專利名稱：抑制細胞生長的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及生物科學領域，更具體地說涉及癌癥研究領域。特別地，本發明涉及包含 ZNFN3A1 小干擾 RNA(small interfering RNA) (siRNA)的組合物。
背景技術：
肝細胞癌(HCC)是五種最常見的癌癥之一，是世界上癌癥死亡的第四大主因。盡管最新的醫學發展已經在診斷疾病方面取得了很大進展，仍有大量患有HCC的病人在晚期才被診斷出來。大多數病人由于嚴重的肝功能障礙、散布的和/或多發的腫瘤，或高復發率而沒有通過外科切除術來治療。因此開發高效的化學治療藥物和預防策略是緊迫關切的事情。
發明內容
本發明基于一項令人驚訝的發現，即針對ZNFN3A1而加以選擇的小干擾 RNA(siRNA)能有效地抑制各種癌細胞的細胞生長，包括那些參與HCC的癌細胞。本發明提供抑制細胞生長的方法。提供的方法包括那些包括用包含ZNFN3A1小干擾RNA(SiRNA)的組合物接觸細胞的方法。本發明還提供抑制個體的腫瘤細胞生長的方法。 這種方法包括向個體施用包含ZNFN3A1小干擾RNA(siRNA)的組合物。本發明的另一個方面提供在生物樣品的細胞中抑制ZNFN3A1基因的表達的方法。可以通過以足夠抑制ZNFN3A1 基因表達的數量將雙鏈核糖核酸(RNA)分子導入到細胞中來抑制基因的表達。本發明的另一個方面涉及包括核酸序列和載體的產品，和涉及包含它們的組合物，在例如所提供的方法中是有用的。在提供的產品之中包括siRNA分子，當被導入到表達所述基因的細胞中時具有抑制ZNFN3A1基因的表達的性質。在這樣的分子之中，包括那些包含有義鏈和反義鏈的分子，其中有義鏈包含相應于ZNFN3A1目標序列的核糖核苷酸序列，其中反義鏈包含與所述有義鏈互補的核糖核苷酸序列。所述分子的有義鏈和反義鏈相互雜交以形成雙鏈分子。此處使用的術語“有機體”是指任何由至少一個細胞組成的活體。活有機體可以簡單到，例如，單個真核細胞，或復雜到如哺乳動物，包括人類。此處使用的術語“生物樣品”是指整個有機體或其組織、細胞或組成部分的子集 (例如，體液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿、 陰道液和精液)。“生物樣品”進一步指從整個有機體或其細胞、組織或組成部分的子集制備出的組織勻漿、溶胞產物、提取物、細胞培養物或組織培養物，或其級分或部分。最后，“生物樣品”是指一種有機體已經在其中繁殖了的、包含細胞組分例如蛋白質或多核苷酸的培養基，例如營養肉湯或凝膠。本發明以抑制細胞生長的方法為特色。通過用ZNFN3A1小干擾RNA(SiRNA)的組合物接觸細胞來抑制細胞生長。ZNFN3A1是在腫瘤，例如肝細胞癌或直腸腺癌中過量表達的鋅指蛋白。通過本發明可以抑制表達ZNFN3A1的細胞的生長。進一步用轉染增強劑接觸細胞。可體外、體內或回體(ex vivo)提供細胞。個體是哺乳動物，例如，人類、非人靈長類、 小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。所述細胞是肝細胞或結腸細胞。做為選擇，所述細胞是腫瘤細胞(即，癌細胞)例如結直腸癌細胞或肝癌細胞。例如，所述細胞是結直腸腺癌細胞或肝細胞癌細胞。抑制細胞生長意思是與未處理的細胞相比，被處理的細胞以更低的速率增殖、或具有降低了的生活力。通過本領域已知的增殖分析來測量細胞生長。術語“siRNA”是指阻止目標mRNA的翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA導入細胞的標準技術，包括那些把用于轉錄RNA的DNA作為模板的技術。siRNA包括有義ZNFN3A1 核酸序列、反義ZNFN3A1核酸序列、或兩者。構建siRNA，以使單個轉錄產物兼備來自目標基因的有義序列和互補的反義序列，例如發夾序列。本方法被用于改變細胞中的基因表達，在所述細胞中作為例如細胞的惡性轉化的結果，ZNFN3A1的表達是上調的。在目標細胞中所述SiRNA與ZNFN3A1轉錄產物的結合導致細胞ZNFN3A1生產的減少。寡核苷酸的長度至少為10個核苷酸，也可以與自然發生的 ZNFN3A1轉錄產物一樣長。優選的，寡核苷酸長度為19-25個核苷酸。最優選的，寡核苷酸長度小于75、50或25個核苷酸。