P150^SAL2啟動子-熒光素酶真核表達載體及其制備方法

專利名稱：P150^SAL2啟動子-熒光素酶真核表達載體及其制備方法
P150SAL2啟動子-熒光素酶真核表達載體及其制備方法本發明涉及一種藥物技術領域的載體及其制備方法，具體是一種P15012啟動子-熒光素酶真核表達載體及其制備方法。
背景技術：
pl50Sa12屬于遺傳與胚胎發育相關的多鋅指同源異型轉錄因子(multi-zinc finger homeotic transcription factor)，屬于一組在哺乳動物中與果蠅Spalt直向同源 (orthologs)的Sal蛋白，在遺傳發育中起重要作用。在果蠅中，Spalt決定特定胚胎區域的細胞命運。Spalt在進化中非常保守，在線蟲，斑馬魚，蟾蜍，雞，小鼠和人中都發現有其直向同源的Sal基因。在人類遺傳中，這組同源基因又被稱作MlL(Sal-Like)基因，目前共有&ilLl-&ilL4四個功能基因，pl50Sa12又稱&ilL2。其中SalLl和SalL4基因突變都會造成人類遺傳性發育缺陷，基因敲除小鼠也有發育缺陷。但現有的&12基因敲除小鼠沒有明顯的發育缺陷，這可能是基因敲除不完全的原因，也可能是Sal2在進化中獲得了發育以外的功能，包括抑制腫瘤形成的功能。但pl50Sa12同時可能是新的抑癌基因。人類多瘤病毒SV40T抗原靶向結合宿主抑癌蛋白使之失活，從而避免細胞過早凋亡并促進細胞分裂，以利病毒復制。我們發現多鋅指轉錄因子pl50Sal2(Sa12，Sall2)是多瘤病毒T抗原的結合靶蛋白，也是宿主細胞抑制病毒復制與腫瘤生成的重要調節蛋白。小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus)是與SV40，HPV同類的小型DNA致腫瘤病毒。DNA腫瘤病毒(DNA Tumor Virus)的致癌蛋白的功能在于依靠靶向結合與修飾來改變宿主靶點蛋白的功能與活性。這些宿主的靶點蛋白通常在調節細胞的復制和生存過程中起著關鍵的作用，其中包括許多著名的腫瘤抑制基因(如Rb，p53)和前癌基因(如c-src)。自發腫瘤形成過程中的基因突變與細胞代謝改變常常與病毒誘發腫瘤的基因改變與代謝改變十分相似，例如抑癌基因P53突變也是自發腫瘤的重要原因之一，并且p53就是首先作為SV40大T抗原的結合靶蛋白被發現的。多瘤病毒大T抗原靶向結合并滅活pl50Sa12的功能是我們通過在腫瘤細胞與正常細胞中宿主范圍對比篩選宿主蛋白結合缺陷型病毒發現的[8]。由此選出的失去P150Sa12結合功能的缺陷型病毒不能在正常宿主細胞中復制并產生腫瘤，卻可以在“2調節通道缺陷的腫瘤細胞中生長復制。由于Sal2在多瘤病毒侵染傳播途徑中的重要組織肺和腎中都有大量的表達，因而多瘤病毒有可能在進化中發展出對％2靶向滅活的功能以利病毒在這些組織中的復制并造成腫瘤。pl50Sa12的下游靶基因是揭示Sal2抑癌調控機制的重要環節。在某些情況下獨立激活P53的靶基因p21的轉錄后，目前我們在研究中也發現Sal2對抑癌基因pl6INMa的表達有誘導作用。這些下游靶基因的發現使得Pl50sa12成為了相關信號通路上一個至關重要的節點基因，因此我們準備將其作為藥物篩選的一個靶標。基于靶標的篩選應用比較廣泛，作為藥物篩選靶標的可以是某種酶，細胞表面或細胞內某種受體等，這類方法的靶標唯一，而以啟動子作為篩選靶標，建立啟動子-報告基因系統來表征啟動子活性強弱，由于啟動子的活性受多種因子影響，所以可擴大篩選范圍提高篩選效率，Pl50sa12基因作為細胞信號網絡中的節點基因，在許多腫瘤細胞中表達異常，其啟動子的活性直接影響該基因的表達量。 因此，我們構建Pl50sa12啟動子與熒光素酶作為報告基因的重組質粒，可以通過瞬時轉染腫瘤細胞的方式，體外加入化合物，測量化合物對于熒光素酶的影響，從而間接反映檢測化合物對于pl50Sa12的影響。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種P150i2啟動子-熒光素酶真核表達載體及其制備方法。本發明能夠有效、準確、靈敏、方便和快捷發現具有腫瘤抑制潛力的化合物。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種Ρ150Μ 2啟動子-熒光素酶真核表達載體，命名為 pl50Sal2-luciferase 表達載體，其中 pl50Sal2_luciferase 片段全長 2278bp，其中 32 2313 之間為 pl50Sal2promoter,2348 4000 為 Iuciferase 閱讀框。本發明還涉及這種Ρ150Μ 2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，包括如下步驟A、設計引物根據pl50Sa12啟動子序列設計引物，引物序列如下Fl 5’ CGCCATGGAAGCTTGTGGGGGAAGTGGAGGGCCAGGTGG-3’Rl :5’ GGCCATGGCTCGAGGTGGTTTCAGCTCCCCCACCCACTG-3，B、目的片段的克隆以 NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast)細胞 DNA 為模板，巢氏進行PCR梯度擴增C、擴增產物純化PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約2. 4kb的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；D、制備pl50Sa12啟動子熒光素酶(Iuciferase)真核表達載體D-1、PCR 產物、PGL3 載體 Xhol+Hindlll 雙酶切，純化；D-2、連接回收的pl50Sa12啟動子的片段和線性的載體用T4連接酶進行體外連接反應；D-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1-ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；D-4、將茵落放大培養，純化提取質粒；D-5、利用PvuII+Hindlll雙酶切，挑取片段為1. 9Kb+5. Ikb的克隆，為插入
