超級細(xì)菌新德里金屬依賴型β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的表達(dá)純化及β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的晶體結(jié)構(gòu)的制作方法

專利名稱：超級細(xì)菌新德里金屬依賴型β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的表達(dá)純化及β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對超級細(xì) 菌新德里金屬依賴型￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I進(jìn)行基因工程改造以獲得在大腸桿菌中的高效表達(dá)、純化和結(jié)晶的方法，以及超級細(xì)菌新德里金屬依賴型^ -內(nèi)酰胺酶NDM-I第47位到第270位氨基酸的三維晶體結(jié)構(gòu)及其在藥物篩選及藥物設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超級細(xì)菌NDM-I在2010年8月經(jīng)Lancet雜志特別報(bào)道后，引起了全世界廣泛的關(guān)注，美國3個州和加拿大也出現(xiàn)感染個案；醫(yī)學(xué)界表示，細(xì)菌正在蔓延，但未知蔓延速度有多快，呼吁各國設(shè)立監(jiān)控系統(tǒng)，檢測入院人士，合力追蹤病菌蔓延情況，并呼吁民眾注意個人衛(wèi)生，不要濫用抗生素。至2010年9月，英國有超過70人感染這種NDM-I超級細(xì)菌，印度和巴基斯坦的感染人數(shù)則超過170人。比利時(shí)、荷蘭、奧地利、法國、德國、肯尼亞、澳大利亞、日本等國都出現(xiàn)了感染個案。因此，解析NDM-I的三維結(jié)構(gòu)不僅對揭示其復(fù)制機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，而且對開發(fā)抗NDM-I藥物具有重要價(jià)值。NDM-1,指的是 New Delhi metalIo-^ -lactamase I (新德里金屬-P -內(nèi)酸胺酶)。這種酶可分解￠-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，因此可使任何含￠-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)失效。由于目前為止臨床最常用的抗生素，包括青霉素與頭孢菌素，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)￠-內(nèi)酰胺類等其他非典型￠-內(nèi)酰胺類抗生素，都含有￠-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，因此攜帶這種酶的細(xì)菌可以使幾乎所有抗生素失效(即只要該抗生素含有￠-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu))。超級細(xì)菌NDM-I則是指攜帶編碼NDM-I酶的基因的細(xì)菌。至今已發(fā)現(xiàn)一些克雷伯氏肺炎菌、大腸桿菌和少數(shù)鮑曼不動桿菌的菌株攜帶有此能編碼新德里金屬-3 -內(nèi)酰胺酶I的基因，而該基因存在于細(xì)菌的質(zhì)粒(一種容易在細(xì)菌間發(fā)生基因彳目息交換的環(huán)狀DNA)上，亦即此基因可以通過基因水平轉(zhuǎn)移以從一個菌株轉(zhuǎn)移到另一個菌株中，使原本對抗生素敏感(沒有耐藥性)的菌株獲得耐藥性。最早報(bào)道的產(chǎn)NDM-I細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，于2009年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中發(fā)現(xiàn)，對所有￠-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，對環(huán)丙沙星也不敏感，僅對粘菌素敏感，深入研究發(fā)現(xiàn)這株細(xì)菌攜帶一種新型金屬￠-內(nèi)酰胺酶，并根據(jù)患者可能感染地點(diǎn)命名這種酶為NDM-I，其后還在這名患者糞便中分離到產(chǎn)NDM-I的大腸埃希菌。NDM-I屬于B類金屬@ -內(nèi)酰胺酶(MBL)家族，臨床分離細(xì)菌大多能產(chǎn)生@ -內(nèi)酰胺酶，已經(jīng)確定的P-內(nèi)酰胺酶有數(shù)百種；各種酶分子結(jié)構(gòu)和對P-內(nèi)酰胺類水解能力存在較大差異，一般根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分為A、B、C、D四大類，其中，A類，C類和D類的￠-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)上與絲氨酸￠-內(nèi)酰胺酶類似，通常他們的活性位點(diǎn)具有一個狹窄的縱形溝狀結(jié)構(gòu)，在溝的底部形成了一個空腹(氧陰離子袋)，這種疏松的構(gòu)造容易彎曲，便于結(jié)合底物。由于P-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳在結(jié)合P-內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時(shí)發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，結(jié)果使其開環(huán)，進(jìn)而引起￠-內(nèi)酰胺酶的分解。而B類金屬￠-內(nèi)酰胺酶(MBL)在其活性部位大多含有鋅離子，因此又稱為金屬3 -內(nèi)酰胺酶。其水解底物包括青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類等，表現(xiàn)為產(chǎn)酶細(xì)菌對這些藥物廣泛耐藥。MBLs利用一個二價(jià)金屬離子，分別與組氨酸或半胱氨酸結(jié)合，或同時(shí)與二者結(jié)合，并與￠-內(nèi)酰胺類抗生素的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使其發(fā)生分解。MBLs主要對青霉素、頭孢菌素、碳青霉稀類抗生素發(fā)揮作用，但對單內(nèi)酰環(huán)類抗生素?zé)o效。MBLs最大特點(diǎn)是可以水解碳青霉烯類等抗生素，而對哌拉西林和氨曲南影響較小，其活性不被克拉維酸等￠-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。
然而，盡管一些P -內(nèi)酰胺酶抑制劑已經(jīng)在臨床上使用(如三唑巴坦)，但這些均被視為A類P-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如絲氨酸P-內(nèi)酰胺酶)。因此，臨床上仍然缺乏針對MBLs的抑制劑。而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析對揭示蛋白質(zhì)功能具有重大作用。這一結(jié)構(gòu)的揭示也將對其功能研究具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面，提供了一種將超級細(xì)菌新德里金屬依賴型￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I進(jìn)行基因工程改造，以提高其在大腸桿菌中能夠得到高效表達(dá)、在常溫(攝氏37±5°C)下可以較長時(shí)間穩(wěn)定保持內(nèi)酰胺酶活性的蛋白的方法。本發(fā)明優(yōu)選使用大腸桿菌的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(但不排除其他的表達(dá)系統(tǒng)，如在其他細(xì)菌或者其他的真核生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá))，對以上所述蛋白以GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)融合蛋白的方式進(jìn)行表達(dá)，并用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。本發(fā)明述及在大腸桿菌中高效獲得￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的表達(dá)方法。優(yōu)選地，本發(fā)明將￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I進(jìn)行了基因工程改造，將￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I全長基因進(jìn)行了截短的研究，提供了一個可以在大腸桿菌中高效表達(dá)的方法，該方法包括了氨基端約40 50位氨基酸至約260 270位氨基酸的編碼基因，更優(yōu)選包括約47位至270位氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的方法。將基因工程方法改造過以后的NDM-I基因連接于帶有標(biāo)簽的表達(dá)性質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)、純化。優(yōu)選地，其中所述的標(biāo)簽選自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag> His-tag、特異性抗體；所述載體含有選擇性標(biāo)記基因。所述與特異標(biāo)簽識別的方法是通過親和層析柱進(jìn)行，所述去掉標(biāo)簽的方法通過用蛋白酶酶解，所述分離純化蛋白的方法是進(jìn)一步用凝膠過濾和離子交換層析等方法分離純化NDM-I蛋白；用凝膠電泳的方法確定蛋白質(zhì)的純度。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)晶上述得到的NDM-I蛋白的方法，所述的方法包括將NDM-I蛋白濃縮至5-10mg/ml，在4-30攝氏度下用氣相擴(kuò)散法篩選晶體生長條件。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了衍射性能良好的NDM-I蛋白質(zhì)晶體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了超級細(xì)菌新德里金屬依賴型￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)描述了 NDM-I蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成、肽鏈走向、組織模式以及三維分子構(gòu)造。其中針對NDM-I晶體進(jìn)行X射線晶體衍射，得到NDM-I晶體的晶體衍射數(shù)據(jù)，用所述的蛋白質(zhì)晶體的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)解析，構(gòu)建內(nèi)酰胺酶NDM-I的三維結(jié)構(gòu)。其中所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I為所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I全長蛋白序列的從約40 50位氨基酸至約260 270位氨基酸的編碼基因，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐標(biāo)，或者￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。