醚、苯甲醚、二氧六環、四氫呋喃或環氧丙烷；醚類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍；
所述酯類有機物為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍。一種冬凌草素的生物轉化合成方法，所述合成方法包括以下步驟 a、固體培養基的制備
以1升固體培養基為基準，固體培養基的組成成分中含有硫酸鎂160 360 mg，磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉之和70 370mg，硝酸鉀860 4250mg， 硝酸銨725 4650mg，氯化鈣180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸 1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸鋅 2. 1 32. 3mg，鉬酸鈉 0. 0125 0. 0725mg，硫酸銅0. 0125 0. 0725mg，氯化鈷0. 0125 0. 0725mg，碘化鉀0. 0215 2. 65mg，硫酸亞鐵 6. 5 65. 5mg, EDTA 鈉鹽 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 鐵鹽 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一種或任兩種0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一種或任兩種或任三種0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，瓊脂 4500 33000mg ；
按照上述1升固體培養基組成中各成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂，加入配制的溶液中進行溶化，調節溶液的PH值為4. 5 7. 0，然后將調節后所得溶液進行分裝，經滅菌后得到固體培養基；
b、液體培養基的制備
以1升液體培養基為基準，液體培養基的組成成分中含有硫酸鎂160 689 mg，磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉之和70 350mg，硝酸鉀860 4200mg， 硝酸銨725 4600mg，氯化鈣180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸
1.6 25. 8mg,硫酸猛 3. 9 62. 5mg,硫酸鋅 2. 1 32. 2mg,鉬酸鈉 0. 0125 0. 0725mg, 硫酸銅 0. 0125 0. 0725mg，氯化鈷 0. 0125 0. 0725 mg，碘化鉀 0. 0215 2. 65 mg，硫酸亞鐵 6. 5 65. 5mg, EDTA 鈉鹽 9. 8 76. 4mg 或 EDTA 鐵鹽 21. 5 86mg, 2，4-D,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基腺嘌呤中的任一種或任兩種0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一種或任兩種或任三種0. 1 50mg，蔗糖 12000 60000mg ；
按照上述1升液體培養基組成中各成分的含量逐一稱取，將除蔗糖以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖加入配制的溶液中進行溶化，調節溶液的PH值為4. 5 7. 0，將調節后所得溶液進行分裝，經滅菌后得到液體培養基；
c、取冬凌草的葉片、葉芽或根莖外皮消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于 15 32°C條件下培養12 36天，培養后得到愈傷組織；
d、將步驟c得到的愈傷組織取出，轉入步驟b制備的液體培養基中，置于震蕩培養箱或搖床或生物反應器內，在15 32°C條件下繼續培養18 32天，培養后將愈傷組織和培養液過濾分離；
e、將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于索氏提取器或圓底燒瓶中，用有機溶劑回流提取2 6小時或浸泡提取6 48小時，提取后除去有機溶劑，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟a中所述固體培養基的成分中還含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和煙酸0. 025 2. 5 mg ；
步驟b中所述液體培養基的成分中還含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和煙酸0. 025
2.5mg。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟a中所述EDTA鈉鹽為EDTA 二鈉 Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA鐵鹽為乙二胺四乙酸鐵銨；