抑制哺乳動物細胞中ZNFN3A1表達的ZNFN3AlsiRNA寡核苷酸的實例包括包含目標序列的寡核苷酸，例如，SEQ ID NO :1的451-471、532-552、623-643、 625-645,636-656,726-746,923-943,1065-1085 和 1258-1278 位核苷酸。具有在靶細胞中抑制基因表達的能力的雙鏈RNA的設計方法是已知的。(例如參見，美國專利No. 6，506，559，將其作為參考完全引用)。例如，設計siRNA的計算機程序可以從Ambion 網站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)獲得。計算機程序根據以下方案選擇用于siRNA合成的核苷酸序列。siRNA目標位點的選擇1.從轉錄產物的AUG起始密碼子開始，向下游掃描AA 二核苷酸序列。記錄每個 AA的發生和3'相鄰的19個核苷酸，以作為潛在的siRNA目標位點。Tuschal等建議不將 siRNA設計至5'和3'非翻譯區(UTR)和接近起始密碼子的區域(75個堿基內)，因為這些可能較富含調節蛋白結合位點。UTR-結合蛋白和/或翻譯起始復合物可能干擾siRNA核酸內切酶復合物的結合。2.將所述潛在的目標位點與適當的基因組數據庫(人類、小鼠、大鼠等)進行比較，并排除考慮任何與其他編碼序列具有顯著同源性的目標序列。我們建議利用BLAST，其可以在 NCBI 服務器上找到www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/3.選擇合格的目標序列用于合成。沿著需評估的基因的長度方向選擇幾個目標序列是一般性的方法。也被包括在本發明中的是包括目標序列的核酸序列的分離的多核苷酸，所述目標序列例如，SEQ ID NO :1 的 451-471 (SEQ ID NO 58)、532-552 (SEQ ID NO 60) ,623-643 (SEQ ID NO 61),625-645(SEQ ID NO 62),636-656(SEQ ID NO 63),726-746(SEQ ID NO :64)、 923-943 (SEQ ID NO :66)、1065-1085 (SEQ ID NO 68)和 1258-1278 (SEQ IDNO 69)位核苷酸，或與 SEQ ID NO 1 的 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、 1065-1085和1258-1278位核苷酸的核酸序列互補的多核苷酸。此處使用的“分離的核酸” 是從其原始環境(例如，如果是自然發生的，指自然環境)移出了的、因而從其自然狀態中被綜合地改變了的核酸。在本發明中，分離的核酸包括DNA、RNA和其衍生物。當所述分離的核酸是RNA或其衍生物時，在核苷酸序列中堿基“t”應當被替換為“U”。此處使用的術語 “互補”是指在多核苷酸的核苷酸單位之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，而術語“結合”意思是在兩個多肽或化合物、或相關的多肽或化合物，或它們的組合之間物理的或化學的相互作用。在適當的條件下互補的核酸序列雜交形成包含很少或不包含錯配的穩定的雙鏈體。此外，本發明的分離的核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過雜交形成雙鏈核苷酸或發夾環結構。在一個優選的實施方式中，這種雙鏈體每10個配對中包含不超過1個錯配。在特別優選的實施方式中，當所述雙鏈體的鏈完全互補時，這種雙鏈體不包含錯配。所述多核苷酸的長度小于1622個核苷酸。例如，所述多核苷酸長度小于500、200或75個核苷酸。本發明還包括包含此處描述的一個或多個核酸的載體，和包含所述載體的細胞。本發明的分離的核酸對于針對ZNFN3A1的siRNA或編碼所述siRNA的DNA是有用的。當所述核酸用于siRNA或其編碼DNA時，有義鏈優選的長于19個核苷酸，更優選的長于21個核苷酸。本發明某種程度上基于這種發現，編碼鋅指蛋白ZNFN3A1的基因與在非癌性肝組織中相比、在肝細胞癌(HCC)中是過量表達的。ZNFN3A1 cDNA長度是1622個核苷酸。1284 大小的ORF編碼了具有鋅指基序的4 個氨基酸的蛋白質。ZNFN3A1的核酸和多肽序列在表1和表2中顯示。在表1中，5'和3'非翻譯區用斜體表示，起始和終止密碼子用粗體表示。ZNFN3A1蛋白的亞細胞定位在細胞周期進展期間和根據培養細胞的密度發生變化。 當細胞處于中期到晚期S期、或細胞在稀疏條件下培養時，ZNFN3A1蛋白在核中積聚。而當細胞處于細胞周期的其他期、或以密集條件生長時，ZNFN3A1蛋白位于細胞質中以及位于核中。ZNFN3A1在體內與ΚΙΑΑ00Μ蛋白和RNA聚合酶II形成三元復合物，三元復合物通過直接與5’側翼區的元件“5’-CCCTCC-3”’結合來活化下游基因包括表皮生長因子受體(EGFR) 的轉錄。
