最佳酶制劑應用體系的制作方法

專利名稱：最佳酶制劑應用體系的制作方法
技術領域：
本發明屬于飼料添加劑領域。特別涉及飼用復合酶制劑的定量和個性化應用。
背景技術：
酶制劑在飼料中添加和應用是生物技術在飼料工業中應用最受關注的領域。從20 世紀50年代酶制劑開始在飼料中添加，到90年代飼用酶制劑的普遍應用，酶制劑在畜禽養殖業中的作用日益突出。同時，調查顯示全球所有單胃動物飼料中只有10%添加了酶制劑， 并且豬料中酶制劑的使用量遠低于禽料中酶制劑的添加量。現有的研究資料顯示，影響飼用酶快速發展的原因主要有兩個一是單項酶制劑評估體系的標準化；二是復合酶制劑應用體系的建立。目前，關于飼用酶的研究報道很多，但大多集中在飼用酶作用機理和動物飼養效果的研究上，很少涉及飼用酶的活性評估，僅有的報道也是著重于不同測定方法對飼用酶活性的影響，而對于影響其催化活性和穩定性(有效酶活，Effective Activity)的研究資料很少。陸文清和李德發000 認為飼用酶的品質評定和選擇涉及很多因素，遠比普通工業用酶復雜。對于飼用酶，由于飼料原料、飼料加工和動物消化道PH值的多樣性，使得酶制劑的評估和選擇成為一個復雜的工程。Sh印py (2004)認為飼用酶發展緩慢的原因是因為飼用酶在使用過程中受到如下薄弱環節的制約——標準化、公開有效的質量控制體系、良好的熱穩定性、更加準確的液體應用系統，較為明確的技術信息公示，以及使生產性能反應更加一致的產品。歐盟最先頒布了飼料中禁止使用某些抗生素作為促生長劑的規定，這個決定迫使飼料生產企業不得不開始尋找抗生素的替代品，而在飼料中添加酶制劑成為各飼料企業的首選。但事實并未象人們所期望的那樣，酶制劑在單胃動物飼料特別是在豬飼料中的使用并不廣泛。主要原因可能是在添加酶制劑以后，原來的飼料數據庫和動物營養需要參數并不適合實際情況(馮定遠和沈水寶，2005)，從而導致酶制劑添加效果不明顯或添加成本過高。他們認為飼料在添加酶制劑后，現有的飼料原料數據庫甚至飼養標準可能不完全適合使用酶制劑的日糧配方設計。因而如何確定添加特定酶制劑后飼料原料的有效營養值 (Effective Nutrient Value)成為解決酶制劑有效利用的限制步驟。

發明內容
一種最佳酶制劑應用體系(OEATM)，其特征在于，包括兩方面的內容有效酶活評估和有效營養值評估。有效酶活評估包括6個指標標示酶活、pH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個月酶活存留率；有效營養值評估包括4個指標飼料粘度測定、飼料能值測定、 飼料蛋白質消化率測定、動物生長表現。標示酶活的測定方法為取一定量酶樣品溶液，用pH 5.5的0. lmol/L的 NaAc-HAc緩沖溶液溶解后定容至IOOmL,然后根據酶活將樣品溶液稀釋適當倍數，使稀釋好的待測酶液中酶活力控制在0. 04-0. 08U/mL之間；再將稀釋好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后，加DNS試劑終止酶的反應，沸水浴5min，冷卻定容；標準空白調零， 用分光光度計在MOnm下測定吸光值，最后根據吸光值計算酶活。pH閾值測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液溶解，測定其活性，測定酶活結果與原始酶活相比，得到其在不同PH值條件下的酶活表現(％ )；不同PH值緩沖液梯度設置為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0 ；也可根據不同動物消化道不同消化位點的消化液PH值而設定。過胃酸測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液在37°C條件下處理1.紐或池后測定其活性，測定酶活結果與標示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)；不同PH值緩沖液梯度設置為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5 ；以此可得到胃中酸性環境對酶樣品活性的破壞程度(％ )。過蛋白酶測定方法為配制單酶樣品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°c條件下水浴2_4h，之后將經過蛋白酶處理的單酶樣品溶液按照單項酶制劑酶活測定方法測定其酶活，測定酶活結果與標示酶活相比，得到其酶活性存留率(％ )，以此確定外源酶制劑對蛋白酶的耐受性。