Pl50sa12啟動子的重組質粒，測序。步驟A中所述的設計引物從人類NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast)細胞 DNA中通過PCR的方法用Taq酶克隆得到pl50Sa12啟動子，然后經過Biol+Hindlll雙酶切將啟動子切為粘性末端，插入PGL3真核表達載體，構建重組的pl50Sal2-lUciferase真核表達載體。步驟B中所述的進行PCR梯度擴增是指采用熱啟動兩步法進行PCR和采用熱啟動兩步法進行PCR，其中采用熱啟動兩步法進行PCR VX NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast) DNA (0. 7 μ g-μ L)力牛莫片反，±游引物為Fl下游引物為R1，進行PCR，其中PCR 反應體系(50 μ L)模板 HOSE DNAl μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ 1， 2XGC-rich PCRbuffer 22. 5 μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，ddH2015. 5 μ 1，Taq 聚合酶 (5U- μ L) 1 μ 10PCR 反應條件:98°C變性，5min ；加入 Taq 酶；95°C變性，5min ；1 循環；94°C，lmin ； 梯度溫度(55 70°C ) °C,5min ；35循環；72°C延伸lOmin，1循環；10°C，Hold。檢測方法 Ikb Marker 5 μ L，樣品上樣量為5 μ L，IlOV恒壓，30min于1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用熱啟動兩步法進行PCR以第一步結果中的2樣品為模版，上游引物為F2下游引物為R2，進行PCR，其中PCR 反應體系(50 μ L)模板 DNAl μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ 1，2XGC_rich PCR buffer22. 5 μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，ddH2015. 5 μ 1，Taq 聚合酶(5U- μ L) 1 μ 1。PCR 反應條件:98°C變性，5min ；加入 Taq 酶；95°C變性，5min ；1 循環；94°C，lmin ； 梯度溫度(55 70°C ) °C,5min ；35循環；72°C延伸lOmin，1循環；10°C，Hold。檢測方法 Ikb Marker 5 μ L，樣品上樣量為5 μ L，IlOV恒壓，30min于1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。步驟D-I中所述的純化化的方法是PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約2. 41Λ的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；步驟D-2中所述的連接方法是在反應體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段2μ 1，10倍緩沖液2μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應lh，PEG40001 μ 1。步驟D-3中所述的轉化大腸桿菌的方法如下①取連接產物IOul加到50ul的感受態細胞中，輕輕搖勻，冰浴30min。②42°C熱激90s，快速轉到冰浴2_;3min，注意不要搖動管。③向管中加入500ul 的 LB 培養基，150rmp，37°C，45min。④將茵液全部涂到LB平板上，含lOOug-mlAmp。⑤將平板正置直至液體全部吸收。⑥倒置平板，于37°C培養12 16h。步驟D-4中所述篩選重組真核表達載體陽性克隆的方法如下a.挑取轉化后的單茵落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100 μ g-ml)的LB培養基中，37°C，150rpm，搖床培養 12 16hr。b.取l_1.5ml培養物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余茵液4°C保存。c.將細胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100μ 1冰預冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩， 使細菌懸浮均勻。d.細菌重懸液中加入200 μ 1堿裂解液II，上下翻轉離心管5次，使茵體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰預冷的堿裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉移至另一個離心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm離心2min,取300 μ 1上清于新離心管中。g.用2 2. 5體積的乙醇(750 μ 1)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部)。i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在。j.加50 μ ITE緩沖液(含20 μ g-ml RNase Α)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存于_20°C。步驟D-5中所述的酶切鑒定和測序的方法如下①在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內切酶 PvuIIl μ 1 和 HindIII 1μ 1，去離子水 13 μ 1，37°C反應 2h ；②經瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pl50Sal2-lUCiferaSe的目的條帶，酶切后可切出約1.91Λ和5. Ikb的兩個片段，與預期相符，表明目的片段已正確的插入載體中。