權利要求
1.抑制個體腫瘤細胞生長的方法，包括向所述個體施用包含ZNFN3A1小干擾 RNA(siRNA)的組合物。
2.權利要求1所述的方法，其中所述siRNA包含有義ZNFN3A1核酸和反義ZNFN3A1核酸。
3.權利要求1所述的方法，其中所述腫瘤細胞是結直腸癌細胞或肝癌細胞。
4.權利要求3所述的方法，其中所述結直腸癌細胞是腺癌細胞。
5.權利要求3所述的方法，其中所述肝癌細胞是肝細胞癌細胞。
6.權利要求2所述的方法，所述siRNA是特異于ZNFN3A1靶點的，所述ZNFN3A1靶點選自 SEQ ID NO :1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、 923-943、1065-1085 或 1258-1278。
7.權利要求6所述的方法，所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是相應于選自 SEQ ID NO 1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、 923-943、1065-1085或1258-1278的序列的核糖核苷酸序列，[B]是由3到23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，和[A’ ]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。
8.權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含轉染增強劑。
9.一種分離的多核苷酸，包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合，其中分別地，所述有義鏈核酸包含選自 SEQ ID NO 1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、 726-746,923-943,1065-1085或1258-1278的核苷酸序列，所述反義鏈核酸由其互補序列組成。
10.權利要求9所述的分離的多核苷酸，其中所述有義鏈核酸和反義鏈核酸在同一條鏈上。
11.權利要求9所述的分離的多核苷酸，其中所述有義鏈核酸由短于約100個核苷酸的核苷酸序列組成。
12.權利要求11所述的分離的多核苷酸，其中所述有義鏈核酸短于約75個核苷酸。
13.權利要求12所述的分離的多核苷酸，其中所述有義鏈核酸短于約50個核苷酸。
14.權利要求13所述的分離的多核苷酸，其中所述有義鏈核酸短于約25個核苷酸。
15.權利要求14所述的分離的多核苷酸，其中所述有義鏈核酸長度在約19到約25個核苷酸之間。
16.包含多核苷酸的載體，所述多核苷酸包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合，其中分別地，所述有義鏈核酸包含選自SEQ ID NO :1的核苷酸451-471、532-552、623-643、 625-645,636-656,726-746,923-943,1065-1085 或 1258-1278 的核苷酸序列，所述反義鏈核酸由其互補序列組成。
17.權利要求16所述的載體，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中 [A]是選自 SEQ ID NO :1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、 923-943、1065-1085 或 1258-1278 的核苷酸序列，[B]是由3到23個核苷酸組成的核苷酸序列，和[A’ ]是由[A]的互補序列組成的核苷酸序列。