步驟b中所述EDTA鈉鹽為EDTA 二鈉Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA鐵鹽為乙二胺四乙酸鐵銨。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟a中所述滅菌是在98 kPa、120°C 125°C條件下，滅菌20 40 min ；
步驟b中所述滅菌是在98 kPa、120°C 125°C條件下，滅菌20 40 min。根據上述的冬凌草素的生物轉化合成方法，步驟c中所述有機溶劑為醇類有機物、醚類有機物或酯類有機物；
所述醇類有機物為甲醇、質量濃度為95%的乙醇或無水乙醇，醇類有機物的用量為所得愈傷組織重量的10 20倍；
所述醚類有機物為乙醚、苯甲醚、二氧六環、四氫呋喃或環氧丙烷；醚類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍；
所述酯類有機物為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍。本發明的積極有益效果
1、本發明采用生物學和細胞工程學中的組織(細胞)培養方法進行合成冬凌草素，這樣使其冬凌草素的制備不受自然資源的限制，并且有利于保護生態環境。2、本發明技術方案中培養基為組織(細胞)培養中廣泛采用的植物細胞培養基，成分易得，培養基中含有氮、磷、鉀等大量元素，硼、鋅、錳、鉬、銅、鈷、鈉、碘、鐵等微量元素，硫胺、吡多醇、煙酸、肌醇等維生素和2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤、6-糠氨基腺嘌呤、萘乙酸、萘甲酸、吲哚-3-乙酸、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸等植物生長調節物質，能夠提供組織(細胞)培養所需的各種營養成分，培養條件溫和，提取方法簡便易行。因此，本發明技術方案易于工業化生產。3、本發明技術方案中，第一種方法僅采用固體培養基進行培養；第二種方法先采用固體培養基培養，然后轉入液體培養基進行培養，這樣更易于工業化大規模生產，且縮短培養時間，產物收率大大提高，生產成本得以大大降低。四
圖1為利用本發明技術方案所得產物的結構示意圖五具體實施例方式
以下實施例僅為了進一步說明本發明，并不限制本發明的內容。實施例1 一種冬凌草素的生物轉化合成方法
技術領域：
本發明一種冬凌草素的生物轉化合成方法，所述合成方法的詳細步驟如下
a、固體培養基的制備
固體培養基的組成成分為硫酸鎂360mg，磷酸二氫鉀170mg，硝酸鉀1900mg，硝酸銨 1650mg,氯化鈣440mg,硫胺1. Omg,肌醇IOOmg,硼酸6. 2mg,硫酸錳15. 6mg,硫酸鋅8. 6mg， 鉬酸鈉0. 025mg，硫酸銅0. 025mg，氯化鈷0. 025mg，碘化鉀0. 085mg，硫酸亞鐵27. 8mg,EDTA 鈉鹽(EDTA 二鈉)37. 3mg, 2，4-D 1. Omg,6-糠氨基嘌呤 2. Omg，萘乙酸 3. Omg,蔗糖 30000mg 和瓊脂12000mg ；
按照上述固體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為5. 8，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、121°C條件下滅菌25min，滅菌后得到固體培養基；
b、取冬凌草的葉片或葉芽或嫩莖消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于25°C條件下培養42天，培養后得到愈傷組織；
C、將步驟b得到的愈傷組織取出置于索氏提取器中，采用無水乙醇回流提取4小時，無水乙醇的用量為所得愈傷組織重量的15倍，然后蒸發出乙醇，得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。實施例2 與實施例1基本相同，不同之處在于
步驟a中固體培養基的組成成分為硫酸鎂270mg，磷酸二氫鈉370mg，硝酸鉀860mg， 硝酸銨4650mg,氯化鈣180mg,硫胺1. 25mg,肌醇25mg,硼酸25. 8mg,硫酸錳62. 5mg,硫酸鋅2. Img,鉬酸鈉0. 0125mg,硫酸銅0. 0125mg,氯化鈷0. 0725mg,碘化鉀2. 65mg,硫酸亞鐵 65. 5mg，EDTA鈉鹽(EDTA 二鈉)9. 8mg，N6-呋喃甲基腺嘌呤10mg，萘甲酸2. Omg、吲哚-3-乙酸 15mg，蔗糖;35000mg 和瓊脂 33000mg ；
按照上述固體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為6. 5，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、125°C條件下滅菌20min，滅菌后得到固體培養基；
步驟b中取冬凌草葉片消毒后置于步驟a制備的固體培養基中，于條件下培養 42天;
步驟c中采用甲醇回流提取6小時，甲醇的用量為所得愈傷組織重量的10倍。實施例3 與實施例1基本相同，不同之處在于
