抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體，其組合物及其用途的制作方法

專利名稱：抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體，其組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及特異性中和破傷風(fēng)毒素的抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其組合物及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
破傷風(fēng)(Tetanus)是一種人畜共患的嚴(yán)重感染疾病，由破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌 (Clostridium tetani)感染引起。在厭氧條件下細(xì)菌于創(chuàng)口生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生大量的毒素， 毒素侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患者全身性肌肉強(qiáng)直性痙攣，形成破傷風(fēng)特有的牙關(guān)禁閉、角弓反張等癥狀，嚴(yán)重者最后會(huì)死于窒息及全身性衰竭。目前，在大部分發(fā)展中國(guó)家破傷風(fēng)仍然是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，每年大約有100萬(wàn)人死于破傷風(fēng)，其中新生兒占死亡總數(shù) 80%。破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌，長(zhǎng)4 8 μ m，寬0. 3 0. 8 μ m，經(jīng)常以相當(dāng)長(zhǎng)的細(xì)絲形式存在，形成芽胞時(shí)，細(xì)菌呈特殊的鼓槌狀，芽胞為卵圓形。破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌為嚴(yán)格厭氧菌， 其芽胞可抗高溫抗干燥，對(duì)大多數(shù)防腐劑由抗性，但對(duì)碘的水溶液及中性戊二醛溶液敏感， 可在短時(shí)間內(nèi)被這些試劑殺滅。破傷風(fēng)梭菌可以產(chǎn)生兩種外毒素一種是具有溶血作用的破傷風(fēng)溶血毒素；另一種是破傷風(fēng)痙攣毒素，即常說的破傷風(fēng)毒素。破傷風(fēng)毒素是由破傷風(fēng)梭狀桿菌產(chǎn)生并分泌至菌體外的一種蛋白質(zhì)，由1315個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為150700Da。破傷風(fēng)毒素的基因存在于一個(gè)75Kb的質(zhì)粒上，編碼基因長(zhǎng)約4Kb。破傷風(fēng)毒素在菌體內(nèi)表達(dá)后是單一的一條蛋白質(zhì)鏈，在分泌過程中被蛋白酶裂解成由二硫鍵鏈接的輕鏈和重鏈。根據(jù)毒素在體內(nèi)的作用，破傷風(fēng)毒素分子分為A、B、 C三個(gè)部分，毒素的輕鏈片段為A片段，重鏈N末端的一半為B片段，另一半為C片段。破傷風(fēng)毒素是已知最毒的毒素之一，經(jīng)純化的破傷風(fēng)毒素對(duì)小鼠的致死劑量為 0. lng/kg，對(duì)豚鼠的致死劑量為0. 3ng/kg,推測(cè)對(duì)人的致死劑量為0. 25ng/kg。它的作用過程一般為結(jié)合、導(dǎo)入和作用三步。研究結(jié)果表明毒素的C片段可以和毒素的受體結(jié)合，毒素的受體一般認(rèn)為是神經(jīng)節(jié)苷脂，毒素的C片段具有逆行軸突運(yùn)輸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，已被用于研究亞單位疫苗；B片段可以在人工磷脂膜上形成離子通道，將毒素的活性片段導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)；毒素的A片段分子是Si蛋白酶，具有蛋白酶活性，它可以裂解神經(jīng)細(xì)胞膜上的傳送神經(jīng)遞質(zhì)的蛋白質(zhì)-囊泡相關(guān)膜蛋白，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使興奮的沖動(dòng)不停傳遞，導(dǎo)致患者產(chǎn)生強(qiáng)直性痙攣的臨床癥狀。然而，從破傷風(fēng)毒素中直接提取和純化C 片段亦有許多弊端破傷風(fēng)毒素毒性高，易形成芽胞進(jìn)行傳播，培養(yǎng)、分離過程復(fù)雜、回收率不高，且具有一定危險(xiǎn)性。破傷風(fēng)類毒素疫苗作為主動(dòng)免疫療法被應(yīng)用于破傷風(fēng)的預(yù)防。破傷風(fēng)類毒素是用破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌菌種在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素，經(jīng)甲醛脫毒、精制并加入氫氧化鋁佐劑后制成的疫苗。類毒素接種過程中雖然消除了培養(yǎng)基成分或多次加強(qiáng)注射等引起的過敏因素，還是有一定的不良反應(yīng)發(fā)生(如類毒素疫苗制品純度不高、致敏性強(qiáng)等)， 臨床上較難推廣。而且類毒素疫苗在我國(guó)是作為計(jì)劃免疫接種的，用量很大，其質(zhì)量尤為重要，這極大限制了類毒素疫苗的應(yīng)用。破傷風(fēng)毒素毒性極強(qiáng)，作用迅速，因此破傷風(fēng)的有效預(yù)防和治療往往需要及時(shí)注射破傷風(fēng)抗毒素(Tetanus antitoxin, TAT)或破傷風(fēng)人血免疫球蛋白(Human tetanus immunoglulin, HTIG)。破傷風(fēng)抗毒素是用破傷風(fēng)梭狀桿菌或類毒素免疫動(dòng)物獲取而制備的免疫血清，該血清具有中和的破傷風(fēng)毒素的能力。目前我國(guó)用于臨床的破傷風(fēng)抗毒素主要為馬血清?？苟舅睾投舅氐闹泻头磻?yīng)只能在毒素處于游離的狀態(tài)下才能發(fā)生，而且用抗毒素預(yù)防或治療破傷風(fēng)其成敗的關(guān)鍵在于時(shí)間。若抗毒素能趕在毒素與易感細(xì)胞或組織結(jié)合之前中和毒素，其治療效果是肯定的。然而，另一方面，破傷風(fēng)毒素抗作為異種蛋白的抗原性畢竟還未完全改變，血清過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)性仍未徹底根除。尤其是我國(guó)有大量人群已使用過破傷風(fēng)抗毒素，再次使用的可能性較大，因此產(chǎn)生血清過敏的風(fēng)險(xiǎn)也更大，臨床應(yīng)用受到一定的限制。關(guān)鍵的是，抗毒素的臨床應(yīng)用效果不確實(shí)，馬血清抗毒素在體內(nèi)的半衰期短，不利于預(yù)防作用。破傷風(fēng)人血免疫球蛋白是采集經(jīng)破傷風(fēng)類毒素免疫的健康獻(xiàn)血者抗體滴度較高的抗毒素血漿制備而成的抗體，屬人源性同種蛋白，較為安全，幾乎不會(huì)發(fā)生血清病與過敏反應(yīng)。而且，該免疫球蛋白半衰期長(zhǎng)，可達(dá)3 4周，大大提升了破傷風(fēng)的防治水平。但由于人血來源困難，價(jià)格昂貴，工業(yè)化生產(chǎn)復(fù)雜，易受病毒污染，使破傷風(fēng)人血免疫球蛋白的應(yīng)用受到了極大地限制。因此，目前主要還是由馬血清破傷風(fēng)抗毒素占領(lǐng)著市場(chǎng)。