本發明Ρ150Μ 2的下游靶基因是進一步研究&ι12抑癌調控機制的重要環節。&ι12 可在某些情況下獨立激活P53的靶基因p21的轉錄后，目前&ι12對抑癌基因pl6INMa的表達有誘導作用。這些下游靶基因的發現使得Ρ150Μ 2成為了相關信號通路上一個至關重要的節點基因，因此將其作為藥物篩選的一個靶標。基于靶標的篩選應用比較廣泛，作為藥物篩選靶標的可以是某種酶，細胞表面或細胞內某種受體等，這類方法的靶標唯一，而以啟動子作為篩選靶標，建立啟動子-報告基因系統來表征啟動子活性強弱，由于啟動子的活性受多種因子影響，所以可擴大篩選范圍提高篩選效率，P150SAL2基因作為細胞信號網絡中的節點基因，在許多腫瘤細胞中表達異常，其啟動子的活性直接影響該基因的表達量。因此，構建Ρ150Μ 2啟動子與熒光素酶作為報告基因的重組質粒，可以通過瞬時轉染腫瘤細胞的方式，體外加入化合物，測量化合物對于熒光素酶的影響，從而間接反映檢測化合物對于 P150SAL2的影響。


圖lpl50Sa12啟動子-熒光素酶質粒插入酶切位點。圖2pl50Sa12 P2啟動子-熒光素酶質粒圖譜。圖3pl50Sa12 P2啟動子-熒光素酶質粒在3T3、P19以及四3細胞中的活性。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例
P150SAL2啟動子的克隆及鑒定本實施例P150SAL2_luciferase 表達載體，其中 P150SAL2_luciferase 片段全長 2278bp，其中 32 2313 之間為 P150SAL2promoter, 2348 4000 為 Iuciferase 閱讀框。本實施例Ρ150Μ 2-1ι ( ·erase表達載體的構建方法，包括設計引物從人類 NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast)細胞 DNA 通過 PCR 的方法用 Taq 酶在 GC-rich 緩沖體系中克隆得到P150SAL2啟動子，PCR產物經過^(hol+mndlll雙酶切將啟動子消化，插入到缺失啟動子的真核表達載體PGL3上，構建為重組的P150SAL2-lUCiferase真核表達載體。本實施例所述的構建方法包括如下步驟A、根據P150SAL2啟動子序列設計引物；所述的引物，其序列如下Fl :5’ CGCCATGGAAGCTTGTGGGGGAAGTGGAGGGCCAGGTGG-3，Rl :5’ GGCCATGGCTCGAGGTGGTTTCAGCTCCCCCACCCACTG-3，B、以 NHF (Normal Human Foreskin Fibroblast)細胞 DNA 為模板，進行目的片段的克隆；所述的進行目的片段的克隆，以人類基因組為模板，巢氏進行PCR梯度擴增采用熱啟動兩步法以NHF細胞DNA (0. 7 μ g/ μ L)為模版，上游引物為F1下游引物為R1，進行PCR。PCR反應體系(50 μ L)模板NHF DNAl μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ 1，2 X GC-richPCR buffer 22. 5 μ 1, dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，ddH2015. 5 μ 1，Taq 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ 1。 所述的PCR反應條件98 °C變性，5min ；加入Taq酶；95 °C變性，5min ； 1循環； 94°C，lmin ；梯度溫度(55 70°C )°C，5min ；；35 循環；72°C延伸 lOmin，1 循環；10°C，Hold。 檢測方法=Ikb Marker 5 μ L，樣品上樣量為5 μ L，110V恒壓，30min于1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。C、PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約2. 2kb的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；所述的用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化，包括步驟如下C-I、從瓊脂糖凝膠中將PCR產物DNA條帶切下，轉入離心管中，加入2倍體積的結合緩沖液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；C-2、將離心管中溶解的凝膠溶液轉移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉/分鐘離心2分鐘；C-3、向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液后，13000轉/分鐘離心 2分鐘，室溫放置5分鐘；C-4、將DNA吸附柱加入一個新的離心管中，加入65°C預熱的洗脫緩沖液70 μ 1， 13000轉/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產物DNA片段。D. P150SAL2啟動子Iuciferase重組質粒的構建D-I、PCR 產物純化D-2、PCR產物、PGL3載體Biol+Hindlll雙酶切，酶切后的載體片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；D-3、用回收的Ρ150Μ 2啟動子片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應；D-4、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；D-5酶切鑒定PvuII+Hindlll雙酶切，挑取片段為1. 9Kb+5. Ikb的克隆，測序。其中步驟D-I所述的純化，其方法是PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約2. 