步驟a中固體培養基的組成成分為硫酸鎂160mg，磷酸二氫鉀70mg，硝酸鉀4250mg， 硝酸銨725mg，氯化鈣980mg，硫胺0. 05mg,肌醇250mg，硼酸1. 6mg,硫酸錳3. 9mg,硫酸鋅 32. 3mg，鉬酸鈉0. 0725mg，硫酸銅0. 0725mg，氯化鈷0. 0125mg，碘化鉀0. 0215mg，硫酸亞鐵 6. 5mg, EDTA鈉鹽(EDTA 二鈉)76. 6mg, 6-芐基腺嘌呤25mg, 4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸 55mg，蔗糖 12000mg 和瓊脂 4500mg ；
按照上述固體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為4. 5，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、120°C條件下滅菌40min，滅菌后得到固體培養基；
步驟b中取冬凌草葉片消毒后置于步驟a制備的固體培養基中，于15°C條件下培養 56天;
步驟c中采用乙醚回流提取5小時，乙醚的用量為所得愈傷組織重量的15倍。實施例4 與實施例1基本相同，不同之處在于
步驟a中固體培養基的組成成分為硫酸鎂220mg，磷酸二氫鉀170mg、磷酸二氫鈉 130mg，硝酸鉀3500mg，硝酸銨3850mg，氯化鈣680mg，硫胺0. 15mg，肌醇160mg，硼酸16mg， 硫酸錳39mg，硫酸鋅2;3mg，鉬酸鈉0. 0525mg,硫酸銅0. 045mg,氯化鈷0. 045mg,碘化鉀 0. 045mg，硫酸亞鐵45mg，EDTA鐵鹽(乙二胺四乙酸鐵銨)53. 5mg，6_芐基腺嘌呤5mg，萘乙酸3. 0_g、萘甲酸5. Omg,吡哆醇0. 15mg，煙酸1. 5mg，蔗糖12000mg和瓊脂4500mg ；
按照上述固體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為5. 6，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、122°C條件下滅菌30min，滅菌后得到固體培養基；
步驟b中取冬凌草葉片消毒后置于步驟a制備的固體培養基中，于30°C條件下培養 26天;
步驟c中采用乙酸甲酯回流提取5小時，乙酸甲酯的用量為所得愈傷組織重量的12倍。實施例5 —種冬凌草素的生物轉化合成方法
技術領域：
本發明一種冬凌草素的生物轉化合成方法，所述合成方法的詳細步驟如下
a、固體培養基的制備與實施例1中固體培養基的制備相同；
b、液體培養基的制備
液體培養基的組成成分為硫酸鎂360mg，磷酸二氫鉀170mg，硝酸鉀1900mg，硝酸銨 1650mg,氯化鈣440mg,硫胺1. Omg,肌醇IOOmg,硼酸6. 2mg,硫酸錳15. 6mg,硫酸鋅8. 6mg， 鉬酸鈉0. 025mg,硫酸銅0. 025mg,氯化鈷0. 025mg,碘化鉀0. 085mg,硫酸亞鐵27. 8mg, EDTA鈉鹽(EDTA 二鈉)37. 3mg, 2，4-D 1. Omg,6-糠氨基嘌呤2. Omg，萘乙酸3. Omg和蔗糖 30000mg ；
按照上述液體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為5. 6，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、121°C條件下滅菌20min，滅菌后得到液體培養基；
c、取冬凌草的葉片消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于條件下培養42 天，培養后得到愈傷組織；
d、將步驟c得到的愈傷組織取出，轉入步驟b制備的液體培養基中，置于震蕩培養箱內，在25°C條件下繼續培養18天，培養后將愈傷組織和培養液過濾分離；
e、將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于索氏提取器中，用無水乙醇回流提取4小時， 無水乙醇的用量為所得愈傷組織重量的10倍，提取后除去無水乙醇，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。實施例6 與實施例5基本相同，不同之處在于
步驟a 固體培養基的制備同實施例2中固體培養基的制備相同； 步驟b:液體培養基的制備
液體培養基的組成成分為硫酸鎂270mg，磷酸二氫鈉370mg，硝酸鉀860mg，硝酸銨 4650mg,氯化鈣180mg,硫胺1. 25mg,肌醇25mg,硼酸25. 8mg,硫酸錳62. 5mg,硫酸鋅2. Img, 鉬酸鈉0. 0125mg,硫酸銅0. 0125mg,氯化鈷0. 0725mg,碘化鉀2. 65mg,硫酸亞鐵65. 5mg， EDTA鈉鹽(EDTA 二鈉)9. 8mg, N6-呋喃甲基腺嘌呤10mg，萘甲酸2. Omg、吲哚-3-乙酸15mg 和蔗糖:35000mg ；
按照上述液體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為6. 5，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、125°C條件下滅菌20min，滅菌后得到液體培養基；
步驟c 取冬凌草的嫩芽消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于32°C條件下培養 28天；步驟d 將步驟c得到的愈傷組織取出，轉入步驟b制備的液體培養基中，置于震蕩培養箱內，在32 °C條件下繼續培養18天；