由此，利用先進(jìn)的技術(shù)，尋找更加高效的、安全的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體在本領(lǐng)域中具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗破傷風(fēng)毒素的單克隆抗體，其選自(1)重鏈⑶Rl、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列與SEQ ID NO :6、8和10所示至少80%、 85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO: 12、14和16所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；(2)重鏈CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO 22,24和沈所示至少 80%、85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO 28,30和32所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；所述抗體特異性中和破傷風(fēng)毒素。實(shí)施方式之一中，所述單克隆抗體，其選自(1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO :2所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID NO :4所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；(2)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO 18所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID NO :20所示至少80%、85%、90%、95% 相同或100%相同的單克隆抗體。實(shí)施方式之一中，所述抗體屬于IgG^i亞型和κ型。實(shí)施方式之一中，所述抗體是人源化抗體，優(yōu)選具有人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體，尤其優(yōu)選具有人IgGl重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明還提供一種抗破傷風(fēng)藥物組合物，包含安全有效量的本發(fā)明所述抗體或其組合，所述抗體或組合特異性中和破傷風(fēng)毒素。實(shí)施方式之一中，所述藥物組合物包含(1)重鏈⑶Rl、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列與SEQ ID NO :6、8和10所示至少80%、 85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO: 12、14和16所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；和(2)重鏈CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO :22、24和26所示至少 80%、85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO 28,30和32所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體。實(shí)施方式之一中，所述組合物包含(1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序與如SEQ ID NO :2所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID NO :4所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；和(2)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO 18所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID NO :20所示至少80%、85%、90%、95% 相同或100%相同的單克隆抗體。實(shí)施方式之一中，所述抗體都屬于IgGh亞型和κ型。實(shí)施方式之一中，所述抗體都是人源化抗體，優(yōu)選具有人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體，尤其優(yōu)選具有人IgGl重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明還提供一種核酸分子，包含編碼本發(fā)明所述抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。實(shí)施方式之一中，所述核酸分子包含選自以下的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列(l).SEQ ID NO :5，7和9所示的核苷酸序列，(2). SEQ ID NO 11，13和15所示的核苷酸序列，(3) · SEQ ID NO :21，23禾口 25所示的核苷酸序列，(4) · SEQ ID NO :27，29和31所示的核苷酸序列，(5). (1)與⑵的組合，或者(6).⑶與(4)的組合。實(shí)施方式之一中，所述核酸分子包含選自以下的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列(l).SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，(2). SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，(3) · SEQ ID NO 17所示的核苷酸序列，(4) · SEQ ID NO 19所示的核苷酸序列，(5). (1)與⑵的組合，或者(6).⑶與(4)的組合。實(shí)施方式之一中，所述核酸分子還包含編碼IgGh亞型重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列。實(shí)施方式之一中，所述核酸分子還包含編碼人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列，尤其是編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，含有本發(fā)明所述的核酸分子或其組合。本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，含有本發(fā)明所述的核酸分子或其組合，或含有本發(fā)明所述的載體。本發(fā)明還提供一種制備特異性中和破傷風(fēng)毒素的單克隆抗體的方法，包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞，并分離和純化表達(dá)得到的抗體產(chǎn)物。本發(fā)明所述的抗體、核酸分子、載體和/或宿主細(xì)胞可用于制備抗破傷風(fēng)藥物。本發(fā)明還提供用于診斷破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷試劑盒，含有本發(fā)明所述的破傷風(fēng)毒素中和單克隆抗體。