耐高溫測定方法為測定酶樣品的水分含量，根據酶樣品中水分含量通過加蒸餾水調節待測酶樣品中的水分至16%，然后在烘箱中放置一定時間后取出冷卻備用，烘箱溫度設置為65°C、75°C、85°C、9(TC、95°C等5個溫度梯度；通過單酶酶活測定方法測定酶活力，測定不同溫度處理后酶樣品活性與標示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )，以此可評估酶樣品的耐高溫性(％)。三個月酶活存留率測定方法為酶制劑從生產之日起開始計算，常溫貯存三個月后再取樣，按照酶制劑酶活測定方法測定酶活，結果與標示酶活相比，得到其三個月常溫貯存后的酶活存留率(％)。飼料粘度測定和飼料能值測定方法為準確稱取1. 25g粉碎飼料樣品于三角瓶中，所述粉碎飼料過Imm篩，分別加入不同梯度外源酶制劑后，再加入lmg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液，所述胃蛋白酶鹽酸溶液為0. IN并且pH = 2. 0，在40°C恒溫水浴鍋中振蕩，消化時間為池；胃消化階段結束后，向溶液中加入ImL新鮮胰酶溶液，所述胰酶溶液為5mg/mL， 調節溶液PH值為6. 5 (1M NaOH溶液)，于40°C恒溫水浴中振蕩，消化時間為4h ；同時以未加酶飼料為對照組，進行同樣的消化程序；體外消化結束后，將試管取出于3000g離心15min， 取上清液測定其粘度；消化殘渣在烘箱中烘至恒重，測定其能量；飼料粘度變化(％ )=加酶組食糜粘度/對照組食糜粘度*100 ；飼料能值變化(％ )=加酶組消化能/對照組消化能 *100。基于飼用酶制劑評估和應用中的問題，我們提出了最佳酶制劑應用體系(0ΕΑ ) 的概念。該體系的核心有兩點通過對有效酶活和加酶飼糧有效營養值的評估，達到酶制劑合理配比和定量添加的目的。0ΕΑ 體系綜合評估全球單酶的有效酶活，針對飼料配方、飼料加工過程和動物消化生理特點進行有效營養值的評估，提供定量的個性化復合酶制劑方案。0ΕΑ 體系可以解構為六大方面1. 0ΕΑ 是“最佳酶制劑應用體系”的英文縮寫，即Optimum Enzyme Application, 是飼用復合酶定量的、個性化、動態方案；
2. 0ΕΑ 是根據目標動物消化生理特點、飼料加工工藝和飼料中NSP種類與含量制定的定量的、個性化、動態方案；3. 0ΕΑ 是在四個數據庫基礎上制定的定量的、個性化、動態方案四個數據庫分別是有效酶活數據庫、抗營養因子數據庫、產品試驗數據庫、同類產品數據庫；4. 0ΕΑ 包括兩方面的內容有效酶活評估和有效營養值評估；5.有效酶活評估包括6個指標標示酶活、pH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個月酶活存留；有效營養值評估包括4個指標飼料粘度測定、飼料能值測定、飼料蛋白質消化率測定、動物生長表現；6. 0ΕΑ 是為解決復合酶應用中出現的六大問題而制定的定量的個性化方案，即 有效酶活評估不清晰、有效營養值模糊、針對性不強、添加不定量、效果不明顯、成本不經濟。


圖1為pH值對木聚糖酶活性的影響；圖2為飼料調質模擬條件對木聚糖酶的影響；圖3為胃蛋白酶/胰酶對木聚糖酶活性的影響；圖4為木聚糖酶對小麥和豆粕粘度的影響。
具體實施例方式本發明主要有兩個內容有效酶活評估、有效營養值評估。1.有效酶活評估(1)酶制劑標示酶活測定取一定量酶樣品溶液，用pH 5. 5的0. lmol/L的NaAc-HAc緩沖溶液溶解后定容至 lOOmL，然后根據酶活將樣品溶液稀釋適當倍數(最好使稀釋好的待測酶液中酶活力能控制在0. 04-0. 08U/mL之間)。再將稀釋好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后， 加DNS試劑終止酶的反應，沸水浴5min，冷卻定容。標準空白調零，用分光光度計在540nm 下測定吸光值，最后根據吸光值計算酶活。(2)酶制劑pH閾值測定將單酶用不同pH值緩沖液溶解，測定其活性，測定酶活結果與原始酶活相比，得到其在不同PH值條件下的酶活表現(％ )。一般情況下不同pH值緩沖液梯度設置為2. 0、 2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0 ；同時也可根據不同動物消化道不同消化位點的消化液PH值而設定。(3)酶制劑耐酸性測定(過胃酸測定)將單酶用不同pH值緩沖液在37°C條件下處理1. 5h或池后測定其活性，測定酶活結果與標示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)。一般情況下不同PH值緩沖液梯度設置為2.0、2.5、3.0、3.5。以此可得到胃中酸性環境對酶樣品活性的破壞程度(％)。(4)酶制劑對胃蛋白酶/胰酶的耐受性(過蛋白酶測定)