步驟e 將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于索氏提取器中，用甲醇回流提取6小時，甲醇的用量為所得愈傷組織重量的15倍，提取后除去甲醇，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。實施例7 與實施例5基本相同，不同之處在于
步驟a 固體培養基的制備同實施例3中固體培養基的制備相同； 步驟b:液體培養基的制備
液體培養基的組成成分為硫酸鎂160mg，磷酸二氫鉀70mg，硝酸鉀4250mg，硝酸銨 725mg，氯化鈣980mg,硫胺0. 05mg,肌醇250mg,硼酸1. 6mg,硫酸錳3. 9mg,硫酸鋅32. 3mg, 鉬酸鈉0. 0725mg,硫酸銅0. 0725mg,氯化鈷0. 0125mg,碘化鉀0. 0215mg,硫酸亞鐵6. 5mg， EDTA鈉鹽(EDTA 二鈉)76. 6mg，6_芐基腺嘌呤25mg，4_氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸55mg和蔗糖 12000mg ；
按照上述液體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為4. 5，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、120°C條件下滅菌40min，滅菌后得到液體培養基；
步驟c 取冬凌草的根莖外皮消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于15件下培養36 ；
步驟d 將步驟c得到的愈傷組織取出，轉入步驟b制備的液體培養基中，置于震蕩培養箱內，在15°C條件下繼續培養觀天；
步驟e 將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于索氏提取器中，用乙醚回流提取3小時，乙醚的用量為所得愈傷組織重量的15倍，提取后除去乙醚，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。實施例8 與實施例5基本相同，不同之處在于
步驟a 固體培養基的制備同實施例4中固體培養基的制備相同； 步驟b:液體培養基的制備
液體培養基的組成成分為硫酸鎂220mg，磷酸二氫鉀170mg、磷酸二氫鈉130mg，硝酸鉀3500mg，硝酸銨3850mg，氯化鈣680mg，硫胺0. 15mg,肌醇160mg，硼酸16mg，硫酸錳39mg， 硫酸鋅2;3mg，鉬酸鈉0. 0525mg,硫酸銅0. 045mg,氯化鈷0. 045mg,碘化鉀0. 045mg,硫酸亞鐵45mg，EDTA鐵鹽(乙二胺四乙酸鐵銨)53. 5mg，6_芐基腺嘌呤5mg，萘乙酸3. Ommg、萘甲酸 5. Omg,吡哆醇 0. 15mg，煙酸 1. 5mg 和蔗糖 12000mg ；
按照上述液體培養基的各組成成分的含量逐一稱取，將除蔗糖以外的其它培養基成分用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂加入配制的溶液中進行溶化，并加入水稀釋到lOOOmL，調節溶液的pH值為5. 6，然后將調節后所得溶液進行分裝，分裝后分別在98 kPa、122°C條件下滅菌30min，滅菌后得到液體培養基；
步驟c:取冬凌草的嫩芽消毒后接種于步驟a制備的固體培養基上，于25°C條件下培養 20天;
步驟d 將步驟c得到的愈傷組織取出，轉入步驟b制備的液體培養基中，置于震蕩培養箱內，在20°C條件下繼續培養22天；
步驟e 將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于索氏提取器中，用乙酸甲酯回流提取2 小時，甲醇的用量為所得愈傷組織重量的15倍，提取后除去乙酸甲酯，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。實施例9 與實施例5基本相同，不同之處在于 步驟d 置于搖床內，在25°C條件下繼續培養18天；
步驟e 將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于圓底燒瓶中，用無水乙醇浸泡提取12 小時，無水乙醇的用量為所得愈傷組織重量的20倍。實施例10 與實施例5基本相同，不同之處在于 步驟d 置于生物反應器內，在22°C條件下繼續培養18天；
步驟e 將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于圓底燒瓶中，用苯甲醚浸泡提取36小時，苯甲醚的用量為所得愈傷組織重量的20倍。
權利要求