圖1顯示了鼠源抗破傷風(fēng)毒素單抗的純化SDS-PAGE電泳圖。圖2顯示了鼠源抗破傷風(fēng)毒素單抗的親和力測(cè)定結(jié)果。圖3顯示了采用RT-PCR制備抗破傷風(fēng)毒素鼠源單抗cDNA的反應(yīng)體系和步驟。圖4顯示了抗破傷風(fēng)毒素單抗可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，1 20依次為實(shí)施例2中所示抗體輕鏈及重鏈上游可變區(qū)兼并引物。圖5B顯示了本發(fā)明表達(dá)載體pcDNA3. 1(+/_)并標(biāo)明了其中的元件及酶切位點(diǎn)。 圖5A顯示本發(fā)明抗破傷風(fēng)毒素人-鼠嵌合抗體的示意圖，其中，鼠VH為抗破傷風(fēng)毒素單抗 8C10、9B5可變區(qū)基因；人CH為人IgGl抗體重鏈恒定區(qū)基因；鼠VL為抗破傷風(fēng)毒素單抗 8C10、9B5可變區(qū)基因 ’人CL為人IgGl抗體輕鏈恒定區(qū)基因。圖6顯示了抗破傷風(fēng)毒素單抗8C10和9B5的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列，其中下劃線部分為CDR序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期而深入的研究，以破傷風(fēng)類毒素為免疫原，以Balb/c小鼠為免疫對(duì)象，通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液并使之與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得可表達(dá)抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。發(fā)明人進(jìn)一步從眾多細(xì)胞株中篩選出可表達(dá)高特異性的抗破傷風(fēng)毒素的單克隆中和抗體。并且，本發(fā)明人還利用基因重組技術(shù)，保留鼠源抗體可變區(qū)部分，將其與人源抗體恒定區(qū)拼接，構(gòu)建抗破傷風(fēng)毒素人-鼠嵌合單克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種新的抗破傷風(fēng)毒素人-鼠嵌合單克隆抗體，包括該抗體的基因和蛋白序列和生物功能。本發(fā)明的抗破傷風(fēng)毒素人-鼠嵌合單克隆抗體是通過下述幾個(gè)主要步驟實(shí)現(xiàn)的1、抗破傷風(fēng)毒素鼠源單克隆抗體的制備；2、單克隆抗體可變區(qū)編碼序列的克隆與鑒定；3、人-鼠嵌合抗體表達(dá)真核載體的構(gòu)建；4、人-鼠嵌合抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)；近年來，利用基因抗體工程技術(shù)對(duì)鼠源單克隆抗體進(jìn)行改造制備的基因工程抗體不僅降低甚至消除了一種血清蛋白引起的過敏反應(yīng)，又克服了人源免疫球蛋白生產(chǎn)過程中的障礙，具有較好的發(fā)展前景。
采用基因重組技術(shù)，在基因水平上對(duì)抗體分子進(jìn)行改造，形成嵌合抗體，即將鼠抗可變區(qū)基因與人IgG例如人IgGl恒定區(qū)鏈接；人源化CDR移植抗體，即將鼠抗可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)移植入人IgG例如人IgGl的骨架區(qū)中，進(jìn)一步降低了鼠抗引起的免疫反應(yīng)；完全人源抗體，該類抗體不含任何外來基因，不會(huì)造成過敏反應(yīng)，是目前基因工程抗體研究的熱點(diǎn)之一。實(shí)施方式之一中，所述人IgG例如人IgGl的骨架區(qū)相比其源序列存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。因此，重組嵌合抗體與傳統(tǒng)的馬抗血清相比，大大降低了人體對(duì)它的免疫原性，同時(shí)，基因工程技術(shù)，能克服從超免人血清中提取抗破傷風(fēng)抗體的倫理上的矛盾及產(chǎn)量上的限制。本發(fā)明的兩株抗體組合后既具有高特異性、高效價(jià)、能中和破傷風(fēng)毒素，又能降低或基本消除異種蛋白引起的過敏反應(yīng)，適合制藥、診斷和治療性應(yīng)用。以破傷風(fēng)類毒素作為免疫原，采用雜交瘤技術(shù)制備抗破傷風(fēng)毒素單克隆雜交瘤細(xì)胞株，并制備其抗破傷風(fēng)毒素鼠源單抗。由于鼠源單抗作為異種蛋白的抗原性仍異常強(qiáng)烈，可能會(huì)引起強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)而限制其臨床應(yīng)用。采用基因工程抗體技術(shù)對(duì)鼠抗進(jìn)行改造構(gòu)建嵌合抗體，該抗體不僅具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，且極大降低了其異種蛋白的抗原性。利用基因過程抗體生產(chǎn)嵌合抗體，能大量產(chǎn)品以市場(chǎng)化。這為抗破傷風(fēng)基因工程抗體的制備提供了有力的前提條件。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”；“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成” 屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分離的”或“分離純化的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體(單克隆抗體)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外， 單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。 修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。 每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中。可變區(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè) FR區(qū)，它們大致上呈β -折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的⑶R通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的⑶R—起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等，NIH Publ. No. 91-3242，卷I，647-669頁(yè)(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如化61、1862、1863、1864、18六和18八2。對(duì)應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Υ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明提供了重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如SEQ ID NO :6、8和10所示，輕鏈CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO :12、14和16所示的抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體；和重鏈⑶Rl、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如SEQ ID NO -.22,24 和沈所示，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO :28、30和32所示的抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體；所述單克隆抗體特異性中和破傷風(fēng)毒素，因而可稱其為“中和抗體”。