專利名稱：一種螢火蟲熒光素酶的編碼基因及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子酶學與生物技術，更具體涉及一種高熱穩定性及高酶活螢火蟲熒光素酶的編碼基因，同時涉及該突變株編碼基因的制備方法。該突變基因編碼的高熱穩定性及高酶活螢火蟲熒光素酶突變株蛋白的用途，螢火蟲熒光素酶的編碼基因可以廣泛應用于食品、醫藥及生物等領域。
背景技術：
熒光素酶是現今生物領域中最重要的工具酶之一，北美螢火蟲熒光素酶是其中應用較廣泛的熒光素酶，其由于不需要激發光源，發光能量主要來自化學反應并且發光可持續一定的時間得到科研，醫藥及食品行業的青睞。在科研領域，螢火蟲熒光素酶較突出的應用在于它可以作為報告基因來使用。其內源性低，哺乳動物無內源性表達；熒光素酶檢測不受其他物質的影響；采用發光檢測，簡單易操作；并且檢測靈敏度高，檢測范圍廣。還可用于細胞增殖，細胞毒性檢測等其他方面的應用。在醫藥行業，特別是在做新型藥物篩選方面，很多公司都采用螢火蟲熒光素酶來篩選新型藥物，可以實現快速，便捷，高通量的篩選，大大提高了工作效率，節省了時間，對于新藥物的篩選有著很大的貢獻。在食品衛生行業，螢火蟲熒光素酶同樣有著重要的作用。由于螢火蟲熒光素酶其中一個底物是ATP，而ATP是細胞能量的直接來源，存在于從微生物到高等動植物細胞的所有生物體中，通過ATP的測定可以直接反應細胞或微生物的含量。2005年，衛生部發布的 《衛生監督機構建設指導意見》中規定省、市、縣三級衛生監督機構必須配備ATP熒光檢測儀，用于食品衛生和醫療衛生的現場檢測。雖然螢火蟲熒光素酶存在著重要的應用價值，但由于該酶自身存在的熱穩定性差，抗蛋白酶降解功能較差的缺陷，故有很多針對提高螢火蟲熒光素酶穩定性或酶活方面的改造，以期更好的發揮和實現螢火蟲熒光素酶的功能和作用。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種螢火蟲熒光素酶的編碼基因，具有SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變體酶，該突變酶具有SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列。在北美螢火蟲firefly Iuciferase基因中通過overlap PCR引入突變，連接于表達載體，生產高熱穩定性及高酶活特性的FIREFLYLUCIFERASE突變酶，該突變酶的發光強度是野生型的15-20倍左右，并且較野生型具有良好的熱穩定性。本發明的另一個目的是在于提供了一種高熱穩定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白的制備方法，該方法是構建原核表達載體，利用親和層析方法純化高酶活高熱穩定性的螢火蟲熒光素酶，該方法簡單易行，操作簡便，成本低廉。本發明還有一個目的是在于提供了一種高熱穩定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白在食品、醫藥上的應用，其中一個比較重要的應用就是利用該突變酶在菌體檢測中的應用。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施本發明的一個目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高熱穩定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其特征是在野生型 firefly Iuciferase基因上具有1060位由G突變為A，1267位由A突變為T，1307位由A 突變為G，1589位由T突變為G的4個點突變。一種高熱穩定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白的編碼基因的制備方法，其步驟是1.突變酶 FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L, D436G, L530R 突變位點的引入(1)設計兩組誘變引物，采用overlap-PCR的方法將實驗室購買的!Iomega公司的 pGL3-Basic Vector質粒上的野生型firefly Iuciferase (源于北美螢火蟲)基因1060位由G突變為A，1267位由A突變為T，1307位由A突變為G，1589位由T突變為G ；其中第一次用一組誘變引物引入1267位，1307位及1589位的突變；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，通過購買的Promega公司的pGEMT-vector試劑盒連接載體，將連接產物pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R轉化大腸桿菌 DH5 α 感受態細胞，獲得 DH5 α -pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G, L530R ；2.鑒定重組質粒 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R 將上述轉化獲得的菌經過培養后用OMEGA公司的質粒抽提試劑盒提取質粒 pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G，L530R，通過酶切進行鑒定，并測序檢驗，待測序驗證正確后再進行下一輪突變位點的引入；3.以測序正確的 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R 質粒為模板， 再通過overlap-PCR的分子生物學方法(是一種技術方法)獲得帶有1060位突變位點的 PCR片段；4.將PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BioI及EcoRI進行酶切，經過相同酶切的質粒pET28a(實驗室保存，最早購自^witrogen公司)片段連接后，轉化實驗室自己制備的大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得大腸桿菌菌株DH5 α -pET28a-firefIy luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R ；5.