專利名稱：用骨髓組織塊分離及培養禽類骨髓間充質干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及干細胞的分離培養技術，具體地說，涉及一種利用骨髓組織塊分離及 培養禽類骨髓間充質干細胞的方法。
背景技術：
骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSC)是一群具有多向分化 潛能的干細胞，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成肌細胞、神經細胞和心肌細胞 等等。這一特性使得BMSC成為理想的種子細胞應用于組織工程中，在細胞工程、基因治療 及器官移植等領域具有重要意義。BMSC具有單個貼壁生長形成克隆，成為集落形成成纖維 樣細胞(colony-forming fibroblastic units, CFU-F)。CFU-F 成為鑒定骨髓間充質干細 胞的手段之一。體外BMSC呈梭形，表達CD44、⑶73、⑶29、⑶106、⑶105、CD90等，不表達 ⑶；34、⑶45和⑶14等，由于尚未發現BMSC的特異性標記分子，⑶44+、⑶45\⑶73+、⑶四+、 ⑶106+、⑶105+、⑶90+，可用來間接對骨髓間充質干細胞進行表型鑒定。目前，人和嚙齒動物的BMSC的體外分離培養及分化潛能的研究較為廣泛，主要方 法為密度梯度離心法、貼壁篩選法和免疫分離法。密度梯度離心法根據不同細胞密度不同 原理利用Percoll分離液將BMSC分離出來，方法簡單，但BMSC獲得率較低。貼壁篩選法一 般將骨髓吹打為單細胞懸浮液，進行全血細胞貼壁4-12小時，根據不同細胞貼壁特性進行 分離得到的BMSC，操作簡單，但細胞均一性較差，細胞的實質是多種類型細胞的混合，抗原 差異性也較大，細胞克隆化能力、繼代培養和擴增能力均較低。免疫分離法可以根據細胞表 面標志進行富集或根據表面負表達抗原進行負分選，能更好的分離純化BMSC，但是對細胞 活性影響較大，費用高，所需樣本量較大。目前，針對禽類BMSC的研究相對較少，主要原因在于禽類的BMSC分離困難，基本 采用上述已有的方法，費用較高同時存在BMSC獲得率和所得細胞分化潛能均較差等缺點。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用骨髓組織塊分離及培養禽類骨髓間充質干細胞的 新方法。為了實現本發明目的，本發明的一種利用骨髓組織塊分離及培養禽類骨髓間充質 干細胞的方法，其是將禽類骨髓碎塊懸浮于胎牛血清中，然后將該血清懸浮液移至培養皿 中，傾斜放置一段時間，去除血清后加入完全培養液貼壁培養，獲得原代培養細胞；經胰蛋 白酶消化后進行傳代，然后以完全培養液培養，傳代2-4次后獲得禽類骨髓間充質干細胞， 在體外培養體系中繼代擴增培養；其中，所述完全培養液為含有10%胎牛血清的低糖DMEM 培養液。前述的方法，所述傾斜放置是培養皿與水平面呈30-60度角。前述的方法，傾斜放置放置的時間為40-60分鐘。前述的方法，去除血清后加入完全培養液貼壁培養的時間為3-6天，優選為3天。
前述的方法，原代培養細胞經胰蛋白酶消化后，以1 2-3的比例傳代，優選為 1 3的比例傳代。 前述的方法，禽類骨髓來自于禽類的股骨和/或肱骨。前述的方法，所述禽類骨髓碎塊為1 2mm3。前述的方法，貼壁培養的密度為0. 5 1骨髓組織碎塊/cm2。前述的方法，繼代擴增培養時細胞接種密度為IX IO5 IX IO6個細胞/cm2。具體地，本發明提供的禽類骨髓間充質干細胞的分離及體外擴增培養方法包括1)原代培養取禽類股骨和肱骨，取出骨髓放入離心管中，用剪刀將骨髓剪碎至 1 2mm3，向離心管中加入500 800 μ 1胎牛血清，移液器緩慢吹打至骨髓組織塊懸浮，移 置到IOOmm培養皿中，將培養皿放入二氧化碳培養箱中，與水平面呈30 60度角傾斜放置 40 60分鐘，將血清去除后加入IOml完全培養液培養3天，獲得原代細胞。