4kb的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；步驟D-3所述的連接，其方法是在反應體系中加入回收的PCR產物DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩沖液 2μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水6μ l，PEG40001 y 1，16°C反應lh。步驟F-2所述的連接方法是在反應體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，T4DNA 連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應lh，PEG40001 y L·步驟D-4所述的轉化大腸桿菌，其方法是a.取連接產物IOul加到50ul的感受態細胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.b. 42°C熱激90s，快速轉到冰浴2-aiiin，注意不要搖動管。c.向管中加入 500ul 的 LB 培養基，150rmp, 37°C，45min.d.將茵液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.e.將平板正置直至液體全部吸收。f.倒置平板，于37°C培養12 16h.步驟D-5所述的酶切鑒定，其方法是在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內切酶HindIIIl μ 1和PvuII 1μ 1，去離子水13 μ 1，37°C反應濁；經瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定P150SAL2-luciferase的目的條帶，酶切后可切出約1. 3kb和4. Skb的兩個片段，與預期相符，表明目的片段已正確的插入載體中；否則，反向插入為6. Ikb單條帶，沒有插入為 4. 8kb單條帶。步驟D-5所述的克隆，其方法是a.挑取轉化后的單茵落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB培養基中，37°C，150rpm，搖床培養 12 16hr。b.取l-1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余茵液4°C保存。c.將細胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100μ 1冰預冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩， 使細菌懸浮均勻。d.細菌重懸液中加入200 μ 1堿裂解液II，上下翻轉離心管5次，使茵體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰預冷的堿裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 ;3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉移至另一個離心管中。
f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm 離心2min,取300 μ 1上清于新離心管中。g.用2 2. 5體積的乙醇(750 μ 1)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部)。i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在。j.加50 μ 1 TE緩沖液(含20yg/ml RNase Α)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存于_20°C。本實施例P150SAL2_luciferase質粒在3T3、P19以及四3細胞中的活性使用LipofectAMINE 2000 (Life Technologies, Inc.)脂質體轉染，質粒 P150SAL2promoter-reporter 為 1 μ g，0. 2 μ g CMV- β -gal 作為內參。12 孔板細胞量為 1 X 105,48h后收獲細胞，測量熒光以及p-gal。
權利要求
1.一種Ρ150Μ 2啟動子-熒光素酶真核表達載體，其特征在于命名為 pl50Sal2-luciferase 表達載體，其中 pl50Sal2_luciferase 片段全長 2278bp，其中 32 2313 之間為 pl50Sal2promoter,2348 4000 為 Iuciferase 閱讀框。
2.—種Ρ150Μ 2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，包括如下步驟A、設計引物根據pl50Sa12啟動子序列設計引物，引物序列如下 Fl :5’ CGCCATGGAAGCTTGTGGGGGAAGTGGAGGGCCAGGTGG-3’Rl 5' GGCCATGGCTCGAGGTGGTTTCAGCTCCCCCACCCACTG-3，B、目的片段的克隆以NHF細胞DNA為模板，巢氏進行PCR梯度擴增C、擴增產物純化PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約2.4kb的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；D、制備pl50Sa12啟動子熒光素酶真核表達載體 D-1、PCR產物、PGL3載體Xhol+Hindlll雙酶切，純化；D-2、連接回收的pl50Sa12啟動子的片段和線性的載體用T4連接酶進行體外連接反應；D-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐霉素 100 μ 1-ml的LB培養基上37°C培養12-16小時； D-4、將茵落放大培養，純化提取質粒；D-5、利用PvuII+HindHI雙酶切，挑取片段為1. 9Kb+5. Ikb的克隆，為插入pl50Sa12啟動子的重組質粒，測序。
