專利名稱：一株耐高滲酵母菌的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于酵母菌領域，特別涉及耐高滲釀酒酵母菌株。
背景技術：
近年來，由于具有一些特殊的功能，極端微生物的研究越來越引起人們重視。其中，耐高滲酵母由于其在能源、食品和醫藥等多種工業的廣泛應用而尤為突出。目前其主要應用包括如下幾個方面(1)乙醇乙醇是一種重要的溶劑和燃料，利用高滲酵母可以提高發酵液中底物和產物的濃度，具有降低成本等多種優點；( 甘油當處于高滲環境中時， 大多數種類的酵母細胞在胞內積累甘油以利于調節滲透壓的平衡；C3)赤蘚糖醇赤蘚糖醇是一種適度的甜味增量劑，甜度為蔗糖的60% 70%，具有防止齲齒、適宜糖尿病患者食用的優點。在高滲條件下，利于赤蘚糖醇的積累。另外，高滲酵母在生產中可以適度避免污染雜菌，降低生產風險。對于微生物工業來言，如何獲得一株優良的菌種非常關鍵，因此釀酒酵母的分離選育工作至關重要，但要取得優良的菌種卻并非易事。盡管現在采用基因工程等技術手段可以添加一個或多個外源基因到細胞內，或者刪除某個基因并非難事。但就目前看來，獲得一個具有優秀性狀的菌株僅靠以上的簡單基因操作并不容易，并且刪除某個基因或者導入外源基因可能會破壞酵母胞內的代謝平衡，進而影響細胞的正常代謝生長。另外，對于食品工業而言，基因工程菌的使用是可能具有高度安全隱患的，并且在很多地方是被禁止的。因此，傳統的誘變育種仍是大多數工業微生物育種最重要、最有效的技術。目前用于微生物誘變育種的方法有物理和化學誘變，其中物理誘變包括紫外線、 激光、X射線、Y射線、快中子等物理方法，化學誘變主要包括各種烷化劑(硫酸二乙酯、亞硝基胍和甲基磺酸乙酯等)。烷化劑又稱烷基化劑，是能將小的烴基轉移到其它分子上的高度活潑的一類化學物質。一般引入的烷基連接在氮、氧、碳等原子上。烷化劑常具突變源性，因為它能改變脫氧核糖核酸中的核苷酸。現已知道有幾種不同的化學治療藥物屬于烷化劑。它們具有一個或兩個烷基，分別稱單功能或雙功能烷化劑，所含烷基能與細胞的DNA、RNA或蛋白質中親核基團起烷化作用，常可形成交叉聯結或引起脫嘌呤，使DNA鏈斷裂，在下一次復制時，又可使堿基配對錯碼，造成DNA結構和功能的損害，嚴重時可致細胞死亡。屬于細胞周期非特異性藥物。常用的烷化劑有烯烴、鹵烷、硫酸烷酯等。而這些烷化劑在傳統的誘變操作中，由于其具有誘變育種效果好、操作條件簡單的優點，被廣泛使用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一株新的耐高滲釀酒酵母菌株及其在乙醇發酵方面的應用。本發明所提供的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 44 ，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期2010年12月 08日。該菌株特點如下在顯微鏡下觀察，該菌株的細胞為卵形，一端芽殖，大小約為1 X 5 μ m ；在固體培養基上，該菌菌落為乳白色，表面光滑，濕潤，粘稠，邊緣較整齊且中等偏大。與原始菌相比， 該誘變菌株在形態上明顯小于出發菌株。出發菌株釀酒酵母CICC31481購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。本發明酵母菌株采用下述流程進行選育原始出發菌種一試管活化一硫酸二乙酯(DEQ誘變一高滲平板篩選一亞硝基胍 (NTG)誘變篩選一高滲平板初篩一搖瓶復篩一傳代穩定性試驗一7L發酵罐試驗本發明先采用DES對出發菌株進行誘變，誘變后通過麥芽汁高滲平板(150g/L KCl)培養基初篩，接著對選育出來的菌株繼續進行NTG誘變，通過麥芽汁高滲平板QOOg/ LKC1)培養基初篩，然后采用250mL三角瓶復篩，選育優良的酵母菌株，然后做傳代實驗，評價其遺傳穩定性，并用液相色譜、氣相色譜儀、氣質聯用測定發酵液中的代謝物含量，最后采用7L發酵罐進行實驗效果的評價。菌株CGMCC No. 4429遺傳穩定性結果表明經過連續傳代十次，各項性能指標都比較穩定，遺傳性較好，性狀沒有回復，因此把菌株CGMCC No. 4429作為選育得到的目的菌株。將目的菌株CGMCC No. 4429做7L發酵罐實驗，結果表明與出發菌株相比， CGMCCNo. 4429初始葡萄糖耐受濃度可以達到300g/L，與原始菌相比提高了 50% ；發酵結束后，殘糖為0. 5g/L、甘油含量為lg/L，與原始菌相比提高了 10% ；乙酸含量為0. 8g/L、乳酸含量為0. 4g/L，基本和原始菌相當；乙醇濃度為175g/L，與原始菌相比提高了 108%。有益效果1)本研究采用DES和NTG誘變聯用技術選育釀酒酵母菌株，選育得到了優良菌株 CGMCC No. 4429。該突變菌株能夠耐受200g/L KC1。葡萄糖耐受能力為300g/L，與原始菌相比提高了 50%。該菌株穩定遺傳好，在連續十次傳代過程中，性狀沒有回復，各項性能指標都正常。2)發酵罐實驗跟蹤的各項性能指標表明，該菌株代謝正常，產乙醇能力強，雜酸含量低，是一株優良的耐高滲釀酒酵母菌株。