完全培養液成 分為低糖 DMEM 培養液(Dulbecco' s modification ofEagle' s medium Dulbecco，改良 Eagle培養基)+10%胎牛血清。2)傳代培養將培養皿中的培養液去除，加入5ml，0. 25%胰蛋白酶消化原代細 胞，顯微鏡下觀察梭形細胞逐漸變圓后去除胰蛋白酶，加入6mlDMEM用移液器吹打細胞后， 平均分至3個培養皿中以完全培養液培養，為Pl代細胞。Pl代細胞培養3天，將培養液去 除，胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察梭形細胞逐漸變圓，將胰蛋白酶吸出，加入DMEM用移液器 吹打，將圓形細胞吹起，吸出，1 3比例以完全培養液傳代培養，獲得P2代細胞，其他雜細 胞繼續貼在培養皿底部(差速消化法)，P2代細胞即為經純化的禽類骨髓間充質干細胞。借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(一 )本發明中禽類骨髓間充質干細胞的分離方法是骨髓組織塊直接貼壁法，而 非以往的細胞密度梯度離心，大大降低了分離細胞時細胞分離液以及離心環境對細胞造成 的化學及機械刺激，減少細胞損傷，由此方法分離的骨髓間充質干細胞具有比較好的增殖 潛能和分化潛力。( 二)本發明中禽類骨髓間充質干細胞的分離方法是骨髓組織塊直接貼壁法，骨 髓間充質干細胞從骨髓組織塊中生長爬出，細胞類型單一；傳統的全骨髓貼壁法是將全骨 髓吹打制成單細胞懸液后進行貼壁培養，貼壁細胞中包括大量雜細胞。采用本發明方法獲 得的骨髓間充質干細胞較純，簡化了后期純化過程，提高純化效率。(三)本發明中骨髓組織塊貼壁培養過程中培養皿采用傾斜靜置法，使得例如紅 細胞等未貼壁的細胞可隨血清流動至培養皿邊緣，待去除血清時隨之將大部分雜細胞剔 除，由此方法分離的骨髓間充質干細胞純度較高，且純化過程相對較短，骨髓間充質干細胞 活力較強。(四)本發明獲得的骨髓間充質干細胞能夠在體外生長并穩定傳代，具有典型的 梭形形態，生長速度快，本發明所述方法簡單易行，可操作性強，適合應用于組織工程學和 基因治療領域。
圖1為本發明方法獲得的骨髓間充質干細胞形態學觀察結果。圖2A和圖2B分別為本發明方法獲得的骨髓間充質干細胞的抗體檢測以及RT-PCR檢測結果。圖3為本發明方法獲得的骨髓間充質干細胞的成集落能力(CFU-F)檢測結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1雞骨髓間充質干細胞分離培養(1)雞骨髓間充質干細胞的分離和原代培養取5日齡白來航雞股骨和肱骨，去兩端骨骺，用骨剪將骨剪開，取出骨髓放入5ml 離心管中，用手術剪剪碎至l_2mm3，加入800 μ 1胎牛血清，用移液器緩慢吹打使得骨髓碎塊 懸浮，移置到IOOmm培養皿中，用移液器整理使得骨髓碎塊在培養皿中均勻分布，將培養皿 放入二氧化碳培養箱，37 0C，90%濕度，5% CO2，傾斜60度角放置60分鐘后，將培養皿取出， 吸凈培養皿中的血清，緩慢加入完全培養液(含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養液)，培 養3天，得到雞骨髓間充質干細胞原代(Ρ0代)細胞。(2)雞骨髓間充質干細胞的傳代培養取雞骨髓間充質干細胞原代細胞，倒掉其中培養液，PBS清洗2遍，加入0. 25%胰 蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞由梭形逐漸變成圓形時，將胰蛋白酶倒掉，向培養皿中緩慢 加入6ml DMEM吹打，使得培養皿中的骨髓間充質干細胞懸浮，其它雜細胞則繼續留在培養 皿底部(差速消化法)，將DMEM懸液平均加入3個IOOmm培養皿中，再向每個培養皿中加入 7ml DMEM和Iml胎牛血清，培養3天，重復同樣方法傳代，可得到純化的雞骨髓間充質干細 胞。(3)骨髓間充質細胞的鑒定雞骨髓間充質干細胞的形態學觀察雞骨髓間充質干細胞原代培養3天后，顯微 鏡XlOO下觀察細胞，骨髓碎塊周圍已爬出大量梭形細胞緊密排列，隨著細胞的傳代，細胞 逐漸以平行或放射狀排列，呈梭形或星形。