優(yōu)選地,其中所述的母體晶體具有P3 (I)空間群，晶胞參數(shù)為約a = 40. 7埃，b =40. 7 埃，c = 215. 3 埃，a =旦=90°，Y = 120°。 優(yōu)選地，其中所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I由P折疊1，即含Gly47_Ala55的氨基酸區(qū)段，^折疊2,即含Leu65-Ser75的氨基酸區(qū)段，^折疊3,即含Asp82_Arg85的氨基酸區(qū)段，^折疊4，即含Val86-Val89的氨基酸區(qū)段，a螺旋1，即含Thr98_Glnl07的氨基酸區(qū)段，^折疊5，即含Leull5_Aspll8的氨基酸區(qū)段，a螺旋2，即含Metll9_Alal35的氨基酸區(qū)段，^折疊6，即含Alal38-Asnl42的氨基酸區(qū)段，^折疊7，即含Hisl59_Leul61的氨基酸區(qū)段，^折疊8，即含Leul80-Phel83的氨基酸區(qū)段，^折疊9，即含Thrl95_Ilel98的氨基酸區(qū)段，^折疊10，即含Ile203-Phe205的氨基酸區(qū)段，a螺旋3，即含Tyr229_Ala239的氨基酸區(qū)段，^折疊11，即含Met245_Val247的氨基酸區(qū)段，a螺旋4，即含Ala257_Lys268的氨基酸區(qū)段。其中，由所述的平行的P折疊1-7組成一個扭曲的平面，P折疊8-11組成另外一個扭曲的平面，所述的a螺旋1，2圍繞在第一個平面外，a螺旋3，4圍繞在另一平面周圍。共同組成一個a 0 0 a的結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，其中所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I中結(jié)合有兩個選自鋅、鎂、錳、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，其中一個金屬離子位于由Hisl20，Hisl22，Aspl24，Hisl85構(gòu)成的被稱為“組氨酸位點(diǎn)”的活性中心，另一個金屬離子位于由Aspl24，Cys208, His250構(gòu)成的被稱為“半胱氨酸位點(diǎn)”的活性中心。更優(yōu)選地，其中所述金屬離子為鋅離子。優(yōu)選地，其中所述超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I含有一個與其他金屬^ -內(nèi)酰胺酶相似的HXHXD的序列區(qū)域，其中在新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I中，可以代表為H120X121H122X123D124。更優(yōu)選的，新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I所含有的121位為Ala，123位為Gin。121Ala，123Gln對于新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I功能的發(fā)揮具有決定性的作用。優(yōu)選地，其中所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性位點(diǎn)由四個活動卷曲構(gòu)成，分別命名為 LI, L2, L3, L4。其中，LI 由 Met67-Gly71 構(gòu)成，L2 由 Thrll9-Metl26 構(gòu)成，L3 由Ser217-Asp225,L4由Met248_Ala252構(gòu)成。以上四個卷曲分別通過其上的Hisl20，Hisl22，Aspl24, Hisl89, Cys208等氨基酸形成與底物、抑制劑構(gòu)成的活性口袋，參與P -內(nèi)酰胺酶NDM-I與底物、抑制劑、藥物分子的相互作用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Hisl20，Hisl22，Aspl24, Hisl89, Cys208以及His250等構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物。其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Hisl20，Hisl22，Aspl24，Hisl89以及Cys208中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Met67, Pro68, Gly69以及Phe70構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物。其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Met67，Pro68，Gly69以及Phe70中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自 Thrll9，Hisl20，Alal21，Hisl22，Glnl23，Aspl24 以及 Lysl25 構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物。其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Thrll9，Hisl20，Alal21，Hisl22，Glnl23，Aspl24以及Lysl25中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自 Ser217, leu218, Gly219, Gly220, Leu221, Gly222, Asp223 以及 Ala224構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物。其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Ser217，leu218，Gly219，Gly220，Leu221，Gly222,Asp223以及Ala224中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Met248，Ser249，His250, Ser251以及Ala252構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物。其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Met248，Ser249，His250, Ser251以及Ala252中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了上述組合物在制備治療由超級細(xì)菌 內(nèi)酰胺酶NDM-I引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了上述超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)在設(shè)計(jì)和篩選用于治療超級細(xì)菌感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物中的應(yīng)用，包括根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計(jì)算機(jī)模擬來設(shè)計(jì)結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計(jì)算機(jī)模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子；將根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，設(shè)計(jì)或?qū)ふ业亩嚯摹⒌鞍踪|(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述的P -內(nèi)酰胺酶NDM-I序列含有至少50%相同序列的任一亞型的超級細(xì)菌中，進(jìn)而分析結(jié)合情況；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，設(shè)計(jì)或?qū)ふ业亩嚯?、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述￠-內(nèi)酰胺酶序列含有至少50%相同序列的任一亞型的超級細(xì)菌中并結(jié)晶，從而通過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子與蛋白的結(jié)合情況；
其中與所述0 -內(nèi)酰胺酶NDM-I序列含有至少50%相同序列的任一亞型的超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶結(jié)合的所述多肽、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子即為候選化合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多肽或者小分子，其特征在于與所述超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I上的任一氨基酸有相互作用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了上述超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的的晶體三維結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了基于超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物的方法，包括通過蛋白結(jié)晶方法獲得含有超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體，或者獲得含有NDM-I蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)；其中所述三維結(jié)構(gòu)包括任何與該坐標(biāo)中至少含有40%氨基 酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標(biāo)的平均根方差小于等于I. 5埃的結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了基于超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)篩選與蛋白質(zhì)結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物的方法，包括使用的三維分子組合具有上述的超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)或與上述的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物結(jié)合的所述氨基酸殘基的組中的至少3個具有主鏈碳骨架原子三維坐標(biāo)的平均根方差小于等于I. 5埃的結(jié)構(gòu)在篩選多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物上的應(yīng)用。


