專利名稱：沙冬青抗旱基因的篩選方法
技術領域：
本發明涉及基因的篩選方法，尤其涉及一種沙冬青抗旱基因的篩選方法。
背景技術：
非生物脅迫是現代農業的嚴重危害，特別是干旱，成為影響農業的最重要的因素之一。近年來，由于我國工業發展迅速，環境遭到污染，溫室效應日趨嚴重。隨著溫度的不斷升高及沙漠化擴大的影響，我國農業受到了干旱的嚴重的影響。目前我國有超過50%的可耕種農地受到干旱影響，有20%的可耕種農地的旱情嚴重。即使是在降水量較多的華中及其華南地區，由于降水量分布不均勻，這些地區的農作物比如水稻幾乎每年都在揚花的關鍵時期受到干旱影響，從而直接影響產量，旱情嚴重的甚至顆粒無收；而我國北方大部分地區，本來降水量就偏低，再加上日趨嚴重的旱情，農業的發展狀況更是不容樂觀。我國作 為農業大國，供養著接近世界人口的四分之一的人口，因此農業對于我國乃至全世界都是重中之重。對于抗旱，世界各種的植物學研究工作者們一直將其作為重點研究課題，為此做了大量的工作，也取得了長足的進步。目前，對于植物抗旱，一般傾向于篩選抗旱基因，然后采用抗旱基因進行抗旱植株育種的方式得到抗旱性好的植株，因而通過篩選，獲得良好的抗旱基因就成為抗旱育種的關鍵。
發明內容
本發明的目的在于克服上述不足，提供一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，它能夠迅速有效地篩選出沙冬青的抗旱基因。為了達到上述技術目的，本發明采用以下技術方案一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，包括以下步驟I)取干旱處理的沙冬青2)采用2 X CTAB的方法提取RNA3) RNA 純化4)反轉錄合成cDNA5)高通量測序6)獲取差異表達序列7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因。沙冬青具有很低的水勢和蒸騰強度，而束縛水含量很高，沙冬青不但水勢低，吸水能力很強，而且從葉到莖都具有抑制蒸騰失水的旱生結構。可見沙冬青抗旱性優秀，選用沙冬青來篩選抗旱基因，能夠獲得優良的抗旱基因。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述沙冬青的種子使用70%體積比的乙醇浸泡，然后用10%質量比的次氯酸鈣消毒后，使用無菌水沖洗。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，步驟2)提取RNA經過以下流程
(I)將沙冬青真葉或莖段于-20°C研磨成粉，加入預熱65°C的緩沖液，震蕩，于65°C水浴(2)加入苯酚/氯仿/異戊醇，于4°C離心，取上清(3)加入 LiCl，-20°C放置(4)棄上清，70 %體積比乙醇漂洗沉淀(5)除去乙醇，加入無水乙醇_20°C放置(6)于4°C離心，采用DEPC處理的水溶解沉淀(7)瓊脂糖凝膠電泳，電壓檢測，-70°C貯藏。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟(2)、(3)重復兩次。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟5)測序后進行污染分析，隨機選取若干條讀長組裝后，于NCBI NR數據庫進行比對。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟5)測序后使用DNASTARNGEN軟件將測序結果和野生型測序結果進行組合組裝。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟6)中將獲得差異表達基因進行初步篩選，選取差異表達4倍以上的基因。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟6)、7)中應用DNASTAR:ArrayStar軟件對轉錄組進行了差異表達分析。本發明相比現有技術具有以下優點(I)本發明沙冬青抗旱基因的篩選方法，選用沙冬青來篩選抗旱基因，能夠獲得優良的抗旱基因。(2)本發明沙冬青抗旱基因的篩選方法，對沙冬青的轉錄組進行分析以篩選抗旱基因，能夠全面、準確地篩選出優良的抗旱基因。
圖I為野生型沙冬青測序結果污染鑒定2為本發明干旱處理沙冬青測序結果污染鑒定圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明進行進一步的說明本發明沙冬青抗旱基因的篩選方法較佳依次含有以下步驟I、實驗材料處理選用取自于內蒙古阿拉善沙漠地區沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)種子作為實驗材料。沙冬青種子在不使用的情況下于4°C密封保存。對于本文中使用的實驗材料，首先將存放于4°C冰箱的沙冬青種子取出，在超凈工作臺中，使用70%的乙醇將其浸泡30s，然后用10%次氯酸鈣消毒20min后,使用無菌水沖洗3_5次,之后將其播種于MS固體培養基上，培養一個月，將幼苗從培養基中取出移栽，生長一個月后，干旱缺水一個月，然后收集它們的葉片與莖段，將其置于液氮中，然后放入_80°C冰箱中保存備用。2、RNA 提取RNA的提取采用2XCTAB的方法。RNA提取試劑見表I、表2。RNA提取流程如下、