本發(fā)明包括各重鏈CDR的氨基酸序列和/或各輕鏈CDR的氨基酸序列與以上所述至少80%、 至少85%、至少90%或至少95%相同的抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明提供了重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體，和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :20所示的抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體。本發(fā)明包括重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與以上所述至少80 %、至少85 %、至少90 %或至少95 %相同的抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明提供了一種鼠源抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體，命名為 8C10，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，經(jīng)鑒定，其為IgGh亞型，輕鏈為κ型。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種鼠源抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體，命名為9B5，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :20所示，經(jīng)鑒定，其為IgGh亞型，輕鏈為κ型。本發(fā)明包括重鏈氨基酸序列和/或輕鏈氨基酸序列與以上所述至少80%、至少 85%、至少90%或至少95%相同的抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明所述抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體、其可變區(qū)或其CDR 的氨基酸序列或者與之至少80 %、至少85 %、至少90 %或至少95 %相同的氨基酸序列的融合分子，例如免疫偶聯(lián)物或融合表達(dá)產(chǎn)物。所述免疫偶聯(lián)物中，與本發(fā)明抗體、可變區(qū)或CDR 偶聯(lián)的部分可選自例如藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素或酶等本領(lǐng)域常用偶聯(lián)組分?？贵w的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來描述，稱為超變區(qū)域(CDR)，將該段間隔成4個(gè)框架區(qū)域(FR)，4個(gè)FR的氨基酸序列相對(duì)比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應(yīng)輕鏈上的⑶R構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了 FR或CDR區(qū)域。本發(fā)明實(shí)施方式之一中，所述單克隆抗體的框架區(qū)相比其源序列存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或 (Fab’ )2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明單克隆抗體、其可變區(qū)和CDR的核酸分子。所述核酸分子可含有以下所述的核苷酸序列或由其構(gòu)成SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、 21、23、25、27、四、31、及其組合。本發(fā)明包括還包括與以上所述序列至少80%、至少85%、 至少90%或至少95%相同的核酸序列，例如密碼子簡(jiǎn)并序列。本發(fā)明還包括與以上所述序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸序列。本發(fā)明還包括與以上所述序列互補(bǔ)的核酸序列。所述核酸分子可以是RNA或DNA分子。基于以上所述的序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用多種方法來制備本發(fā)明的氨基酸序列、核酸序列、抗體及其免疫原性片段。所述方法包括但不限于化學(xué)合成法，基因(組) 文庫(kù)法和重組技術(shù)等等。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature, 256 495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國(guó)專利No. 4，816，567)制得。單克隆抗體也可用例如 Clackson 等，Nature，352 :624-628 (1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離獲得。實(shí)施方式之一，可通過以下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體，例如P⑶NA3. 1 (+/")。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也能預(yù)計(jì)到，將編碼本發(fā)明單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別插入不同的表達(dá)載體中進(jìn)行共表達(dá)也能獲得本發(fā)明的單克隆抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性 DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。 例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點(diǎn)將這些核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體中，使它們分別在表達(dá)載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們?cè)谕蛔x框內(nèi)。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體，例如購(gòu)自Qiagen和!Iomega公司的表達(dá)載體，以及其它可獲得的表達(dá)載體，如PMG18(《根據(jù)INCP-9質(zhì)粒序列進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)的工具開發(fā)〉〉“Development of Tools for Environmental Monitoring Based on INCP-9 Plasmids Sequences" . A. Greated, R. Krasowiak, M. Titok, C. M. Thomas, 1992 年出版，具體載體圖見該書第143頁(yè))。隨后，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。“宿主細(xì)胞”一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明中，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人、 鼠、羊、馬、狗或貓的細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。