配制單酶樣品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°C條件下水浴 2_4h。之后將經過蛋白酶處理的單酶樣品溶液按照單項酶制劑酶活測定方法測定其酶活， 測定酶活結果與標示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)。以此確定外源酶制劑對蛋白酶的耐受性。(5)飼料調質過程對酶制劑活性的影響(耐高溫測定)測定酶樣品的水分含量，根據酶樣品中水分含量通過加蒸餾水調節待測酶樣品中的水分至16% (實際調質和制粒時配合飼料通入蒸汽后的濕度)，然后在烘箱中(溫度一般設置為651、751、851、901、951等5個溫度梯度)放置一定時間后取出冷卻備用。通過單酶酶活測定方法測定酶活力，測定不同溫度處理后酶樣品活性與標示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )。以此可評估酶樣品的耐高溫性(％ )。(6)三個月酶活存留率測定酶制劑從生產之日起開始計算，常溫貯存三個月后再取樣，按照酶制劑酶活測定方法測定酶活，結果與標示酶活相比，得到其三個月常溫貯存后的酶活存留率(％ )。2.有效營養值評估操作方法根據Bedford和Classen (1993)的方法稍作修改。具體操作如下準確稱取1.25g粉碎(過Imm篩)飼料樣品于三角瓶中，分別加入不同梯度外源酶制劑后，再加入lmg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液(0. IN, pH = 2. 0)，在40°C恒溫水浴鍋中振蕩，消化時間為池。胃消化階段結束后，向溶液中加入ImL新鮮胰酶溶液(5mg/mL)，調節溶液pH值為 6. 5(1M NaOH溶液)，于40°C恒溫水浴中振蕩，消化時間為4h。同時以未加酶飼料為對照組， 進行同樣的消化程序。體外消化結束后，將試管取出于3000g離心15min，取上清液測定其粘度。消化殘渣在烘箱中烘至恒重，測定其能量。粘度變化(％ )=加酶組食糜粘度/對照組食糜粘度*100 (飼料粘度測定)能量變化(％ )=加酶組消化能/對照組消化能*100 (飼料能值測定)例證下面以酶活相同的兩種木聚糖酶(A 2. 40X 105U/g，B :2. 37X 105U/g)為例，闡釋 0ΕΑ 體系中“有效酶活”評估的必要性和重要性，以此說明0ΕΑ 體系的優點。1.酶活單位定義酶活單位定義采用國際標準，即在pH5. 5和37°C條件下，每分鐘內從燕麥木聚糖底物溶液(SigmaX0627，1. 0% )中降解釋放1 μ mol還原產物所需要的酶量，定義為一個酶活單位。酶活測定按照陸文清等000 提供的方法進行。2.酶制劑耐酸性試驗從圖1可以看出，在所有測定的PH值條件下，兩種木聚糖酶活性存留率均保持在 50%以上，但木聚糖酶B活性存留率高于木聚糖酶A。木聚糖酶A在pH 5. 5時有一個高峰值，高于和低于此PH值，酶活均降低。而木聚糖酶B在不同pH值條件下，活性變化較為緩和，酶活存留率均在80%以上。3.飼料調質模擬試驗從圖2中可以看出，木聚糖酶A和B的活性隨著調質溫度升高而降低，特別是調質溫度高于85°C時，二者活性均迅速降低到50%以下；但溫度低于85°C時，木聚糖酶活性存留率均較高，且木聚糖酶B的活性存留率在所有測定溫度下均高于木聚糖酶A。4.胃蛋白酶/胰酶耐受性試驗本試驗中木聚糖酶B活性不受消化道中胃蛋白酶/胰酶的影響，而木聚糖酶A在胃蛋白酶/胰酶作用下活性降低了 20% (圖幻。由此可見，二者對于內源蛋白酶的耐受性有較大差異，以相同量添加于飼料中，木聚糖酶B的作用效果會更顯著。5.木聚糖酶對飼料粘度的影響飼料配方中高含量的阿拉伯木聚糖最顯著的特點就是提高了食糜的粘滯性，而木聚糖酶則可以將木糖聚合物分解成短鏈，降低食糜粘度并釋放被其包裹的營養物質。試驗中分別測定了兩種木聚糖酶對小麥和豆粕粘度的影響，發現木聚糖酶B對小麥和豆粕粘度的降低程度要優于木聚糖酶A (圖4)，其中飼料中添加木聚糖酶A，小麥和豆粕粘度分別降低了 3. 