18.包含至少一個siRNA的組合物，所述siRNA包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合，其中分別地，所述有義鏈核酸包含相應于選自SEQ ID N0:1的核苷酸451-471、532-552、 623-643,625-645,636-656,726-746,923-943,1065-1085 或 1258-1278 的序列的核糖核苷酸序列，所述反義鏈序列由其互補序列組成。
19.包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中所述有義鏈包含相應于ZNFN3A1目標序列的核糖核苷酸序列，和其中反義鏈包含與所述有義鏈互補的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈相互雜交形成所述雙鏈分子，和其中當被導入到表達ZNFN3A1基因的細胞中時，所述雙鏈分子抑制所述基因的表達。
20.權利要求19所述的雙鏈分子，其中所述ZNFN3A1目標序列包含來自SEQID NO 1 的至少約10個連續的核苷酸。
21.權利要求20所述的雙鏈分子，其中所述ZNFN3A1目標序列包含來自SEQID NO 1 的約19個到約25個連續的核苷酸。
22.權利要求21所述的雙鏈分子，其中所述ZNFN3A1目標序列選自SEQID N0:1的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、923-943、1065-1085 或 1258-1278o
23.權利要求19所述的雙鏈分子，其中單個核糖核苷酸轉錄產物包含所述有義鏈和所述反義鏈，所述雙鏈分子進一步包含連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。
24.權利要求19所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長度小于約100個核苷酸的寡核苷酸。
25.權利要求M所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長度小于約75個核苷酸的寡核苷酸。
26.權利要求25所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長度小于約50個核苷酸的寡核苷酸。
27.權利要求沈所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長度小于約25個核苷酸的寡核苷酸。
28.權利要求27所述的雙鏈多核苷酸，其中所述雙鏈分子是長度在約19個和約25個核苷酸之間的寡核苷酸。
29.編碼權利要求19所述的雙鏈分子的載體。
30.權利要求四所述的載體，其中所述載體編碼具有二級結構的轉錄產物，其中所述轉錄產物包含有義鏈和反義鏈。
31.權利要求30所述的載體，其中所述轉錄產物進一步包含連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。
32.在生物樣品的細胞中抑制ZNFN3A1基因的表達的方法，所述方法包括將核糖核酸 (RNA)以足夠抑制ZNFN3A1基因的表達的數量導入到細胞中，其中所述RNA是包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中所述有義鏈包含相應于ZNFN3A1目標序列的核糖核苷酸序列，和其中所述反義鏈包含與所述有義鏈互補的核糖核苷酸序列，其中所述有義和所述反義核糖核苷酸鏈相互雜交形成所述雙鏈分子，和其中當被導入到表達ZNFN3A1基因的細胞中時， 所述雙鏈分子抑制所述基因的表達。
全文摘要
本發明記載了一種通過用ZNFN3A1 siRNA的組合物接觸細胞來抑制癌細胞的生長的方法。本發明還包含治療癌癥的方法。本發明還記載了產品，包含核酸序列和載體，以及包含它們的組合物，其在本發明提供的方法中是有用的。本發明還提供一種抑制腫瘤細胞的方法，所述腫瘤細胞例如肝癌或結腸癌細胞，特別是HCC或結直腸腺癌細胞。
文檔編號C12N15/12GK102172408SQ201110103198
公開日2011年9月7日 申請日期2004年2月27日 優先權日2003年2月28日
發明者中村佑輔, 古川洋一 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司