通常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系來作為表達(dá)真核細(xì)胞衍生多肽的宿主細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)物中的繁殖是本領(lǐng)域熟知的。見《組織培養(yǎng)》， Academic Press, Kruse and Patterson編輯(1973)，該文納入本文作為參考。較佳的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是許多可購(gòu)得的無(wú)限增殖細(xì)胞系。這些無(wú)限增殖細(xì)胞系包括但不局限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Vero細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如H印G2)和其它許多細(xì)胞系。它們?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子提供了翻譯后修飾，包括正確的折疊、正確的二硫鍵形成以及正確位點(diǎn)的糖基化。盡管在下文實(shí)施例中，本發(fā)明僅列舉了以CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的例子，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例可以知道，本發(fā)明也能采用上述這些細(xì)胞系。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene (1,5- 二甲基-1，5- 二氮i^一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。例如可采用^vitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒來轉(zhuǎn)染諸如CHO細(xì)胞等宿主細(xì)胞。然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-kpharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的人源抗EGFR單克隆抗體。所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)(如放射性免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來測(cè)定。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal. Biochem.，107 =220(1980)的katchard分析來測(cè)定。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療破傷風(fēng)的藥物組合物，該組合物含有安全有效量的本發(fā)明單克隆抗體或其組合，編碼本發(fā)明單克隆抗體的核酸分子或其組合，以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或佐劑。實(shí)施方式之一中，所述藥物組合物含有抗體8C10或其同源抗體與9B5或其同源抗體的組合，或者含有編碼8C10或其同源抗體的核酸分子與編碼 9B5或其同源抗體的核酸分子的組合。優(yōu)選實(shí)施方式之一中，所述組合具有協(xié)同效應(yīng)。就本發(fā)明而言，所述“同源抗體”指可變區(qū)或⑶R或輕重鏈氨基酸序列至少80%、 85^^90^^95%相同的抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體。作為免疫學(xué)上可接受的載體的具體例子包括但不限于糖類，如葡萄糖和蔗糖； 淀粉，如玉米淀粉；纖維素及其衍生物，如乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽； 明膠；滑石；固體潤(rùn)滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ；調(diào)味劑；穩(wěn)定劑； 抗氧化劑；防腐劑；無(wú)熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。所謂“安全有效量”指能夠在體內(nèi)或體外在受主中產(chǎn)生期望的免疫學(xué)或治療學(xué)效應(yīng)，且副作用的數(shù)量和程度在可接受范圍之內(nèi)的量，即具有合理的效險(xiǎn)比。這樣的安全有效量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，也是容易通過常規(guī)技術(shù)手段來確定的，可為常規(guī)用量。正如眾所周知的，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。本發(fā)明的單克隆抗體還可用于制備破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷試劑盒，從而用于有效診斷破傷風(fēng)細(xì)菌的感染。例如所述診斷試劑盒中可包括檢測(cè)條，其含有本發(fā)明的單克隆抗體或其偶聯(lián)物、或它們與可檢測(cè)標(biāo)記物的結(jié)合物。所述可檢測(cè)標(biāo)記物選自膠體金標(biāo)記、熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記，優(yōu)選所述酶標(biāo)記為HRP酶標(biāo)。本發(fā)明的診斷試劑盒所針對(duì)的生物樣品可以是獲自患者的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織、體液、血液、或細(xì)胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液等適于檢測(cè)的各種形式存在，例如在結(jié)合免疫組織化學(xué)的檢測(cè)中，優(yōu)選采用石蠟切片標(biāo)本?？筛鶕?jù)多種檢測(cè)原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測(cè)所需的試劑或試劑組。在本發(fā)明中，“試劑組”是指包含了檢測(cè)所需的多種試劑的試劑組合。此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括容器、對(duì)照物(包括陽(yáng)性或陰性對(duì)照)、使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體情況對(duì)其進(jìn)行選擇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明中制備了兩株高特異性抗破傷風(fēng)毒素單克隆中和抗體，據(jù)其基因和蛋白質(zhì)序列確認(rèn)為前所未有的新單抗。尤其是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，兩株抗體組合后有較高的中和破傷風(fēng)毒素的能力，就抵御破傷風(fēng)毒素攻擊而言具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明還通過基因重組技術(shù)構(gòu)建的抗破傷風(fēng)毒素的人-鼠嵌合單克隆中和抗體。此外，該抗體作為藥物與國(guó)內(nèi)現(xiàn)有抗體比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、極大降低過敏反應(yīng)目前國(guó)內(nèi)使用的馬血清抗體，容易誘發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。