(I)取0. 2g干旱處理的沙冬青真葉及莖段放入在_20°C預冷的研缽中，液氮中研磨成粉，加事先經65°C預熱的RNA提取緩沖液800 ill。震蕩，65°C水浴5min，震蕩3次。
(2)將離心管從水浴中取出，冷卻至室溫，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩IOmin0 4°C, 12000rpm 離心 lOmin。(3)取上清，氯仿/異戊醇重復抽提一次。(4)取上清，加入 1/5 體積 10mmol/L 的 LiCl，_20°C放置 lh。(5) 4°C, 12000rpm 離心 20min。
(6)棄上清，吸干凈底部殘留的液體。(7) 400 u I DEPC 水溶解沉淀，再加入 1/5 體積 10mmol/L 的 LiCl，_20°C放置 lh。(8)4°C，12000rpm離心15min，棄上清，70%乙醇漂洗沉淀2-3次。(9)4°C, 12000rpm離心IOmin,除去乙醇,于室溫通風櫥中自然風干,約15min。(10)將溶液轉至I. 5mL的離心管中，加2倍體積預冷的無水乙醇，_20°C放置3h。(11)于 4°C, 12000rpm 離心 20min。(12) 20 u L DEPC處理的水溶解沉淀。(13) I %瓊脂糖凝膠電泳，120V電壓檢測。-70°C貯藏備用。表I 2 X CTAB RNA提取緩沖液
權利要求
1.一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟 1)取干旱處理的沙冬青 2)采用2X CTAB的方法提取RNA 3)RNA純化 4)反轉錄合成cDNA 5)高通量測序 6)獲取差異表達序列 7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因。
2.根據權利要求I所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述沙冬青的種子使用70%體積比的乙醇浸泡，然后用10%質量比的次氯酸鈣消毒后，使用無菌水沖洗。
3.根據權利要求I所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟2)提取RNA經過以下流程 (1)將沙冬青真葉或莖段于-20°C研磨成粉，加入預熱65°C的緩沖液，震蕩，于65°C水浴 (2)加入苯酚/氯仿/異戊醇，于4°C離心，取上清 (3)加入LiCl，-20°C放置 (4)棄上清，70%體積比乙醇漂洗沉淀 (5)除去乙醇，加入無水乙醇_20°C放置 (6)于4°C離心，采用DEPC處理的水溶解沉淀 (7)瓊脂糖凝膠電泳，電壓檢測，-70°C貯藏。
4.根據權利要求3所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)、(3)重復兩次。
5.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟5)測序后進行污染分析，隨機選取若干條讀長組裝后，于NCBI NR數據庫進行比對。
6.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟5)測序后使用DNASTAR NGEN軟件將測序結果和野生型測序結果進行組合組裝。
7.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟6)中將獲得差異表達基因進行初步篩選，選取差異表達4倍以上的基因。
8.根據權利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟6)、7)中應用DNASTAR =ArrayStar軟件對轉錄組進行了差異表達分析。
全文摘要
本發明提供一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其包括以下步驟1)取干旱處理的沙冬青，2)采用2×CTAB的方法提取RNA，3)RNA純化，4)反轉錄合成cDNA，5)高通量測序，6)獲取差異表達序列，7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因；本發明采用沙冬青進行轉錄組分析，篩選沙冬青抗旱基因，對抗旱植株育種具有重要指導意義。
文檔編號C12N15/10GK102732527SQ20111009351
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月14日 優先權日2011年4月14日
發明者夏新莉, 尹偉倫, 龐濤, 郭麗麗 申請人:北京林業大學