專利名稱：兩種大豆病菌的pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒及檢測方法，特別是一種大豆南方莖潰瘍病菌(DPM) 和大豆北方莖潰瘍病菌(DPC) PCR檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
大豆南方蓬饋蕩病菌(々ia/7oriAe phaseolorum (Cke. & Ell. ) Sacc. var. meridionales Morgan-Jones,簡禾爾 DPM)禾口大豆;!匕方蓮？貴蕩病菌phaseolorum (Cke. & Ell. )var. caulivora Athow & caldwell，簡稱 DPC)是我國進境植物檢疫性有害生物。由于這兩種病害近年來在國外發生普遍、經濟影響大、傳入風險高且在我國無發生報道，被國內有關專家定為大豆上7種危險性真菌病害。DPM、DPC在美國、巴西、阿根廷等大豆生產國發生面積大，引起的產量損失曾高達100%。我國是種植和進口大豆的大國，每年都收割和進口大量的大豆。大豆在我國分布很廣，常年種植面積占糧食耕地面積的8—10%，僅次于水稻、小麥、玉米，在國民經濟中占有重要地位。而我國進口大豆中95%以上來自美國、 巴西、阿根廷和烏拉圭，2010年我國進口大豆總量竟達MOO多萬噸，依存度也從2000年的 48. 1% 增至 2007 年的 78. 7%。由于傳統的形態學鑒定時間長，操作步驟復雜、繁瑣，僅分離菌株后的純培養時間就長達40-60天，給快速、準確診斷該兩種病菌帶來了困難。近幾年來，針對這兩種真菌普遍采用的診斷方法是形態學特征、PCR — RFLP、熒光PCR檢測方法及測序，但很明顯，PCR— RFLP、熒光PCR檢測花費都很高。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種能實現快速、準確、 花費低，便于推廣應用的大豆南方莖潰瘍病菌(DPM)和大豆北方莖潰瘍病菌(DPC)PCR檢測
試齊U盒。本發明所要解決的另一個技術問題是提供用以上所述的檢測試劑盒進行檢測的方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌PCR檢測試劑盒，其特點是，它由下列物品構成
1)、陰性對照，成份為ImL滅菌雙蒸水1支；
2)、陽性對照，試劑成份為溶于ImL滅菌雙蒸水中IOOng的DPM菌株DNA1支；
3)、陽性對照，試劑成份為溶于ImL滅菌雙蒸水中IOOng的DPC菌株DNA1支；
4)、dNTP1 支；
5)、不含Mg2+的PCR緩沖液1支；
6)、含Mg2+的緩沖液1支；
7)、引物對DPMF3/DPMI 2
DPMF3為5， -CCGAAACTCTGAGCAAAAAACAC-3，1支；
權利要求
1. 一種大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌PCR檢測試劑盒，其特征在于，它由下列物品構成1)、陰性對照，成份為IrnL滅菌雙蒸水1支；2)、陽性對照，試劑成份為溶于ImL滅菌雙蒸水中IOOng的DPM菌株DNA1支；3)、陽性對照，試劑成份為溶于ImL滅菌雙蒸水中IOOng的DPC菌株DNA1支；4)、dNTP1 支；5)、不含Mg2+的PCR緩沖液1支；6)、含Mg2+的緩沖液1支；7)、引物對DPMF3/DPMI 2DPMF3為5， -CCGAAACTCTGAGCAAAAAACAC-3，1支；DPMR2為5’ -CCTGGCGAGCCCGCCACTAG-3’1支；8)、引物對DPCF4/ DPCR2DPCF4為5， -GCCCCCTTGGGGGCCCCCC-3，1支；DPCR2 為5’ -TCCTGGCGAGCTCGCCAATGA-3’ 1 支；9)、DNA聚合酶1支；10)、滅菌雙蒸水1支；11)、包裝盒子，一塊泡沫板，其大小與包裝盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數量的小孔，上述各小管分別對應放置于這些小孔中； 將陽性對照單獨存放；試劑盒于-20°C保存。
2. 一種大豆南方莖潰瘍病菌(DPM)、大豆北方莖潰瘍病菌(DPC)的PCR檢測方法，其特征在于應用權利要求1所述試劑盒；每次檢測其中一種病菌；檢測時，只用其中一種病菌的特異性引物對；檢測前準備以下試劑DNA提取用CTAB裂解液，氯仿，異戊醇，異丙醇， 70%乙醇，超純水或TE溶液；檢測步驟如下(1)DNA模板的提取將5-10克菌株或碾磨成粉的植物病組織樣品放入1.5mL離心管中，加入600 μ 1 CTAB裂解液于65°C下水浴30min ；取出后加入等體積的體積比為M :1的氯仿異戊醇，顛勻后，12000-15000 r/min離心IOmin ；取上清后再加入等體積的體積比為 24 1的氯仿異戊醇，顛勻后，12000-15000r/min再離心IOmin ；取上清加入等體積的異丙醇溶液顛勻后，12000-15000r/min離心IOmin ；棄上清，取沉淀，加入400 μ 1的70%乙醇溶液后，12000-15000r/min離心5min ；去上清，自然風干，加入50 μ 1的超純水或TE溶液，得 DNA模板，-20°C下保存備用；(2)PCR預混合液的配制，分別采用以下方法 ①擴增DPM的PCR預混合液的配制使用前將試劑盒中需用試劑離心數秒鐘后，按下列術式加入各種成分，除DNA模板外的各試劑預先加入混合好后，最后加入提取的DNA模板、陽性對照或陰性對照，加DNA模板的區域與加入其它試劑的區域分開，總體積為50μ 1 ； PCR預混合液加入術式 dNTP4 μ 1不含Mg2+的PCR緩沖液5 μ 1含Mg2+的緩沖液5μ1引物對 DPMF3/DPMI 24μ 1DNA聚合酶0. 5 μ 1滅菌雙蒸水26. 5-29. 5 μ 1DNA模板或陽性對照或陰性對照2-5 μ 1總體積50 μ 1 ②擴增DPC的PCR預混合液的配制使用前將試劑盒中需用試劑離心數秒鐘后，按下列術式加入各種成分，除DNA模板外的各試劑預先加入混合好后，最后加入提取的DNA模板、陽性對照或陰性對照，加DNA模板的區域與加入其它試劑的區域分開，總體積為50μ 1 ； PCR預混合液加入術式
全文摘要
本發明是一種PCR檢測大豆南方莖潰瘍病菌(DPM)和大豆北方莖潰瘍病菌(DPC)試劑盒及檢測方法。該試劑盒及檢測方法是根據DPM、DPC兩種植物病原真菌ITS區域序列分別設計合成了一對特異性引物，應用PCR技術對提取的DNA進行擴增，分別擴增出270bp和339bp的PCR片段，研制了陽性質控對照，可對兩種真菌進行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高，可用于進出境大豆攜帶DPM、DPC的檢測和國內外大豆種植區的DPM、DPC疫情監測，及時對發生的疫情進行防治，具有很大的推廣價值和實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102154501SQ201110094960
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者劉翔, 吳新華, 楊萬風, 段宏安, 祝秀麗, 秦國勛 申請人:中華人民共和國連云港出入境檢驗檢疫局