而此抗體是經(jīng)基因重組技術(shù)改造構(gòu)建的抗破傷風(fēng)毒素人-鼠嵌合單克隆抗體，極大降低了過敏反應(yīng)。2、較高的效價(jià)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的單抗都表現(xiàn)出中和破傷風(fēng)毒素的效價(jià)然而， 當(dāng)兩株抗體組合后，抗體效價(jià)顯著提高，不僅高于單株的效價(jià)，并且高于單株效價(jià)之和，顯示出顯著的協(xié)同作用。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(例如可參考通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(同上)中所述的條件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、抗破傷風(fēng)毒素鼠源單克隆抗體的制備一、抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備1、免疫原
購(gòu)自上海生物制品研究所生產(chǎn)部的破傷風(fēng)類毒素。2、免疫 BalbA^jnIlBalb/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克公司，所有免疫用Balb/c小鼠均為3周齡、雌性、標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)病、健康的純種小鼠，符合美國(guó)FDA標(biāo)準(zhǔn)。3、Balb/c小鼠免疫方法第一次免疫將50 μ g (250 μ 1)抗原與250 μ 1鋁佐劑混勻，配置成500 μ 1溶液， 注射于Balb/c小鼠皮下多點(diǎn)及足掌。第二次免疫距第一次免疫間隔三周后，同法同劑量進(jìn)行第二次免疫。第三、四次免疫距第二次免疫間隔二周后，同法同劑量進(jìn)行第三、四次免疫。四次免疫后小鼠尾靜脈采血，采用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)測(cè)定血清抗體滴度，待血清滴度> IO5以上時(shí)(為3. 3X IO6)，準(zhǔn)備做細(xì)胞融合。細(xì)胞融合前三天進(jìn)行加強(qiáng)免疫小鼠尾靜脈注射抗原20 μ g(100 μ 1)。4、細(xì)胞融合Sp2/0-Agl4小鼠骨髓瘤細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。(1)融合前一天換液，使Sp2/0_Agl4骨髓瘤細(xì)胞保持良好生長(zhǎng)狀態(tài)。(2)脾細(xì)胞取免疫小鼠，放血，斷頸猝死，于75%酒精浸泡3-^iin。無(wú)菌條件下取出小鼠脾臟，放入15ml離心管中，加入少許無(wú)血清RPM 1640培養(yǎng)液，用移液管輕輕吹打， 碾碎，直至沒有組織結(jié)塊、細(xì)胞均勻?yàn)橹?。然后，用無(wú)血清RPM 1640培養(yǎng)液洗滌小鼠脾臟細(xì)胞三次，計(jì)數(shù)備用。(3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞，無(wú)血清RPM 1640培養(yǎng)液洗滌三次， 計(jì)數(shù)備用。(4)將小鼠脾臟細(xì)胞和Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞以10 1的比例混合，1500rpm離心 7min。洗去上清液，準(zhǔn)備融合。(5) —分鐘內(nèi)緩緩加入Iml PEG(1450)，輕搖90sec;再在2.5min中內(nèi)加入5ml無(wú)血清RPM 1640培養(yǎng)液，最后再加入5ml無(wú)血清培液終止反應(yīng)，靜置5min后，1280rpm離心 8min，棄去上清，加入常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，制備成細(xì)胞懸液。(6)將上述細(xì)胞懸液以每孔2 X IO4個(gè)細(xì)胞的密度種入96孔板，每孔200 μ 1，置于 37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)24h后，更換含有HAT(25X)的常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。培養(yǎng)14d后用ELISA法檢測(cè)各個(gè)克隆細(xì)胞的上清液篩選抗破傷風(fēng)毒素抗體的陽(yáng)性克隆。5、細(xì)胞篩選與亞克隆首先使用含有HAT的常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)篩選，培養(yǎng)7d后，改用HT的常規(guī)RPM 1640培養(yǎng)液培，進(jìn)行再次培養(yǎng)篩選。培養(yǎng)14d后，用ELISA方法以各個(gè)克隆細(xì)胞的上清液篩選抗破傷風(fēng)毒素抗體的陽(yáng)性克隆。采用有限稀釋法，將細(xì)胞懸液稀釋至60個(gè)/ ml，于96孔板中每孔加100 μ 1 (約6個(gè)細(xì)胞/孔)。接種2排，剩余細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排。重復(fù)一次。置37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。每隔2 3天，更換1/2培養(yǎng)液。培養(yǎng)約IOd后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的陽(yáng)性孔進(jìn)行第二次篩選和亞克隆。連續(xù)三次亞克隆后，經(jīng)ELISA法檢測(cè)抗體陽(yáng)性率為100%時(shí)確定為穩(wěn)定表達(dá)目的抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保種建庫(kù)。6、鼠源單克隆抗體的類型鑒定
經(jīng)篩選，獲得兩株抗破傷風(fēng)毒素鼠源單克隆抗體，命名為9B5和8C10。采用Sigma 抗體亞型檢測(cè)試劑盒對(duì)該抗體的類型進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)測(cè)定(結(jié)果如表1所示)，抗破傷風(fēng)毒素鼠源單克隆抗體9B5的類型為=IgGh亞型，Kappa(K )，鼠源單克隆抗體8C10的類型為 IgG2a 亞型，Kappa (κ)。