1.一種冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步驟a、固體培養基的制備以1升固體培養基為基準，固體培養基的組成成分中含有硫酸鎂160 360 mg，磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉之和70 370mg，硝酸鉀860 4250mg， 硝酸銨725 4650mg，氯化鈣180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸 1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸鋅 2. 1 32. 3mg，鉬酸鈉 0. 0125 0. 0725mg，硫酸銅0. 0125 0. 0725mg，氯化鈷0. 0125 0. 0725mg，碘化鉀0. 0215 2. 65mg，硫酸亞鐵 6. 5 65. 5mg, EDTA 鈉鹽 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 鐵鹽 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一種或任兩種0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一種或任兩種或任三種0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，瓊脂 4500 33000mg ；按照上述1升固體培養基組成中各成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂，加入配制的溶液中進行溶化，調節溶液的PH值為4. 5 7. 0，然后將調節后所得溶液進行分裝，經滅菌后得到固體培養基；b、取冬凌草的葉片、葉芽或根莖外皮消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于 15 30°C條件下培養12 56天，培養后得到愈傷組織；c、將步驟b得到的愈傷組織置于索氏提取器或圓底燒瓶中，用有機溶劑回流提取2 6小時或浸泡提取6 48小時，提取后除去有機溶劑，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。
2.根據權利要求1所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟a中所述固體培養基的組成成分中還含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和煙酸0. 025 2. 5mg。
3.根據權利要求1所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟a中所述 EDTA鈉鹽為EDTA 二鈉Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA鐵鹽為乙二胺四乙酸鐵銨。
4.根據權利要求1所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟a中所述滅菌是在98 kPa、120°C 125°C條件下，滅菌20 40 min。
5.根據權利要求1所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟c中所述有機溶劑為醇類有機物、醚類有機物或酯類有機物；所述醇類有機物為甲醇、質量濃度為95%的乙醇或無水乙醇，醇類有機物的用量為所得愈傷組織重量的10 20倍；所述醚類有機物為乙醚、苯甲醚、二氧六環、四氫呋喃或環氧丙烷；醚類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍；所述酯類有機物為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍。
6.一種冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步驟a、固體培養基的制備以1升固體培養基為基準，固體培養基的組成成分中含有硫酸鎂160 360 mg，磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉之和70 370mg，硝酸鉀860 4250mg， 硝酸銨725 4650mg，氯化鈣180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸.1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸鋅 2. 1 32. 3mg，鉬酸鈉 0. 0125 0. 0725mg，硫酸銅0. 0125 0. 0725mg，氯化鈷0. 0125 0. 0725mg，碘化鉀0. 0215 2. 65mg，硫酸亞鐵 6. 5 65. 5mg, EDTA 鈉鹽 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 鐵鹽 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一種或任兩種0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一種或任兩種或任三種0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，瓊脂 4500 33000mg ；按照上述1升固體培養基組成中各成分的含量逐一稱取，將除蔗糖、瓊脂以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖和瓊脂，加入配制的溶液中進行溶化，調節溶液的PH值為4. 5 7. 