77%和3. 57% ；而飼料中添加木聚糖酶B，小麥和豆粕的粘度則分別降低了 9. 18% 和 5. 00%。從以上試驗數據可以看出，木聚糖分子結構的復雜性決定了在選擇木聚糖酶時， 僅僅通過酶制劑標示活性這一單一指標是遠遠不夠的，以模擬調質過程和體外模擬消化技術為手段，綜合考察酶制劑高溫穩定性、耐酸穩定性、對內源蛋白酶降解作用的耐受性以及對飼料的降解程度，才能更準確的選擇和合理利用酶制劑。發明特點0ΕΑ 體系的建立與提出最大程度上解決了現在飼用復合酶應用過程中出現的六大問題，從復合酶原料選擇、配方優化和加工工藝三個關鍵控制點提出相應標準，初步改變了飼用酶制劑應用效果不明顯的弊端。0ΕΑ 體系首次在實驗室條件下通過體外模擬消化技術評估復合酶效果并將評估結果用于指導實際生產，開創出一條復合酶應用研發的新思路。根據大量的試驗例證，歸結出0ΕΑ 體系的特點定量、個性化、動態性。0ΕΑ 復合酶針對性強量身訂做。針對各企業飼料配方、飼料加工工藝和飼料產品適用動物及其生理階段，改變了現存市場酶制劑產品“泛泛而談”的現狀；0ΕΑ 復合酶適用性好動態化調整。隨著飼料配方調整而調整復合酶配方，保證復合酶作用效果的一致性，改變了現存市場酶制劑產品“僵化”的現狀；0ΕΑ 復合酶性能顯著效果可重復。通過實驗室評估試驗，可以預測酶制劑作用效果(能量、粘度及蛋白質消化利用率等)，為飼料配方的調整與飼料配方成本下降提供科學依據，改變了現存市場酶制劑產品“純粹經驗化”的現狀；0ΕΑ 復合酶性價比高成本經濟。0ΕΑ 單酶性能優良，復合酶酶譜全面、科學、經濟，有效降低復合酶添加成本，改變市場酶制劑產品“投入產出較差”的現狀。具體應用下面結合應用實例詳細介紹本發明，所述的實例用來理解而并非限制本發明。目前飼用酶制劑應用過程中存在以下六方面的問題(1)有效酶活不清晰；(2)有效營養值模糊；C3)針對性不強；(4)添加不定量；(5)效果不明顯；(6)成本不經濟。針對以上六大問題，本發明通過“有效酶活”和“有效營養值”的評估手段，提供的復合酶方案可完全解決上述問題。“有效酶活”評估包括六個方面⑴標示酶活測定；(2)耐高溫性測定；⑶常溫貯存酶活損失測定；閾值測定；( 耐酸性測定；(6)耐蛋白酶測定。“有效營養值”評估包括四個方面⑴粘度改善測定；(2)能值變化測定；(3)蛋白質消化率變化測定；(4)動物生產性能改善評估。通過以上流程和方法制作的0ΕΑ 復合酶方案已經與市場常見復合酶產品做過多次動物飼養對比試驗。試驗結果表明與對照產品相比，0ΕΑ 復合酶針對性強，效果穩定， 一般飼料效率可改善0. 05-0. 1，極大提高養殖戶效益。通過0ΕΑ 這一評估體系制作的飼用復合酶不僅可有效改善動物生產性能，同時還可降低糧食作物在飼料中的使用量，提高非常規原料在飼料中的應用，改善人畜爭糧的緊張局面。畜禽飼料中添加0ΕΑ 復合酶后一般可提高動物飼料能值1. 0-3. 0%，以畜禽飼料平均能值為^OOKcal/kg計算，則添加0ΕΑ 復合酶后可提高飼料能值^-84Kcal/kg，提高的能量如果全部用來替換玉米(玉米代謝能按照3300Kcal/kg計算)，則每噸飼料可降低玉米用量8. 5-25. 5kgo中國年產飼料總量按照1. 5億噸，其中加酶飼料0. 45億噸計算，每年可降低飼料中玉米用量36萬-112. 5萬噸。這可極大緩解目前糧食產量降低而需求量日益增加的緊張局面，也有助于扭轉糧食進口的貿易逆差。本發明以新的思路和方法解決了飼用酶制劑應用過程中出現的問題。經試驗驗證，0ΕΑ 復合酶針對性更強、成本更經濟。
權利要求
1.一種最佳酶制劑應用體系(0ΕΑ )，其特征在于，包括兩方面的內容有效酶活評估和有效營養值評估。
2.如權利要求1所述的酶制劑應用體系，其特征在于，有效酶活評估包括6個指標標示酶活、PH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個月酶活存留率；有效營養值評估包括4個指標飼料粘度測定、飼料能值測定、飼料蛋白質消化率測定、動物生長表現。
3.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，標示酶活的測定方法為取一定量酶樣品溶液，用PH 5. 5的0. lmol/L的NaAc-HAc緩沖溶液溶解后定容至IOOmL,然后根據酶活將樣品溶液稀釋適當倍數，使稀釋好的待測酶液中酶活力控制在0. 04-0. 08U/mL之間；再將稀釋好的酶液和配制好的底物溶液在37°C水浴30min后，加DNS試劑終止酶的反應，沸水浴5min，冷卻定容；標準空白調零，用分光光度計在540nm下測定吸光值，最后根據吸光值計算酶活。