抗體亞型IgGlIgG2aIgG2bIgG3IgAIgM9B50. 4281. 8170. 2330. 3450. 3830. 3258C100. 331. 0150. 3030. 4620. 4650. 307鼠源抗破傷風(fēng)毒素單抗9B5和8C10的純化SDS-PAGE電泳圖如圖1所示。采用常規(guī)ELISA法測(cè)定抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體9B5和8C10的親和力，9B5親和常數(shù)為8. ΘΧΙΟ ^αΟ親和常數(shù)為L(zhǎng)SXlO8M-1 (如圖2所示)。實(shí)施例2、抗破傷風(fēng)毒素單抗可變區(qū)編碼序列的克隆和鑒定以實(shí)施例1中篩選所得抗破傷風(fēng)毒素雜交瘤細(xì)胞株(8C10和9B5)cDNA為模板，利用PCR技術(shù)，克隆抗破傷風(fēng)毒素鼠源單抗可變區(qū)基因；經(jīng)測(cè)序，選取無(wú)突變無(wú)終止密碼子的序列，采用5’ RACE技術(shù)克隆出功能性\和Vh基因。一、抗破傷風(fēng)毒素鼠源單抗可變區(qū)編碼序列的克隆(一 )從雜交瘤細(xì)胞株中提取抗破傷風(fēng)毒素單抗的總RNA用上海飛捷生物公司FAST1000試劑盒提取。(1)取4X IO5雜交瘤細(xì)胞，IOOOrpmX 3min，棄上清。用PBS洗滌一次。將細(xì)胞重懸于100 μ IPBS中，放入離心管內(nèi)。(2)加入RBl液1ml，充分顛倒混勻直至完全溶解，室溫放置5min。(3)加入RB2液500 μ 1，充分顛倒混勻Imin。將混勻后的液體吸入或直接倒入內(nèi)套管中離心lmin。(4)棄去外套管中液體，內(nèi)套管中加入500 μ 1洗液，離心lmin，再重復(fù)一次。(5)取出內(nèi)套管，棄去外套管中液體，仍然套回內(nèi)套管，不加洗液，離心lmin。(6)將內(nèi)套管移入新的離心管中，在膜中央加入洗脫液40μ1，室溫靜置lmin，獲得總RNA。(以上槍頭、離心管和無(wú)菌水均用DEPC處理，經(jīng)121°C滅菌20min。)(二)RT-PCR制備抗破傷風(fēng)毒素鼠源單抗cDNA以總RNA為模板，Oligo (dT) 18為引物，RT-PCR擴(kuò)增抗破傷風(fēng)毒素單抗cDNA。反應(yīng)體系和步驟如圖3所示。(三)抗破傷風(fēng)毒素鼠源單抗可變區(qū)基因的克隆A、兼并引物的合成根據(jù)抗體信號(hào)肽及骨架區(qū)基因的保守性，設(shè)計(jì)并合成以下兼并引物(以下引物中 W = A/T, K = G/T, R = A/G, Y = C/T, M = A/C, S = C/G, N = C/G/T, V = A/C/G)(1)輕鏈上游可變區(qū)兼并引物(分別對(duì)應(yīng)于圖4中的1-6)根據(jù)信號(hào)肽序列設(shè)計(jì) (5， -3，)
1、VLFWDl (SEQ ID No. :33)GAATTCCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT2、VLFWD2(SEQ ID No. :34)GAATTCCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3、VLFWD3(SEQ ID No. :35)GAATTCCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA4、VLFWD 4 (SEQ ID No. :36)GAATTCCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT5、VLFWD 5 (SEQ ID No. :37)GAATTCCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG根據(jù)FRl保守序列設(shè)計(jì)(5，-3，)6、MKac-Fwd (SEQ ID No. :38) GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(2)輕鏈下游兼并引物(5’ -3’ )MKac-Rev(SEQ ID No. :39) :GGATACAGTTGGTGCAGCATC(3)重鏈上游兼并引物根據(jù)信號(hào)肽序列設(shè)計(jì)(5’ -3’)(分別對(duì)應(yīng)于圖4中的 7-13)7、MuIgVHDl(SEQ ID No. :40) :ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT8、MuIgVHD2(SEQ ID No. :41) :ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT9.MuIgVHDS(SEQ ID No. :42) :ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACC10、MuIgVHFl(SEQ ID No. :43) :ATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTTll、MuIgVHF2(SEQ ID No. :44) :ATGTACTTGGGACTGAGCTGTGTAT12.MuIgVHFS(SEQ ID No. :45) :ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG13、MuIgVHF4(SEQ ID No. :46) :ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(4)重鏈上游兼并引物根據(jù)FRl保守序列設(shè)計(jì)(5’ -3’ )(分別對(duì)應(yīng)于圖4中的 14-20)14、MHFR-Fwd-I (SEQ ID No. :47) SARGTNMAGCTGSAGSAGTC15、MHFR-Fwd-2(SEQ ID No. :48) SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG16、MHFR-Fwd-3(SEQ ID No. :49) CAGGTTACTCTGAAAGWGTST17、MHFR-Fwd-4(SEQ ID No. :50) GAGGTCCARCTGCAACARTC18、MHFR-Fwd-5(SEQ ID No. :51) GAGGTCCAACTVCAGCARCC19、MHFR-Fwd-6(SEQ ID No. :52) :AGAGTGAASSTGGTGGAATC20、MHFR-Fwd-7(SEQ ID No. :53) GATGTGAACTTGGAAGTGTC(5)重鏈下游兼并引物MHCC-Rev(SEQ ID No. :54) :ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGCB、可變區(qū)基因的克隆以上述兼并引物和已制備抗破傷風(fēng)毒素單抗cDNA為模板，PCR擴(kuò)增抗破傷風(fēng)毒素 鼠源單抗可變區(qū)基因。(1) PCR體系和參數(shù)設(shè)置如下
權(quán)利要求
1.抗破傷風(fēng)毒素的單克隆抗體，其選自(1)重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列與SEQID NO :6、8和10所示至少80%、 85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO: 12、14和16所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；(2)重鏈CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO :22、24和26所示至少80%, 85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO: 28,30和32所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；所述抗體特異性中和破傷風(fēng)毒素。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其選自(1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQID NO :2所示至少80%、85%、90%、95%相同或 100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID NO :4所示至少80%、85%、90%、95%相同或 100%相同的單克隆抗體；(2)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQID NO :18所示至少80%、85%、90%、95%相同或 100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID N0:20所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗體，它屬于IgGh亞型和κ型。