3.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟A中所述的設計引物從人類NHF細胞DNA中通過PCR的方法用Taq酶克隆得到 pl50Sa12啟動子，然后經過^(hol+Hindlll雙酶切將啟動子切為粘性末端，插入PGL3真核表達載體，構建重組的pl50Sal2-luCiferase真核表達載體。
4.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟B中所述的進行PCR梯度擴增是指采用熱啟動兩步法進行PCR和采用熱啟動兩步法進行PCR，其中采用熱啟動兩步法進行PCR 以NHF0. 7 μ g- μ L細胞DNA為模版，上游引物為Fl下游引物為R1，進行PCR ；采用熱啟動兩步法進行PCR，以第一步結果中的2樣品為模版，上游引物為F2下游引物為R2，進行PCR。
5.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟D-I中所述的純化化的方法是PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約2. 4kb的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化。
6.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟D-2中所述的連接方法是在反應體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段 2μ 1，10 倍緩沖液 2μ 1，T4DNA 連接酶 1μ 1，去離子水 7μ 1，16°C反應 lh，PEG40001 μ 1。
7.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟D-3中所述的轉化大腸桿菌的方法如下①取連接產物IOul加到50ul的感受態細胞中，輕輕搖勻，冰浴30min；②42°C熱激90s，快速轉到冰浴2-aiiin，注意不要搖動管；③向管中加入500ul的LB培養基，150rmp，37°C，45min；④將茵液全部涂到LB平板上，含100ug-mlAmp⑤將平板正置直至液體全部吸收；⑥倒置平板，于37°C培養12 16h。
8.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟D-4中所述篩選重組真核表達載體陽性克隆的方法如下a.挑取轉化后的單茵落，接種到2ml含有100μ g-ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C， 150rpm，搖床培養12 16hr ；b.取1-1.5mi培養物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余茵液4°C保存；c.將細胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于ΙΟΟμ1冰預冷的堿裂解液I中，漩渦震蕩，使細菌懸浮均勻；d.細菌重懸液中加入200μ1堿裂解液II，上下翻轉離心管5次，使茵體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上< 5min ；e.加入150μ1冰預冷的堿裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1 :3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400μ 1 的上清轉移至另一個離心管中。f.加400μIV V = 1 1的酚氯仿，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm離心 2min，取300 μ 1上清于新離心管中；g.用2 2.5體積的750 μ 1乙醇室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置anin ； 13000rpm 離心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉淀；把上清倒掉，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出；i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在；j.加50 μ ITE緩沖液于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存于_20°C。
9.根據權利要求2所述的P150sal2啟動子-熒光素酶真核表達載體的制備方法，其特征是，步驟D-5中所述的酶切鑒定和測序的方法如下①在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，限制性內切酶 PvuIIl μ 1 和 HindIII 1 μ 1，去離子水 13 μ 1，37°C反應 2h ；②經瓊脂糖凝膠電泳分離后鑒定pl50Sal2-lUciferase的目的條帶，酶切后可切出約1.91Λ和5. Ikb的兩個片段，與預期相符，表明目的片段已正確的插入載體中。
全文摘要
本發明是一種P150SAL2啟動子-熒光素酶真核表達載體及其制備方法。載體命名為p150Sal2-Luciferase表達載體，其中p150Sal2-luciferase片段全長2278bp，其中32～2313之間為p150Sal2promoter，2348～4000為luciferase閱讀框。制備方法包括設計引物，目的片段的克隆，擴增產物純化，制備p150Sal2啟動子熒光素酶真核表達載體。本發明能夠有效、準確、靈敏、方便和快捷發現具有腫瘤抑制潛力的化合物。
文檔編號C12N15/66GK102206669SQ20111010779
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月28日 優先權日2011年4月28日
發明者D·柯伊拉臘, 施麗丹, 李大偉, 武正華, 藺劍 申請人:上海交通大學