圖I為基于來自四種不同類型的內(nèi)酰胺酶的序列對比。其中，包括NDM-U IMP-U VM-2、BlaB, CphA四種^ -內(nèi)酰胺酶。其中IMP-I來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫Accession BAD26594. 1，VM-2來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫Accession ACH43053. 1，BlaB來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫AM286690. l，CphA來自美國國立衛(wèi)生院數(shù)據(jù)庫AAP97133. I這一比對結(jié)果表明，NDM-I具有與其他0 -內(nèi)酰胺酶相類似的高度保守的氨基酸殘基。圖中用...表示在相對應(yīng)區(qū)段的氨基酸缺失。在說明書及權(quán)利要求書中具體的氨基酸位置均是以NDM-I的序列說明的。圖2為超級細(xì)菌新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的三維結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)為NDM-I的結(jié)構(gòu)飄帶圖的俯視、側(cè)視圖。該結(jié)構(gòu)因二級結(jié)構(gòu)特征不同而使用了不同的色彩，其中，a螺旋用紅色表示，^折疊用黃色表示，loop環(huán)是用綠色，(除需特別標(biāo)記的四個loop以外)。Loop環(huán)I簡寫為LI，用藍(lán)色標(biāo)記；Loop環(huán)2簡寫為L2，用紫色標(biāo)記；Loop環(huán)3簡寫為L3,用粉色標(biāo)記；Loop環(huán)4簡寫為L4,用灰色標(biāo)記；(B)NDM-I活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)圖,色彩對應(yīng)于(A)中的二級結(jié)構(gòu)色彩。左圖分別表明了活性位點(diǎn)的兩個金屬離子，120位His，122位His，124位Asp，189位His，208位Cys，在整個蛋白結(jié)構(gòu)中的相對位置。右圖則放大了金屬離子結(jié)合位置，表明了各個氨基酸與金屬離子的精確作用。(C)新德里金屬內(nèi)酰胺酶NDM-I的表面電勢分布圖。色彩區(qū)間為從紅(-10kbT/ec)到藍(lán)(+10kbT/ec)，其中中間的紅色區(qū)域?yàn)橐豢昭ǎ{(lán)色為正電荷表面，紅色為負(fù)電荷表面，白色為不帶電荷表面相關(guān)部分氨基酸。其中用黑色標(biāo)明的為NDM-I的活性口袋區(qū)域。
圖3為超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的四個負(fù)責(zé)與底物相互作用的loop環(huán)的三維結(jié)構(gòu)圖。圖A由Met67-Gly71構(gòu)成的Loopl，其上的Met67，Pro68,Gly69, Phe70氨基酸單獨(dú)用棍棒模型標(biāo)明。圖B為由Thrll9_Metl26構(gòu)成的L2，其上的Thrll9, Hisl20, Alal21, Hisl22, Glnl23, Aspl24, Lysl25 單獨(dú)用棍棒模型標(biāo)明。圖 C 為由 Ser217-Asp225 構(gòu)成的 L3，其上的 Ser217, leu218, Gly219, Gly220, Leu221, Gly222,Asp223，Ala224單獨(dú)用棍棒模型標(biāo)明。圖D為由Met248_Ala252構(gòu)成的L4，其上的Met248，Ser249, His250, Ser251, Ala252 單獨(dú)用棍棒模型標(biāo)明。圖4為超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I幾個活性位點(diǎn)突變體的P -內(nèi)酰胺酶活性測定曲線及突變區(qū)域三維結(jié)構(gòu)圖。(A)為在相同溫度、pH值、緩沖液成分、底物(imipenem)濃度條件下，不同突變體對底物的分解情況；(B)為參與突變研究的活性位點(diǎn)氨基酸 Hisl20, Alal21, Hisl22, Glnl23, Aspl24 的三維位置。 圖5為利用超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性位點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選的流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人提供了一種將超級細(xì)菌新德里金屬依賴型P -內(nèi)酰胺酶NDM-I進(jìn)行基因工程改造，以提高其在大腸桿菌中能夠得到高效表達(dá)、在常溫(攝氏37±5°C )下可以較長時(shí)間穩(wěn)定保持內(nèi)酰胺酶活性的蛋白的方法。通過X射線衍射晶體學(xué)方法解析了超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的分辨率達(dá)2. 5埃的三維晶體結(jié)構(gòu)。超級細(xì)菌NDM-I蛋白的表達(dá)純化方法來源于超級細(xì)菌的NDM-I基因，其編碼的蛋白質(zhì)序列為NDM-I蛋白質(zhì)序列MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR即Met Glu Leu Pro Asn He Met His Pro Val Ala Lys Leu Ser Thr Ala LeuAlaAla Ala Leu Met Leu Ser Gly Cys Met Pro Gly Glu He Arg pro Thr He Gly Gln GlnMet Glu Thr Gly Asp Leu Val Phe Arg Gln Leu Ala Pro Asn Val TrpGln His Thr SerTyr Leu Asp Met Pro Gly Phe Gly Ala Val Ala Ser Asn GlyLeu He Val Arg Asp GlyGly Arg Val Leu Val Val Asp Thr Ala Trp Thr AspAsp Gln Thr Ala Gln He Leu AsnTrp He Lys Gln Glu He Asn Leu Pro Val AlaLeu Ala Val Val Thr His Ala His GlnAsp Lys Met Gly Gly Met Asp Ala LeuHis Ala Ala Gly He Ala Thr Tyr Ala Asn AlaLeu Ser Asn Gln Leu Ala Pro GlnGlu Gly Met Val Ala Ala Gln His Ser Leu Thr PheAla Ala Asn Gly Trp ValGlu Pro Ala Thr Ala Pro Asn Phe Gly Pro Leu Lys Val PheTyr Pro Gly ProGly His Thr Ser Asp Gln He Thr Val Gly He Gln Gly Thr Gln HeAla Phe GlyGly Cys Leu He Lys Asp ser Lys Ala Lys Ser Leu Gly Asn Leu Glu AspAlaAsp Thr Glu His Tyr Ala Ala Ser Ala Arg Ala Phe Gly Ala Ala phe Pro Iys AlaSerMet He Val Met Ser His Ser Ala Pro Asp Ser Arg Ala Ala He Thr His ThrAla ArgMet Ala Asp Lys Leu Arg通過分子克隆技術(shù)將NDM-I基因進(jìn)行克隆，克隆到pGEX-6P-l載體(GE)上，以便進(jìn)一步表達(dá)蛋白。將改造后的NDM-I基因克隆到pGEX-6P-l載體(GE)上表達(dá)氨基末端融合GST的融合蛋白(GST-NDM-I)，將克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，在BL21(DE3)中使用濃度為0. ImM的IPTG (異丙基-P -D硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)蛋白，具體參見實(shí)施例I實(shí)施例實(shí)施例I 改造超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-1，用于大腸桿菌表達(dá)的方法本發(fā)明人初期嘗試將NDM-I蛋白進(jìn)行全長表達(dá)，歷經(jīng)在不同表達(dá)載體pGEX，pET等，以及不同表達(dá)菌株，如BL21 (DE3)，BL21plys, C41等上的嘗試，均不能得到可溶的蛋白。暗示著需要對NDM-I的基因進(jìn)行基因水平上的改造。經(jīng)過設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建了從NDM-I蛋白的氮基端第一位氨基酸開始，逐個刪除氨基酸的50余個克隆，得到了一個能夠大量表達(dá)，并且能夠長時(shí)間((攝氏37±5°C保持活性兩周以上)保持內(nèi)酰胺酶活性的構(gòu)建，即為 NDMGly47-Arg27。NDM-I在大腸桿菌中的表達(dá)純化通過分子克隆技術(shù)將NDM-I蛋白(第47至270氨基酸)克隆到pGEX_6p-l載體(GE)上，其克隆位點(diǎn)是BamHI及XhoI。將克隆的含有NDM-I基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的BL21(DE3)中，進(jìn)行蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)菌可以表達(dá)蛋白N端(氣基端)連接有GST融合蛋白并且含有可以被Proscission蛋白酶切割的酶切位點(diǎn)，從而可以進(jìn)一步將GST蛋白標(biāo)簽與目的蛋白分尚。將克隆構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)中后，先在37度使用5mL的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，大約12小時(shí)后，轉(zhuǎn)接到800mL的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，再在37度下在搖瓶中培養(yǎng)至OD為0. 4-0. 6左右，大約為四小時(shí)，隨后降低培養(yǎng)溫度至25度，然后加入0. ImM的IPTG (異丙基-P-D硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，大約16-20小時(shí)后通過離心收集細(xì)菌，用于純化。將離心收集的表達(dá)菌用含有約50mMMeS (pH6. 5)，150mMNaCl，5%甘油的緩沖液中懸浮，使用低溫超高壓細(xì)胞破碎儀(廣州聚能生物科技有限公司)裂解細(xì)胞，通過離心分離出不溶性沉淀，將高速離心(約18，OOOrmp)后獲得的上清通過Glutathione-sepharose親和柱(GE)來初步分離純化GST-NDM-1蛋白。含有GST標(biāo)簽的蛋白可以結(jié)合到Glutathione-Sepharose親和柱上以后,使用如上所述的緩沖液將雜蛋白洗凈，使用ProScission蛋白酶酶解在親和柱上的混合的GST融合蛋白，此過程大約20小時(shí)，然后將酶切下來的蛋白使用ResourceQ離子交換層析(GE)和凝膠排阻層析(GE)進(jìn)一步純化出NDM-I蛋白，純度一般可以達(dá)到99%以上。通過以上步驟純化的蛋白使用濃縮管濃縮至5mg/mL用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的結(jié)晶將如上方法表達(dá)純化好的新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I濃縮至濃度約為
5-20mg/mL,用氣相懸滴法使用結(jié)晶試劑(來自Hampton Research等公司的Screen Kit I/