如圖1所示，PO代(原代)細胞呈短梭形，從骨 髓組織塊(黑色實心塊狀物)中爬出；P2代細胞貼壁分裂增殖；P3代細胞逐漸形成平行狀 排列，P4代細胞呈梭形，細胞形態較好。雞骨髓間充質干細胞表面抗原單克隆抗體鑒定取P3代細胞接種于96孔培養板， 培養M小時，PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛50ul，4°C固定30分鐘，去除固定液，PBS清洗 3遍，加入抗體染液50ul和濃度為50ng/ml的hoestch33342 5ul，避光4°C染色1小時。棄 去染色，PBS清洗3遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察，CD44、CD45激發波長550nm，hoestch33342 激發波長360nm。抗體檢測結果如圖2A所示，⑶44呈陽性，⑶45呈陰性。雞骨髓間充質干細胞RT-PCR檢測利用TRIZOL方法提取骨髓和分離P3代細 胞的總 RNA，取 3yg 總 RNA 使用反轉錄試劑盒 PrimeScriptlst Strand cDNA Synthesis Kit (Takara 公司)合成 cDNA。以 cDNA 為模板，力Π 入 GAPDH(上游5，-CTGAGAACGGGAAACTTGTG-3，，下游 5，-CCACAACATACTCAGCACCTG-3，，105bp)、CD106 (上游5，-TCCTATCATTGAGACCAGTG-3，，下 游5，-TTTGTGCTGACATCTCCTTC-3，，159bp)、CD73 (上游5，-GGCATCGTTGGCTACACTAC-3，， 下 游5‘ -ATGTCCACAGTAAAGCCAGAG-3' , 167bp)、CD29 (上 游 5， -GGAGAAATGTTACACGGCTG-3，，下游5， -GGAGAAATGTTACACGGCTG-3，，163bp)、 CD105(上游5，-GAACCTCCTCATCCACACTG-3，，下游5，-GCTCGCTGTAGGATGTGATG-3，，13lbp)、CD90 (上 游5，-TGCCGCTATGAGAACAAGAC-3，，下游5，-CTCATCGCTGGTGGTGAAG-3，，186bp)弓丨物和 PCRmix (Takara公司)進行擴增反應。反應條件95°C 5min，溫度分別為95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 72°C lOmin，循環數32個。RT-PCR檢測結果如圖2B所示，結果顯示分離細胞表達 CD73、CD29、CD106、CD105、CD90 基因。骨髓間充質干細胞成集落(CFU-F)能力檢測取P3代細胞，按500、1000、1500、 2000,2500個細胞/cm2的密度將細胞接種于6孔板中，加入完全培養液，二氧化碳培養箱 37°C，90%濕度，5% CO2條件下培養，每3天換液一次，20天后可形成集落形態，即為CFU-F 集落。將細胞用4%多聚甲醛固定30min后，0. 結晶紫染色30min，計數。結果如圖3所 示，細胞接種密度分別為500、1000、1500、2000、2500個細胞/cm2，經過20天培養，分別形成 1. 2,1. 8,3. 6,4. 5,6. O個克隆cm2，結果顯示，所分離骨髓間充質干細胞具有增殖和自我更 新并形成克隆的能力。實施例2鴨骨髓間充質干細胞分離培養(1)鴨骨髓間充質干細胞的分離和原代培養取3日齡北京鴨股骨和肱骨，去兩端骨骺，用骨剪將骨剪開，取出骨髓放入5ml離 心管中，用手術剪剪碎至l_2mm3，加入500 μ 1胎牛血清，用移液器緩慢吹打使得骨髓碎塊懸 浮，移置到IOOmm培養皿中，用移液器整理使得骨髓碎塊在培養皿中均勻分布，將培養皿放 入二氧化碳培養箱，37 0C，90%濕度，5% CO2，傾斜45度角放置40分鐘后，將培養皿取出，吸 凈培養皿中的血清，緩慢加入完全培養液(低糖DMEM培養液，10%胎牛血清)，培養3天，得 到鴨骨髓間充質干細胞原代細胞。