4.如權(quán)利要求1或2所述的抗體，它是人源化抗體，優(yōu)選具有人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體，尤其優(yōu)選具有人IgGl重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。
5.一種抗破傷風(fēng)藥物組合物，包含安全有效量的權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的抗體或其組合，所述抗體或組合特異性中和破傷風(fēng)毒素。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，包含(1)重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列與SEQID NO :6、8和10所示至少80%、 85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO: 12、14和16所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體；禾口(2)重鏈CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO :22、24和26所示至少80%, 85%、90%、95%相同或100%相同，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列與SEQ ID NO: 28,30和32所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求5所述的組合物，包含(1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序與如SEQID NO :2所示至少80%、85%、90%、95%相同或 100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID NO :4所示至少80%、85%、90%、95%相同或 100%相同的單克隆抗體；和(2)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQID NO :18所示至少80%、85%、90%、95%相同或 100%相同，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與SEQ ID N0:20所示至少80%、85%、90%、95%相同或100%相同的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的組合物，所述抗體都屬于IgGh亞型和κ型。
9.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的組合物，所述抗體都是人源化抗體，優(yōu)選具有人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體，尤其優(yōu)選具有人IgGl重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。
10.一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
11.如權(quán)利要求10所述的核酸分子，包含選自以下的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列(1).SEQID NO :5，7和9所示的核苷酸序列，(2).SEQ ID NO 11，13和15所示的核苷酸序列，⑶.SEQ ID NO :21，23和25所示的核苷酸序列，(4).SEQ ID NO :27，29和31所示的核苷酸序列，(5).(1)與O)的組合，或者(6).(3)與(4)的組合。
12.如權(quán)利要求10所述的核酸分子，包含選自以下的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列(1).SEQID NO :1所示的核苷酸序列，(2).SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，(3).SEQ ID NO 17所示的核苷酸序列，(4).SEQ ID NO 19所示的核苷酸序列，(5).(1)與O)的組合，或者(6).(3)與(4)的組合。
13.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的核酸分子，還包含編碼IgGh亞型重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列。
14.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的核酸分子，還包含編碼人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列，尤其是編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列。
15.一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的核酸分子或其組合。
16.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的核酸分子或其組合，或含有權(quán)利要求15所述的載體。
17.一種制備特異性中和破傷風(fēng)毒素的單克隆抗體的方法，包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，并分離和純化表達(dá)得到的抗體產(chǎn)物。
18.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗體、權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的核酸分子、權(quán)利要求15所述的載體和/或權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞用于制備抗破傷風(fēng)藥物的用途。
19.一種用于診斷破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷試劑盒，含有權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗破傷風(fēng)毒素的單克隆中和抗體、其組合物及其用途。具體而言，本發(fā)明基于兩株抗破傷風(fēng)毒素的單克隆中和抗體8C10和9B5。本發(fā)明鑒定了這兩抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。本發(fā)明還提供了編碼所述抗體的DNA分子、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還通過基因重組技術(shù)構(gòu)建的抗破傷風(fēng)毒素的人-鼠嵌合單克隆中和抗體。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102206275SQ201110106518
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者于漢卿, 吳麗娜, 張燕燕, 梁紅遠(yuǎn), 瞿愛東, 祝婧燁, 趙建兵, 邱建華, 陸瑾, 黃海武 申請(qǐng)人:上海生物制品研究所