II、Index等試劑盒)篩選晶體生長條件。經(jīng)過初步篩選，本發(fā)明人在多種不同的結(jié)晶試劑條件下獲得了初始晶體。通過進(jìn)一步優(yōu)化，其中，在使用20mM CdC12,20mM NaCl,5%PEGmono ether 550，and25% (v/w)PEG 3350的條件下獲得了外觀良好的晶體。在pH 6. 5的緩沖液中得到了較大的晶體，分辨率約為2. 5埃左右的母體晶體，并進(jìn)而收集相應(yīng)的X射線衍射數(shù)據(jù)。實(shí)施例3超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)使用Rigaku Micromax-HF007X射線衍射儀在波長為I. 5418埃的X光下收集到一套最高分辨率達(dá)2. 2埃的數(shù)據(jù)，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)衍射數(shù)據(jù)在長軸方向上的數(shù)據(jù)質(zhì)量很差。然后使用位于上海同步光源BL17U1線站的同步輻射儀，在波長為I. 0000埃的X光，探測器為ADSC Q315收集到一套衍射數(shù)據(jù)，與在日本高能同步輻射加速器機(jī)構(gòu)的NW3E線站， 波長I. 0000埃，探測器為ADSC Q270下收集到一套衍射數(shù)據(jù)，將上海、日本兩套數(shù)據(jù)進(jìn)行整合(merge)，獲得了一套完整度80%以上的數(shù)據(jù)。利用HK2000 (Otwinowski 1997)處理數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)晶體具有P3⑴空間群，晶胞參數(shù)為約a = 40. 7埃，b = 40. 7埃，c = 215. 3埃，a = 0 = 90°，Y = 120°。通過馬修斯常數(shù)的計(jì)算發(fā)現(xiàn)其一個不對稱蛋白中應(yīng)該含有2個蛋白質(zhì)分子，溶劑含量為41%。利用CCP4i軟件對處理得到的sea文件進(jìn)行處理，使用PHASER程序下的分子置換法進(jìn)行相位的尋找，具體而言，本發(fā)明人使用了 VM-4的結(jié)構(gòu)作為模板，(國際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫編號2WRS ;與NDM-I有32%同源性)，從計(jì)算得到的電子密度圖上能夠清楚的觀察到多個二級結(jié)構(gòu)，搭出了初步的模型之后，交替使用CNS、phenix等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的修正，最終獲得結(jié)構(gòu)的R因子為23. 6%，自由R因子為26. 7%。實(shí)施例4超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的三維結(jié)構(gòu)我們使用實(shí)施例3中的方法、軟件，完成了對超級細(xì)菌新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的結(jié)構(gòu)解析工作,使用軟件COOT、pymol,進(jìn)一步分析NDM-I蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成、肽鏈走向、組織模式以及三維分子構(gòu)造。我們發(fā)現(xiàn)，NDM-I蛋白呈現(xiàn)一種典型的a P P a的三明治結(jié)構(gòu)，可以明顯的劃分成兩個區(qū)域，一側(cè)區(qū)域由al、a2、￠1-3 7組成，另一側(cè)區(qū)域由a3、a4，08-011組成。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可知，與其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐標(biāo)，或者P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃的原子坐標(biāo)，均可被認(rèn)為與NDM-I蛋白具有雷同結(jié)構(gòu)。具體而言，P折疊1，即含Gly47_Ala55的氨基酸區(qū)段，P折疊2，即含Leu65-Ser75的氨基酸區(qū)段，P折疊3,即含Asp82_Arg85的氨基酸區(qū)段，P折疊4,即含Val86-Val89的氨基酸區(qū)段，a螺旋1，即含Thr98_Glnl07的氨基酸區(qū)段，P折疊5，即含Leull5-Aspll8的氨基酸區(qū)段，a螺旋2，即含Metll9_Alal35的氨基酸區(qū)段，^折疊6，即含Alal38-Asnl42的氨基酸區(qū)段，^折疊7，即含Hisl59_Leul61的氨基酸區(qū)段，^折疊8，即含Leul80-Phel83的氨基酸區(qū)段，^折疊9，即含Thrl95_Ilel98的氨基酸區(qū)段，^折疊10，即含Ile203-Phe205的氨基酸區(qū)段，a螺旋3，即含Tyr229_Ala239的氨基酸區(qū)段，^折疊11，即含Met245_Val247的氨基酸區(qū)段，a螺旋4，即含Ala257_Lys268的氨基酸區(qū)段。其中，由所述的平行的P折疊1-7組成一個扭曲的平面，P折疊8-11組成另外一個扭曲的平面，所述的a螺旋1，2圍繞在第一個平面外，a螺旋3，4圍繞在另一平面周圍。共同組成一個a 0 0 a的結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例5超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的金屬離子利用軟件C00T，pymol對實(shí)施例3得到的NDM-I蛋白電子密度圖進(jìn)行分析，在由Hisl20, Hisl22, Aspl24, Hisl85 的位點(diǎn)、以及由 Aspl24，Cys208, His250 的另一個位點(diǎn)，都分別發(fā)現(xiàn)含有一團(tuán)未經(jīng)解釋的電子密度。使用珀金埃爾默原子吸收光譜儀(PerkinElmAAnalyst 800)對NDM-I蛋白質(zhì)進(jìn)行原子吸收光譜的分析,發(fā)現(xiàn)NDM-I蛋白含有金屬離子鋅，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員經(jīng)分析可知，這表明這兩團(tuán)電子密度應(yīng)該分別是兩個鋅離子。我們對Hisl20，Hisl22，Aspl24，Hisl85的位點(diǎn)命名為“組氨酸位點(diǎn)”，對另一個由Aspl24，Cys208, His250的位點(diǎn)命名為“半胱氨酸位點(diǎn)”。實(shí)施例6超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性位點(diǎn) 利用軟件C00T，pymol對實(shí)施例3得到的NDM-I蛋白電子密度圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性位點(diǎn)由四個活動卷曲構(gòu)成，分別命名為LI，L2，L3，L4，其中，L I 由 Met67-Gly71 構(gòu)成，L2 由 Thrll9-Metl26 構(gòu)成，L3 由 Ser217-Asp225, L4 由Met248-Ala252 構(gòu)成。這四個卷曲分別通過其上的 Hisl20，Hisl22，Aspl24，Hisl89，Cys208等氨基酸形成與底物、抑制劑構(gòu)成的活性口袋，參與P -內(nèi)酰胺酶NDM-I與底物、抑制劑、藥物分子的相互作用。為了研究NDM-I活性中心的氨基酸重要性，我們利用實(shí)施例8所述的方法，對NDM-I蛋白的不同突變體進(jìn)行了酶活性的測試(參見附圖4A)，我們發(fā)現(xiàn)A121F，Q123D，以及A121F+Q123D雙重突變體與NDM-I野生型蛋白相比，活性分別降低了 98.4%，96. 4%和99. 7%。因此經(jīng)分析可知，121Ala，123Gln對于新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I功能的發(fā)揮具有決定性的作用。實(shí)施例7利用超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性位點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選。我們利用實(shí)施例7所述的四個活動卷曲LI，L2，L3，L4，即由Met67_Gly71構(gòu)成的LI,由 Thrll9-Metl26 構(gòu)成的 L2，由 Ser217_Asp225，構(gòu)成的 L3，以及由 Met248_Ala252 構(gòu)成的L4。進(jìn)行能與NDM-I結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物的分析與篩選。所用流程如圖5所示。首先，我們對由Ll(Met67-Gly71), L2 (Thrll9_Metl26)，L3 (Ser217_Asp225)，以及L4(Met248-Ala252)構(gòu)成的活性口袋進(jìn)行微秒級的分子動力學(xué)，并通過聚類分析找出有代表性的構(gòu)象用于虛擬篩選。然后，對已有約7000萬小分子的數(shù)據(jù)庫先進(jìn)行相關(guān)的成藥性初篩，再同時(shí)對多個動力學(xué)構(gòu)象進(jìn)行高通量虛擬篩選。并應(yīng)用已有約40萬小分子碎片數(shù)據(jù)庫對代表性構(gòu)象進(jìn)行虛擬篩選，并運(yùn)用碎片重組、拼接找出約20個小分子進(jìn)行酶活性的測試。所用分子篩選軟件都來自Schrodiger LLC.分子動力學(xué)用AMBER11. O。由計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算的結(jié)果證明，任意一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自卷曲 Ll(Met67-Gly71), L2 (Thrll9_Metl26)，L3 (Ser217_Asp225)，以及L4(Met248-Ala252)構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其相互作用的氨基酸中，至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