(2)鴨骨髓間充質干細胞的傳代培養取鴨骨髓間充質干細胞原代細胞，倒掉其中培養液，PBS清洗2遍，加入0. 25%胰 蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞由梭形逐漸變成圓形時，將胰蛋白酶倒掉，向培養皿中緩慢 加入:3ml DMEM吹打，使得培養皿中的骨髓間充質干細胞懸浮，其它雜細胞則繼續留在培養 皿底部(差速消化法)，將DMEM懸液平均加入3個IOOmm培養皿中，再向每個培養皿中加 入7mlDMEM和Iml胎牛血清，培養3天，重復同樣方法傳代，可得到純化的鴨骨髓間充質干 細胞。(3)骨髓間充質細胞的鑒定骨髓間充質干細胞表面抗原抗體鑒定取P4代細胞接種于96孔培養板，培養M 小時，PBS清洗3遍，加入4 %多聚甲醛50 μ 1，4°C固定30分鐘，去除固定液，PBS清洗3遍， 加入抗體染液50 μ 1，避光4°C染色1小時。棄去染色，PBS清洗3遍，在倒置熒光顯微鏡下 觀察，⑶44、⑶45激發波長550nm。抗體檢測結果顯示，⑶44呈陽性，⑶45呈陰性。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種利用骨髓組織塊分離及培養禽類骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，將禽 類骨髓碎塊懸浮于胎牛血清中，然后將該血清懸浮液移至培養皿中，傾斜放置一段時間，去 除血清后加入完全培養液貼壁培養，獲得原代培養細胞；經胰蛋白酶消化后進行傳代，然后 以完全培養液培養，傳代2-4次后獲得禽類骨髓間充質干細胞，在體外培養體系中繼代擴 增培養；其中，所述完全培養液為含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述傾斜放置是培養皿與水平面呈30-60 度角。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，傾斜放置放置的時間為40-60分鐘。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，去除血清后加入完全培養液貼壁培養的 時間為3-6天。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，原代培養細胞經胰蛋白酶消化后，以 1 2-3的比例傳代。
6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，禽類骨髓來自于禽類的股骨和/ 或肱骨。
7.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述禽類骨髓碎塊為1 2mm3。
8.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，貼壁培養的密度為0.5 1骨髓 組織碎塊/cm2。
9.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，繼代擴增培養時細胞接種密度 為1 X IO5 1 X IO6個細胞/cm2。
全文摘要
本發明提供了一種利用骨髓組織塊分離及培養禽類骨髓間充質干細胞的方法。其是采用骨髓組織塊直接貼壁法獲得大量原代骨髓間充質干細胞后，進行體外繼代培養，從而獲得純化的禽類骨髓間充質干細胞。本方法與已有方法相比具有分離時間短，細胞獲得量大且純度較高，細胞體外增殖能力較強等優點，可為禽類間充質干細胞的研究應用及組織工程提供豐富的材料來源。
文檔編號C12N5/0775GK102140440SQ20111010695
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者李想, 連正興, 韓紅兵 申請人:中國農業大學