0，然后將調節后所得溶液進行分裝，經滅菌后得到固體培養基；b、液體培養基的制備以1升液體培養基為基準，液體培養基的組成成分中含有硫酸鎂160 689 mg，磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉之和70 350mg，硝酸鉀860 4200mg， 硝酸銨725 4600mg，氯化鈣180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸.1.6 25. 8mg,硫酸猛 3. 9 62. 5mg,硫酸鋅 2. 1 32. 2mg,鉬酸鈉 0. 0125 0. 0725mg, 硫酸銅 0. 0125 0. 0725mg，氯化鈷 .0. 0125 0. 0725 mg，碘化鉀 0. 0215 2. 65 mg，硫酸亞鐵 6. 5 65. 5mg, EDTA 鈉鹽 9. 8 76. 4mg 或 EDTA 鐵鹽 21. 5 86mg, 2，4-D,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤和6-糠氨基腺嘌呤中的任一種或任兩種0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一種或任兩種或任三種0. 1 50mg，蔗糖 12000 60000mg ；按照上述1升液體培養基組成中各成分的含量逐一稱取，將除蔗糖以外的其它培養基成分，用蒸餾水充分溶解得到溶液，然后將稱取的蔗糖加入配制的溶液中進行溶化，調節溶液的PH值為4. 5 7. 0，將調節后所得溶液進行分裝，經滅菌后得到液體培養基；c、取冬凌草的葉片、葉芽或根莖外皮消毒后接種于步驟a制備的固體培養基中，于 15 32°C條件下培養12 36天，培養后得到愈傷組織；d、將步驟c得到的愈傷組織取出，轉入步驟b制備的液體培養基中，置于震蕩培養箱或搖床或生物反應器內，在15 32°C條件下繼續培養18 32天，培養后將愈傷組織和培養液過濾分離；e、將步驟d經分離后得到的愈傷組織置于索氏提取器或圓底燒瓶中，用有機溶劑回流提取2 6小時或浸泡提取6 48小時，提取后除去有機溶劑，最后得到產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。
7.根據權利要求6所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟a中所述固體培養基的成分中還含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和煙酸0. 025 2. 5mg ；步驟b中所述液體培養基的成分中還含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和煙酸0. 025 .2.5mg。
8.根據權利要求6所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟a中所述EDTA鈉鹽為EDTA 二鈉Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA鐵鹽為乙二胺四乙酸鐵銨；步驟b中所述EDTA鈉鹽為EDTA 二鈉Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA鐵鹽為乙二胺四乙酸鐵銨。
9.根據權利要求6所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于 步驟a中所述滅菌是在98 kPa、120°C 125°C條件下，滅菌20 40 min ； 步驟b中所述滅菌是在98 kPa、120°C 125°C條件下，滅菌20 40 min。
10.根據權利要求6所述的冬凌草素的生物轉化合成方法，其特征在于步驟c中所述有機溶劑為醇類有機物、醚類有機物或酯類有機物；所述醇類有機物為甲醇、質量濃度為95%的乙醇或無水乙醇，醇類有機物的用量為所得愈傷組織重量的10 20倍；所述醚類有機物為乙醚、苯甲醚、二氧六環、四氫呋喃或環氧丙烷；醚類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍；所述酯類有機物為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯類有機物的用量為所得愈傷組織重量的5 30倍。
全文摘要
本發明公開了一種冬凌草素的生物轉化合成方法，該合成方法首先制備固體培養基、液體培養基，然后將冬凌草的葉片、葉芽或根莖外皮消毒后接種于制備的固體培養基中進行培養，培養后將得到的愈傷組織轉入液體培養基中繼續培養，經過液體培養基培養后的愈傷組織采用有機溶劑進行提取，提取后除去有機溶劑，得到本發明產品冬凌草素即貝殼杉烯型二萜類化合物。采用本發明技術方案培養制備冬凌草素，不受自然資源的限制，并且有利于保護生態環境。本發明技術方案易于工業化生產，培養時間較短，產物收率較高，生產成本降低，具有顯著的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12P17/18GK102242163SQ201110109399
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者劉冰, 吳鳴建, 沈國鵬, 趙天增, 馬川 申請人:鄭州大學