實(shí)施例8篩選抑制超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I活性的各種多肽、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物的方法新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I作為一種內(nèi)酰胺酶，可以分解內(nèi)酰胺類抗生素的內(nèi)酰胺鍵 ，從而使抗生素失效。同時(shí)由于內(nèi)酰胺鍵構(gòu)成的四元環(huán)具有紫外吸收能力，被破壞后則會導(dǎo)致紫外吸收的減少，因此可以通過檢測紫外吸收的變化來直接監(jiān)測金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性。NDM-I的酶活體系是通過分光光度法來測試的。以亞胺培南(來自sigma)作為反應(yīng)底物，亞胺培南在300nm波長處有吸收峰，而NDM-I具有分解亞安培南的作用，因此可以通過檢測亞胺培南在300nm波長處吸收值的降低來檢測NDM-I蛋白的活性。具體操作為將50mM HEPES (PH7. 3), 10 u g/mlBSA, 500 u M亞胺培南和 3nM 的 NDM-1蛋白混合，反應(yīng)終體積為lmL，在37度條件下孵育30秒鐘后，加入不同組成成分的肽、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物，立即使用GENE Quant 1300 (GE)檢測A300的變化。通過分析不同肽、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物對NDM-I活性的抑制情況，對其藥效進(jìn)行篩選。實(shí)施例9利用超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和篩選用于治療超級細(xì)菌感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物的方法具體的步驟如下根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計(jì)算機(jī)模擬來設(shè)計(jì)結(jié)合特定部位的多肽及化合物分子；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計(jì)算機(jī)模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽及化合物分子；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，設(shè)計(jì)或?qū)ふ业亩嚯募盎衔锓肿咏Y(jié)合到含有與所述的新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I序列含有至少50%相同序列的任一亞型的流感病毒聚合酶蛋白中，進(jìn)而分析結(jié)合情況的方法；根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，設(shè)計(jì)或?qū)ふ业亩嚯募盎衔锓肿咏Y(jié)合到含有與所述的新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I序列含有至少50%相同序列的新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I蛋白中并結(jié)晶，從而通過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子與蛋白的結(jié)合情況。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I在設(shè)計(jì)和篩選用于治療由超級細(xì)菌感染引起的疾病的多肽、蛋白質(zhì)、化合物或藥物中的應(yīng)用。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，用于治療由超級細(xì)菌感染引起的疾病的多肽，包括與如上所述的新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-1、至少一種所述的a螺旋或P片層、至少一個氨基酸位點(diǎn)相互作用的多肽。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，用于治療由超級細(xì)菌感染引起的疾病的蛋白質(zhì)，包括與如上所述的新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-1、至少一種所述的a螺旋或P片層、至少一個氨基酸位點(diǎn)相互作用的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，用于治療由超級細(xì)菌感染引起的疾病的化合物，包括與如上所述的新德里金屬￠-內(nèi)酰胺酶NDM-1、至少一種所述的a螺旋或P片層、至少一個氨基酸位點(diǎn)相互作用的化合物。 在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，藥物組合物，包括如上所述的多肽、蛋白質(zhì)或化合物。
本發(fā)明的藥物組合物通常包括一種載體或賦形劑，抗體和/或免疫結(jié)合物溶解于一種藥學(xué)可接受的載體，水性載體為優(yōu)選。許多種水性載體可被應(yīng)用，如，緩沖鹽水等。這些溶液是無菌的并且通常無不良物質(zhì)。這些組分可通過常規(guī)的、眾所周知的消毒技術(shù)進(jìn)行消毒。這些組分可包括藥學(xué)可接受的近似生理?xiàng)l件所需要的輔助物質(zhì)，比如調(diào)節(jié)PH的緩沖齊U、毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些組分中融合蛋白的濃度變化很大，主要根據(jù)與所選的特定給藥方式和病人需要相一致的液體量、粘度、體重等等進(jìn)行選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表I單分子的超級細(xì)菌新德里金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I原子坐標(biāo)群如下注釋坐標(biāo)創(chuàng)建日期2011年 3月08日，編輯日期2011年3月21日。注釋高分辨率范圍(埃)2.5注釋低分辨率范圍(埃)50
原子 I N GLYA 47 13.120 -0.313 1.937 1.00 17.54N
原子 2 CA GLYA 4713.502 -1.620 2.538 1.00 17.25C
原子 3 C GLYA 47 13.811 -1.566 4.023 1.00 17.54C
原子 4 O GLYA 47 13.452 -2.483 4.770 1.00 18.11O
原子 5 N ASPA 48 14.441 -0.477 4.451 1.00 17.80N
原子 6 CA ASPA 48 15.093 -0.418 5.753 1.00 18.26C
原子 I CB ASPA 48 16.591 -0.181 5.558 1.00 18.34C
原子8 CG ASPA 4817,272 -1.341 4.866 1.00 19.54C
原子 9 ODl ASPA 48 16.819 -1.759 3.779 1.00 21.11O
原子 10 OD2ASPA 48 18.257 -1.859 5.422 1.0021.17O
原子 11 C ASPA 4814.475 0.592 6.732 1.00 18.11C
原子 12 O ASPA 4813.460 1.192 6.430 1.00 17.69O
原子 13 N LEUA 4915.090 0.762 7.907 1.00 18.52N
原子 14 CA LEUA 49 14.443 1.451 9.031 1.00 18.03C原子15CB LEUA4913.5580.467 9.8161.00 18.66C
原子16CG LEUA4912.391-0.263 9.1391.00 18.41C
原子17CDl LEUA4911.673-0.99010.1811.00 19.73C
原子18CD2LEUA4911.4440.6908.5251.00 19.96C
原子19C LEUA4915.3842.1889.9851.00 18.10C
原子20O LEUA4916.4131.64910.4211.00 18.29O
原子21N VALA5015.0173.42410.3211.00 17.44N
原子22CA VALA5015.8724.27211.1591.00 17.04C
原子23CB VALA5016.6405.34210.3021.00 16.62C
原子24CGl VALA5017.6286.H511.1341.00 15.73C
原子25CG2VALA5017.3614.6779.1501.00 16.39C
原子26C VALA5015.0844.91312.3181.00 16.58C
原子27O VALA5013.8745.18112.2051.00 16.84O
原子28N PHEA5115.7935.15013.4161.00 16.29N
原子29CA PHEA5115.2155.54214.7051.00 16.58C
原子30CB PHEA5115.4044.40915.7121.00 16.69C
原子31CG PHEA5114.5583.19815.4661.00 16.11C
原子32CDl PIIBA5113.3962.99616.1931.00 16.34C
原子33CEl PHEA5112.6171.87315.9911.00 16.21C
原子34CZ PHEA5112.9960.94215.0541.00 15.64C
原子35CB2 PHE A5114.1631.12814.3181.00 15.91C
原子36CD2PHEA5114.9402.24114.5401.00 16.57C
原子37C PIIEA5115.9746.73915.2521.00 16.85C
原子38O PHEA5117.1976.67415.4621.00 16.42O
原子39N ARGA5215.2737.83815.4821.00 17.36N
原子40CA ARGA 5215.9148.98616.1261.00 17.44C
原子41CB ARGA 5216.05410.18415.1761.00 16.98C
原子42CG ARGA 5217.22110.082 14.1921.00 17.20C
原子43CD ARGA 5217.72211.48913.8001.00 19.35C
原子44NE ARGA 5219.05511.49113.1721.00 18.68N
原子45CZ ARGA 5220.21011.50913.8401.00 17.28C
原子46NHl ARGA5220.22411.51415.1681.00 14.46N
原子47NH2ARGA5221.36211.50413.1731.00 17.17N
原子48C ARGA5215.1309.35217.3611.00 17.78C
原子49O ARGA5214.15110.09517.2931.00 18.50O
原子50N GLNA5315.5468.80618.4961.00 18.11N
原子51CA GLNA 5314.9599.17319.7781.00 18.34C
原子52CB GLNA 5315.8338.62820.9171.00 18.88C
原子53CG GLNA 5315.486 9.09022.3231.00 19.55C
原子54CD GLNA 5314.1248.62522.7981.0021.55C
原子55OEl GLNA5313.2568.27122.0021.00 22.81O
原子56NE2GLNA5313.9218.65024.1131.00 22.44N
原子57C GLNA5314.83710.68619.8351.00 18.33C
原子58O GLNA5315.83811.40219.7471.00 19.12O
原子59N LEUA5413.60911.17719.9301.00 18.33N
原子60CA LEUA5413.37312.61820.0031.00 18.07C

原子61CB LEUA5412.81513.14418.6761.00 18.62C
原子62CG LEUA5413.74613.27117.4461.00 18.99C
原子63CDl LEUA5412.99912.89616.1861.00 18.73C
原子64CD2 LEU A5414.35314.67017.2911.00 18.34C
原子65C LEUA5412.45012.94621.1771.00 17.85C
原子66O LEUA5411.60213.85521.1001.00 17.77O
原子67N ALAA5512.61512.18622.2591.00 17.34N
原子68CA ALAA5511.95012.46723.5341.00 16.76C
原子69CB ALAA5510.53312.96523.3131.00 17.20C
原子70C ALAA5511.93011.23424.4231.00 16.39C
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原子275OD2 ASP A 82-1.5733.87926.867 1.00 17.24O
原子276C ASPA 822.0553.43128.375 1.00 13.64C
原子277O ASPA 821.2482.50228.503 1.00 13.17O
原子278N GLYA 832.9513.74929.304 1.00 13.78N