4.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，pH閾值測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液溶解，測定其活性，測定酶活結果與原始酶活相比，得到其在不同pH值條件下的酶活表現(％ )；不同PH值緩沖液梯度設置為2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、 6. 0,6. 5,7. 0 ；也可根據不同動物消化道不同消化位點的消化液pH值而設定。
5.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，過胃酸測定方法為將單酶用不同PH值緩沖液在37°C條件下處理1. 5h或池后測定其活性，測定酶活結果與標示酶活相比，得到其酶活性存留率(％ )；不同PH值緩沖液梯度設置為2. 0,2. 5,3. 0,3. 5 ；以此可得到胃中酸性環境對酶樣品活性的破壞程度(％ )。
6.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，過蛋白酶測定方法為配制單酶樣品溶液，取等量的酶液和胃蛋白酶液及胰酶溶液在37°C條件下水浴2-4h，之后將經過蛋白酶處理的單酶樣品溶液按照單項酶制劑酶活測定方法測定其酶活，測定酶活結果與標示酶活相比，得到其酶活性存留率(％)，以此確定外源酶制劑對蛋白酶的耐受性。
7.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，耐高溫測定方法為測定酶樣品的水分含量，根據酶樣品中水分含量通過加蒸餾水調節待測酶樣品中的水分至16 %，然后在烘箱中放置一定時間后取出冷卻備用，烘箱溫度設置為65°C、75°C、85°C、90°C、95°C等5 個溫度梯度；通過單酶酶活測定方法測定酶活力，測定不同溫度處理后酶樣品活性與標示酶活相比，得到其酶活存留率(％ )，以此可評估酶樣品的耐高溫性(％ )。
8.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，三個月酶活存留率測定方法為 酶制劑從生產之日起開始計算，常溫貯存三個月后再取樣，按照酶制劑酶活測定方法測定酶活，結果與標示酶活相比，得到其三個月常溫貯存后的酶活存留率(％ )。
9.如權利要求2所述的酶制劑應用體系，其特征在于，飼料粘度測定和飼料能值測定方法為準確稱取1. 25g粉碎飼料樣品于三角瓶中，所述粉碎飼料過Imm篩，分別加入不同梯度外源酶制劑后，再加入lmg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液，所述胃蛋白酶鹽酸溶液為0. IN 并且pH = 2. 0，在40°C恒溫水浴鍋中振蕩，消化時間為池；胃消化階段結束后，向溶液中加入ImL新鮮胰酶溶液，所述胰酶溶液為5mg/mL，調節溶液pH值為6. 5 (1M NaOH溶液)，于 40°C恒溫水浴中振蕩，消化時間為4h ；同時以未加酶飼料為對照組，進行同樣的消化程序； 體外消化結束后，將試管取出于3000g離心15min，取上清液測定其粘度；消化殘渣在烘箱中烘至恒重，測定其能量；飼料粘度變化(％ )=加酶組食糜粘度/對照組食糜粘度*100 ；飼料能值變化(％ )=加酶組消化能/對照組消化能*100。
全文摘要
一種最佳酶制劑應用體系(OEATM)，包括兩方面的內容有效酶活評估和有效營養值評估。有效酶活評估包括6個指標標示酶活、pH閾值、過胃酸測定、過蛋白酶測定、耐高溫測定、三個月酶活存留率；有效營養值評估包括4個指標飼料粘度測定、飼料能值測定、飼料蛋白質消化率測定、動物生長表現。本發明以新的思路和方法解決了飼用酶制劑應用過程中出現的問題。經試驗驗證，OEATM復合酶針對性更強、成本更經濟。
文檔編號C12Q1/00GK102242180SQ20111009922
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年3月22日
發明者唐茂妍, 孫鳴, 徐玲, 王海彥, 王紀亭, 陳旭東 申請人:北京華美源生物科技有限公司