具體實施例方式下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。舉例1 具體過程如下1. DES誘變選育1)在超凈臺上取試管斜面上的釀酒酵母菌CICC31481 —環，接入裝有50mL麥芽汁培養基的250mL三角瓶中，200rpm，30°C培養IOh左右，使菌體處于對數生長前期。2)取5mL菌液，5000rpm離心IOmin收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
3)用pH7. 0磷酸緩沖液稀釋成IO7個/mL菌懸液。4)取32mL pH7. 0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0. 4mL DES在預先放入轉子的 150mL三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為(ν/ν) 05)在 30°C搖床中 150rpm 反應 30min,取 ImL 混合液，加入 0. 5mL 25% Na2S2O3 溶液中止反應。6)稀釋涂布于含150g/L KCl的麥芽汁篩選培養基平皿中。在30°C培養2 3天后挑取菌落最大的菌株，標號為D菌。2.亞硝基胍誘變1)在超凈臺上取試管斜面上的釀酒酵母菌一環，接入裝有50mL麥芽汁培養基的 250mL三角瓶中，200rpm，30°C培養IOh左右，使菌體處于對數生長前期。2)取5mL菌液5000rpm離心IOmin收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。3)用pH6. 0磷酸緩沖液稀釋成IO7個/mL菌懸液。4)取IOmL菌懸液轉移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成終濃度為IOmg/ mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。5)在30°C下200rpm振蕩反應30min，5000rpm離心IOmin收集菌體，用無菌生理
鹽水洗滌數次，中止反應。6)適當稀釋涂，取最后稀釋度的菌液0. 2mL，涂布于含200g/L KCl的麥芽汁篩選培養基平皿中。在30°C培養2 3天后挑取菌落60支。3.搖瓶復篩1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的釀酒酵母菌一環，接入裝有50mL麥芽汁培養基的250mL三角瓶中，200rpm，30°C培養1 左右，使菌體處于對數生長中期。2)取5mL菌液，接入裝有50mL高滲麥芽汁培養基(葡萄糖濃度為300g/L)中的 250mL三角瓶中，200rpm，30°C培養3_4天，每天檢測葡萄糖濃度和乙醇濃度變化。發酵結束后，比較60株菌種的葡萄糖和乙醇消耗速率、最終殘糖濃度和乙醇濃度、葡萄糖對乙醇的轉化率以及雜酸含量。3)選擇葡萄糖和乙醇消耗速率快、最終殘糖濃度低和乙醇濃度高、葡萄糖對乙醇的轉化率高以及雜酸含量少的菌種為最終菌種，命名為DN菌。4.遺傳穩定性試驗將DN菌在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。5. 7L發酵罐試驗1)取斜面上的釀酒酵母菌一環，接入裝有50mL麥芽汁培養基的250mL三角瓶中， 200rpm，30°C培養1 左右，使菌體處于對數生長中期。2)將對數期的菌種接入裝有4L發酵液的7L發酵罐中。接種量為10%，3(TC下 lOOrpm，對數前期溶氧控制10% (通氣0. 5L/min)，后期厭氧培養3_4天。3)發酵結束后，殘糖為0.5g/L、甘油含量為lg/L，與原始菌相比提高了 10%;乙酸含量為0. 8g/L、乳酸含量為0. 4g/L，基本和原始菌相當；乙醇濃度為175g/L，與原始菌相比提高了 108%。
權利要求
1. 一株耐高滲酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，保藏編號為CGMCC Νο·4^9在乙醇發酵方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一株耐高滲酵母菌，本發明屬于酵母菌領域，特別涉及耐高滲釀酒酵母菌株。本發明所提供的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4429。發酵罐實驗跟蹤的各項性能指標表明，該菌株代謝正常，產乙醇能力強，雜酸含量低，是一株優良的耐高滲釀酒酵母菌株。
文檔編號C12P7/06GK102181373SQ20111010596
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者張健飛, 李政, 王玉 申請人:天津工業大學