原子279CA GLYA 833.2542.87230.437 1.00 13.58C
原子280C GLYA 834.0591.63730.048 1.00 13.27C
原子281O GLYA 835.2531.72829.782 1.00 13.90O
原子282N GLYA 843.4030.47730.064 1.00 12.95N
原子283CA GLYA 843.999-0.78829.662 1.00 12.53C
原子284C GLYA 843.722-0.97928.185 1.00 12.35C
原子285O GLYA 844.639-1.18627.392 1.00 11.65O
原子286N ARGA 852.443-0.86427.831 1.00 11.45N
原子287CA ARGA 851.988-0.77326.460 1.00 11.08C
原子288CB ARGA 850.630-0.04426.419 1.00 11.53C
原子289CG ARGA 85-0.568-0.83526.975 1.00 11.81C
原子290CD ARGA 85-1.909-0.20426.534 1.00 13.04C
原子291NE ARGA85-2.893-1.20526.1031.00 12.46N
原子292CZ ARGA85-4.091-0.92925.5901.00 13.05C
原子293NHl ARGA85-4.5030.32825.4331.00 13.31N
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原子295C ARGA852.986-0.05825.5391.00 10.67C
原子296O ARGA853.8920.63425.9881.00 11.04O
原子297N VALA862.825-0.26924.2461.00 10.48N 原子298CA VALA863.5470.48723.2221.00 10.27C
原子299CB VALA864.917-0.14722.8171.00 9.95C
原子300CGl VALA865.3330.27921.4351.00 10.54C
原子30]CG2 VALA865.9990.26723.7741.00 9.38C
原子302C VALA862.5960.65822.0461.00 9.80C
原子303O VALA861.709-0.18921.8021.00 10.45O
原子304N LEU A872.7761.77821.3561.00 9.35N
原子305CA LEUA871.8302.27320.3741.00 9.20C
原子306CB LEUA870.8213.19121.0751.00 9.01C
原子307CG LEUA87-0.3893.95420.4911.00 9.25C
原子308CDl LEUA87-1.2393.14819.5191.00 10.15C
原子309CD2LEUA87-1.2984.49621.6131.00 8.53C
原子310C LEUA872.6233.01419.3101.00 8.73C
原子311O LEUA873.7273.51319.5501.00 8.20O
原子312N VALA882.0533.06818.1221.00 8.82N
原子313CA VALA882.7353.64016.9701.00 8.66C
原子314CB VALA883.4472.53916.1281.00 8.29C
原子315CGl VALA884.2223.14314.9931.00 10.30C
原子316CG2 VALA884.3821.69716.9901.00 9.04C
原子317C VALA881.7414.43016.1251.00 8.21C
原子318O VALA880.6573.95015.8031.00 7.83O
原子319N VALA892.1005.66615.8051.00 8.41N
原子320CA VALA891.4066.36714.7381.00 9.10C
原子321CB VALA891.2437.86015.0161.00 8.87C
原子322CGl VALA890.4668.51613.9241.00 8.21C
原子323CG2VALA890.5008.05016.3301.00 9.86C
原子324C VALA892.1026.05513.4091.00 9.60C
原子325O VALA893.2906.34313.2301.00 8.79O
原子326N ASPA901.3375.40112.5291.00 10.53N
原子327CA ASPA901.7145.08811.1421.00 11.25C
原子328CB ASPA902.0926.36210.4191.00 11.14C
原子329CG ASPA901.3966.4839.1041.00 12.13C
原子330ODl ASPA900.3247.1539.0401.00 13.71O
原子331OD2ASPA901.9165.8868.1421.00 12.36O
原子 332C ASPA902.7803.98010.9561.00 11.91C
原子333O ASPA903.7113.85711.7711.00 12.16O
原子334N THRA912.6173.1729.9011.00 12.50N
原子335CA THRA913.5852.1059.5201.00 12.62C
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原子337OGl THRA912.2550.9497.828 1.00 13.26O
原子338CG2THRA911.9190.28110.127 1.00 13.29C
原子339C THRA914.3872.5378.314 1.00 12.96C
原子340O THRA 913.9593.4137.570 1.00 13.32O
原子341N ALAA 925.5211.8828.088 1.00 13.02N
原子342CA ALAA 926.4782.281 7.056 1.00 13.06C
原子343CB ALAA 927.7081.386 7.128 1.00 12.72C 原子344C ALAA925.8822.2925.643 1.00 13.05C
原子345O ALAA 924.7302.6535.456 1.00 12.70O
原子346N TRPA936.6731.9034.6571.00 13.11N
原子347CA TRPA936.1731.7513.290 1.00 13.44C
原子348CB TRPA937.2652.0912.286 1.00 12.85C
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原子350CDl TRPA935.9563.9621.1891.00 13.02C
原子351NEl TRPA936.1855.2410.7551.00 11.90N
原子352CE2TRPA937.4945.5551.0011.00 11.55C
原子353CD2TRPA938.0974.4371.6041.00 12.01C
原子354CE3 TRPA939.4414.5071.9501.00 11.53C
原子355CZ3 TRPA9310.1205.6501.6821.00 10.92C
原子356CH2TRPA939.4976.7461.0901.00 10.82C
原子357CZ2 TRP A938.1906.7190.7451.00 10.55C
原子358C TRPA935.6130.3662.9921.00 14.02C
原子359O TRPA934.6000.2402.3161.00 14.17O
原子360N THRA946.282-0.6733.4971.00 14.93N
原子361CA THRA 945.876-2.0593.250 1.00 15.38C
原子362CR TIIRA 946.892-2.8422.354 1.00 15.54C
原子363OGl THRA948.055-3.1843.1101.00 16.36O
原子364CG2THRA947.286-2.0551.1221.00 15.97C
原子365C THRA945.630-2.8794.5021.00 16.13C
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原子367N ASPA955.432-4.1784.2701.00 16.85N
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原子372OD2 ASPA953.254-7.6066.2211.00 17.02O
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原子’375N ASPA967.341-5.4175.7031.00 19.29N
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原子378CG ASPA968.696-7.5834.4581.00 20.71C
原子379ODl ASPA967.709-8.1884.9351.00 22.27O
原子380OD2 ASPA969.088-7.7563.2931.0021.67O
原子381C ASPA969.284-4.7897.0311.00 19.57C
原子382O ASPA9610.073-5.0007.9431.00 20.02O

原子383N GLNA 979.003-3.583 6.565 1.00 19.95N
原子384CA GLNA 979.494 -2.353 7.174 1.00 19.69C
原子385CB GLNA 979.359 -1.213 6.182 1.00 19.48C
原子386CG GLNA 9710.155 -1.427 4.908 1.00 20.62C
原子387CD GLNA 9710.076 -0.242 3.965 1.00 21.57C
原子388OEl GLNA 9710.0770.911 4.394 1.00 23.23O
原子389NE2GLNA 9710.018-0.523 2.673 1.00 20.90N
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原子391O GLNA 979.100-1.111 9.197 1.00 20.72O
原子392N THRA 987.645-2.757 8.674 1.00 19.08N
原子393CA THRA 986.849 -2.592 9.881 1.00 18.61C
原子394CB THRA 985.350 -2.374 9.554 1.00 18.62C
原子395OGl THRA 985.219-1.490 8.429 1.00 19.02O
原子396CG2 THR A 984.627-1.771 10.754 1.00 18.94C
原子397C THRA 987.065-3.814 10.794 1.00 18.31C
原子398O THRA 986.638-3.835 11.952 1.00 18.28O
原子399N ALAA 997.734-4.827 10.255 1.00 17.83N
原子400CA ALAA 998.235-5.906 11.084 1.00 17.99C
原子401CB AL 八八 998.494 -7.175 10.271 1.00 17.23C
原子402C ALAA 999.505-5.430 11.800 1.00 17.83C
原子403O ALAA 999.698-5.727 12.966 1.00 18.44O
原子404N GLNA 10010.349-4.676 11.1091.00 17.54N
原子405CA GLNA 10011.594-4.188 11.6991.00 17.49C
原子406CB GLN A 10012.563-3.758 10.588 1.00 17.51C
原子407CG GLN A 10014.041-3.948 10.923 1.00 17.72C
原子408CD GLN A 10014.945-3.143 10.027 1.00 17.00C
原子409OEl GLNA 10015.880-2.488 10.4941.00 16.54O
原子410NE2GLNA 10014.676-3.186 8.7311.00 16.92N
原子411C GLNA 10011.375-3.042 12.7031.00 17.05C
原子412O GLNA 10012.271-2.707 13.491 1.00 17.10O
原子413N ILEA 10110.206-2.413 12.6291.00 16.88N
原子414CA ILEA 1019.777-1.450 13.6231.00 16.83C
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原子416CGl ILEA 1019.0120.311 12.0201.00 15.92C
原子417CDl ILE A 1017.8951.159 11.4841.00 15.98C
原子418CG2ILEA 1018.0070.207 14.2621.00 16.13C
原子419C ILE A 1019.417-2.207 14.9021.00 17.03C
原子420O ILEA 1019,796-1.808 16,0021.00 16.63O
原子421N LEUA 1028.724-3.320 14.7291.00 17.38N
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原子425CDl LEU A 1026.310-5.706 17.5891.00 19.31C
原子426CD2 LEUA 1025.486-3.794 16.1261.00 16.15C
原子427C LEUA 1029.606-4.901 16.3971.00 18.11C
原子428O LEUA 1029.692-5.107 17.6131.00 18.92O

原子429N ASNA 10310.536-5.26515.5221.00 18.08N
原子430CA ASNA 10311.745-5.97415.9051.00 18.56C
原子431CB ASNA 10312.377-6.65414.7001.00 17.91C 原子432CG ASNA 10311.573-7.87014.2221.00 17.69C
原子433ODl ASNA 10310.330-7.85714.2141.00 16.18O
原子434ND2ASNA 10312.283-8.92313.8111.00 16.23N
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原子436O ASN A 10313.160-5.54917.8111.00 18.75O
原子437N TRPA 10413.163-3.98516.1501.00 19.47N
原子438CA TRPA 10414.058-3.03216.8421.00 20.17C
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原子441CDl rIRPA 10415.342-2.69213.6541.00 19.36C
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原子446CZ3 TRP A 10419.039-0.74515.5271.00 18.92C
原子447CH2TRPA10419.597-1.16714.3161.00 19.87C
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原子449C TRI1A 10413.382-2.45418.0991.00 20.78C
原子450O TRPA 10413.978-1.63018.7911.00 21.13O
原子451N ILE A 10512.136-2.87718.3601.00 21.64N
原子452CA ILEA 10511.322-2.44519.5111.00 21.77C
原子453CB ILEA 1059.794-2.30819.1411.00 21.87C
原子454CGl ILEA 1059.400-0.84418.9691.00 22.07C
原子455CDl ILEA 1057.912-0.62518.8431.00 21.85C
原子456CG2ILEA 1058.876-2.94620.1971.00 22.68C
原子457C ILEA 10511.480-3.38220.7051.00 22.03C
原子458O ILEA 10511.618-2.93221.8341.00 22.12O
原子459N LYSA 10611.435-4.68720.4511.00 22.38N
原子460C 八 LYSA 10611.631-5.68221.5011.00 21.90C
原子461CB LYS A 10611.133-7.04621.0401.00 21.63C
原子462CG LYS A 1069.750-7.02920.3881.00 20.56C
原子463CD LYS A 1069.453-8.39219.7561.00 18.58C
原子464CE LYS A 1068.976-8.25018.2911.00 18.28C
原子465NZ LYS A 10610.092-8.27117.2861.00 13.20N
原子466C LYSA 10613.106-5.73321.8391.00 22.16C
原子467O LYS A 10613.482-5.95122.9851.00 22.60O
原子468N GLN A 10713.926-5.487 20.8211.00 22.54N
原子469CA GLN A 10715.384-5.358 20.9251.00 22.77C
原子470CB GLN A 10715.969-5.227 19.5161.00 22.71C
原子471CG GLN A 10717.503-5.285 19.372 1.00 22.95C
原子472CD GLN A 10717.942-5.393 17.9031.00 23.34C
原子473OEl GLN A 10717.641-4.51717.0911.00 20.68O
原子474NE2GLNA 10718.661-6.47217.5691.00 23.97N

原子475C GLNA 10715.855-4.16021.7651.00 23.44C
原子476O GLNA 10716.963-4.18222.313 1.00 23.84O
原子477N GLUA 10815.044-3.10721.846 1.00 23.39N
原子478CA GLUA 10815.525-1.847 22.400 1.00 23.48C
原子479CB GLU A 10816.055-0.928 21.294 1.00 23.77C 原子480CG GLUA 10817.412-1.33120.731 1.00 24.04C
原子481CD GLUA 10817.686-0.747 19.362 1.00 24.99C
原子482OEl GLUA 10816.710-0.33218.6811.00 27.51O
原子483OE2GLUA 10818.876-0.71018.9611.00 24.46O
原子484C GLU A10814.499-1.10223.2681.00 23.81C
原子485O GLUA 10814.896-0.33424.169 1.00 23.75O
原于486N ILEA 10913.205-1.30923.0041.00 23.23N
原子487CA ILEA 10912.168-0.79223.8991.00 23.18C
原子488CB ILEA 10910.978-0.06223.1771.00 23.28C
原子489CGl ILE A 10911.4271.26722.5501.00 23.07C
原子490CDl ILEA 10911.8721.18221.1001.00 23.86C
原子491CG2ILEA 1099.8480.22324.1621.00 23.15C
原子492C ILEA 10911.685-1.92724.7911.00 23.11C
原子493O ILEA 10911.820-1.83926.0041.00 23.03O
原子494N ASNA HO11.124-2.97424.1801.00 22.88N
原子495CA ASNA HO10.804-4.26224.840 1.00 22.26C
原子496CB ASNA HO11.549-4.42426.1721.00 22.19C
原子497C ASN A HO9.297-4.63624.9501.00 22.02C
原子498O ASN A HO8.797-5.48424.1801.00 22.28O
原子499N LEU A 1118.599-4.00925.9071.00 21.47N
原子500CA LEU Alll7.151-4.13726.1401.00 20.05C
原子501CB LEU Alll6.689-2.97727.0181.00 19.73C
原子502CG LEUA 1116.628-3.07128.556 1.00 18.57C
原子503CDl LEU A 1115.940-4.36129.0321.00 17.44C
原子504CD2 LEUA 1117.984-2.88629.2441.00 17.53C
原子505C LEU Alll6.300-4.18245 .8621.00 20.19C
原子506O LEU Alll6.721-3.65423.8241.00 20.90O
原子507N PROA 1125.094-4.80524.9301.00 19.69N
原子508CA PROA 1124.335-5.16723.727 1.00 19.19C
原子509CB PRO A 1123.476-6.32524.210 1.00 19.60C
原子510CG PROA 1123.208-5.96525.651 1.00 19.77C
原子511CD PROA 1124.460-5.34326.147 1.00 19.29C
原子512C PROA 1123.423-4.09523.1441.00 18.77C
原子513O PROA 1122.800-3.32523.8871.00 18.64O
原子514N VALA 1133.336-4.09321.8121.00 18.04N
原子515CA VALA 1132.475-3.16921.0541.00 17.33C
原子 56CB VALA 1132.894-3.07519.5481.00 16.73C
原子517CGl VALA 1132.142-1.96718.8491.00 16.15C
原子518CG2 VALA 1134.388-2.80419.4091.00 16.32C
原子519C VALA 1130.999-3.58421.2021.00 17.07C
原子 .520O VALA 1130.682-4.78021.2401.00 17.27O

權(quán)利要求
1.一種P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I為所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I全長蛋白序列的從約40 50位氨基酸至約260 270位氨基酸的編碼基因，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐標(biāo)，或者P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I為所述￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I全長蛋白序列的從約47位氨基酸至約270位氨基酸的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述的母體晶體具有P3(l)空間群，晶胞參數(shù)為約a = 40. 7 埃，b = 40. 7 埃，c = 215. 3 埃，a = @ = 90°，Y = 120。。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I由P折疊1，即含Gly47-Ala55的氨基酸區(qū)段，^折疊2，即含Leu65_Ser75的氨基酸區(qū)段，^折疊3,即含Asp82-Arg85的氨基酸區(qū)段，^折疊4,即含Val86_Val89的氨基酸區(qū)段，a螺旋1，即含Thr98-Glnl07的氨基酸區(qū)段，^折疊5，即含Leull5-Aspll8的氨基酸區(qū)段，a螺旋2，即含Metll9-Alal35的氨基酸區(qū)段，^折疊6，即含Alal38_Asnl42的氨基酸區(qū)段，^折疊7，即含Hisl59-Leul61的氨基酸區(qū)段，^折疊8，即含Leul80_Phel83的氨基酸區(qū)段，P折疊9，即含Thrl95-Ilel98的氨基酸區(qū)段，P折疊10，即含Ile203_Phe205的氨基酸區(qū)段，a螺旋3，即含Tyr229-Ala239的氨基酸區(qū)段，^折疊11，即含Met245_Val247的氨基酸區(qū)段，a螺旋4，即含Ala257_Lys268的氨基酸區(qū)段。其中，由所述的平行的@折疊1-7組成一個扭曲的平面，^折疊8-11組成另外一個扭曲的平面，所述的a螺旋1，2圍繞在第一個平面外，a螺旋3，4圍繞在另一平面周圍。共同組成一個a 0 0 a的結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的P-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述P -內(nèi)酰胺酶NDM-I中結(jié)合有兩個選自鋅、鎂、錳、銅、鈷、鐵構(gòu)成的組中的金屬離子，其中一個金屬離子位于由HiS120，HiS122，ASpl24，HiS185構(gòu)成的稱為“組氨酸位點(diǎn)”的活性中心，另一個金屬離子位于由Aspl24，Cys208, His250構(gòu)成的稱為“半胱氨酸位點(diǎn)”的活性中心。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述金屬離子為鋅離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的P-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I含有一個與其他金屬P -內(nèi)酰胺酶相似的HXHXD的序列區(qū)域，其中在金屬P -內(nèi)酰胺酶NDM-I中，可以代表為H120X121H122X123D124。更優(yōu)選的，^ -內(nèi)酰胺酶NDM-I所含有的121位為Ala, 123位為Gin。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的P-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述的P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的活性位點(diǎn)由四個活動卷曲構(gòu)成，分別命名為LI，L2，L3，L4，其中，LI由Met67_Gly71構(gòu)成，L2 由 Thrll9-Metl26 構(gòu)成，L3 由 Ser217-Asp225, L4 由 Met248_Ala252 構(gòu)成。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體結(jié)構(gòu)，所述四個卷曲分別通過其上的Hisl20，Hisl22，Aspl24，Hisl89，Cys208等氨基酸形成與底物、抑制劑構(gòu)成的活性口袋，參與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I與底物、抑制劑、藥物分子的相互作用。
10.一種與P -內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Met67，Pro68，Gly69以及Phe70構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Met67，Pro68，Gly69以及Phe70中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
11.一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Thrll9，Hisl20，Alal21，Hisl22, Glnl23，Aspl24以及Lysl25構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Thrll9, Hisl20, Alal21, Hisl22, Glnl23, Aspl24 以及 Lysl25 中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
12.—種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Ser217，leu218，Gly219, Gly220, Leu221，Gly222，Asp223以及Ala224構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié) 合物與 Ser217, leu218, Gly219, Gly220, Leu221, Gly222, Asp223 以及 Ala224 中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
13.一種與￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I中的至少二個，優(yōu)選至少三個選自Met248，Ser249，His250, Ser251以及Ala252構(gòu)成的氨基酸組中的成員結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物，其中所述多肽或蛋白質(zhì)、抗體或免疫結(jié)合物與Met248，Ser249，His250，Ser251以及Ala252中至少二個，優(yōu)選至少三個氨基酸殘基的晶體三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于I. 5埃。
14.一種包括權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物的組合物，可選的包括載體或賦形劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物在制備治療由￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的超級細(xì)菌￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)在設(shè)計(jì)和篩選用于治療超級細(xì)菌感染引起的疾病的各種多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物中的應(yīng)用，包括 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計(jì)算機(jī)模擬來設(shè)計(jì)結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子； 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計(jì)算機(jī)模擬來尋找可能結(jié)合特定部位的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子； 將根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，設(shè)計(jì)或?qū)ふ业亩嚯?、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述的P -內(nèi)酰胺酶NDM-I序列含有至少50%相同序列的任一亞型的超級細(xì)菌中，進(jìn)而分析結(jié)合情況； 根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，設(shè)計(jì)或?qū)ふ业亩嚯摹⒌鞍踪|(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子結(jié)合到含有與所述￠-內(nèi)酰胺酶序列含有至少50%相同序列的任一亞型的超級細(xì)菌中并結(jié)晶，從而通過晶體衍射分析三維結(jié)構(gòu)的方法分析多肽及化合物分子與蛋白的結(jié)合情況；其中與所述￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I序列含有至少50%相同序列的任一亞型的超級細(xì)菌^ -內(nèi)酰胺酶結(jié)合的所述多肽、蛋白質(zhì)或無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子即為候選化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I的晶體三維結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用。
18.一種純化P -內(nèi)酰胺酶NDM-I的方法，其中，將權(quán)利要求I所述的NDM-I基因連接于帶有標(biāo)簽的表達(dá)型質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn) 入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)、純化。
19.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的標(biāo)簽選自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag、特異性抗體,所述載體含有選擇性標(biāo)記基因
20.一種結(jié)晶前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的￠-內(nèi)酰胺酶NDM-I蛋白的方法，所述的方法包括將NDM-I蛋白濃縮至5-10mg/ml，在4-30攝氏度下用氣相擴(kuò)散法篩選晶體生長條件。
21.一種衍射性能良好的根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的NDM-I蛋白質(zhì)晶體
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述β-內(nèi)酰胺酶NDM-1為所述β-內(nèi)酰胺酶NDM-1全長蛋白序列的從約40～50位氨基酸至約260～270位氨基酸的編碼基因，其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐標(biāo)，或者β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40％氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表1中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于1.5埃。本發(fā)明還涉及一種純化β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的方法以及β-內(nèi)酰胺酶NDM-1的晶體三維結(jié)構(gòu)在藥物篩選及藥物設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/55GK102757950SQ201110104140
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者周紅剛, 婁智勇, 楊誠, 牛國君, 王靜, 郭宇, 饒子和 申請人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院