鑒定重組質粒 pEI^8a-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R 將上述轉化獲得的菌經過培養后用OMEGA公司的質粒抽提試劑盒提取質粒pET28a-firefly luciferase-E354K, I423L，D436G，L530R用酶切的方法進行鑒定，并測序驗證，由此得到一種改造的高熱穩定性及高酶活性突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。本發明所述的編碼高熱穩定性及高酶活螢火蟲熒光素酶突變株蛋白的基因 firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R，具有 SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列， 有以下特征1.本發明所用的firefly Iuciferase基因來自北美螢火蟲，長度為1650bp。2.具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結構基因上具有4處點突變，即1060位由G突變為A，1267位由A突變為T，1307位由A突變為G，1589位由T
4突變為G。本發明要求保護的高熱穩定性及高酶活螢火蟲熒光素酶突變株蛋白可用如下方法生產。該方法包括以下具體的操作按照常規實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版社中所述的條件進行。1.突變酶 FIREFLYLUCIFERASE-E3MK，I423L, D436g, L530R 突變位點的引入(1)設計兩組誘變引物，采用overlap-PCR的方法將野生型firefly Iuciferase 基因上1060位由G突變為A，1267位由A突變為T，1307位由A突變為G，1589位由T突變為G ；其中第一次用一組誘變引物引入1267位，1307位及1589位的突變；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，通過購自Promega公司的pGEMT-vector 試劑盒連接載體，轉化實驗室自己制備的大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得 DH5α -pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G, L530R ；2.鑒定重組質粒 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G, L530R 將上述轉化獲得的菌經過培養后用OMEGA公司的質粒抽提試劑盒提取質粒 pGEMT-fireflyluciferase-I423L, D436G，L530R，通過酶切進行鑒定，并測序檢驗，待測序驗證正確后再進行下一輪突變位點的引入；3.以測序正確的 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R 質粒為模板， 再通過overlap-PCR的方法(一種實驗方法)獲得帶有1060位突變位點的PCR片段；4.將PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BioI及EcoRI進行酶切，與經過相同酶切的質粒pET28a(實驗室保存，購自^witrogen公司)片段連接后，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞(實驗室自己制備)，獲得大腸桿菌菌株DH5 α -pET28a-firefIy luciferase-E354K, I423L, D436g, L530R ；5.鑒定重組質粒 pEI^8a-f iref Iy luciferase_E354K，I423L, D436g, L530R 用酶切的方法進行鑒定，并測序驗證，由此得到一種改造的蛋白基因，一種分離的高熱穩定性及高酶活性突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；6.培養大腸桿菌 DH5 α-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R，提取重組質粒 pET28a-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R ；7.將重組質粒 pET28a_firefly luciferase_E354K，I423L，D436G，L530R 轉化 BL21(DE3)感受態細胞，得到可以表達突變酶 FIREFLY LUCIFERASE-E354K, I423L, D436G, L530R的菌株；8.將上述獲得的BL21(DE3)表達菌株進行放大培養，按照1 100的轉接比例將其轉入到500ml的LB液體培養基中，同時按照1 1000的比例添加卡納抗生素(原液濃度為50mg/ml)，于37°C搖床培養至對數生長期后添加誘導物IPTG至終濃度為0. 5mM,于16°C 低溫搖床誘導過夜；9.將500ml表達蛋白的菌液4°C，8000rpm離心8min進行集菌，再通過超聲破碎，離心獲取上清，通過親和層析使用GE Healthcare的AKATApurifier蛋白純化儀及GE Healthcare公司的HisiTrap FF crude columns進行柱純化，由此得到一種改造的蛋白，一種分離的蛋白，其序列為SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列，即高熱穩定性及高酶活的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白；10.用Pierce公司生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度的測定，以BSA作標準曲線。蛋白定量后配制0. lmg/ml的蛋白液，以!Iomega公司的E1500熒光素酶檢測試劑盒進行發光測定，測定體系為IOul 0. lmg/ml的蛋白液，30ul pH7. 4、50mMTris-Hcl、
IOmM MgCl2的緩沖液以及IOul的底物混合液，使用!Iomega測定發光的儀器GloMax'
20/20Luminometer進行發光測定。按照以上方法可以檢驗本發明要求保護的突變酶的活性。純度檢測可以用 SDS-PAGE方法檢測。注以上提到的LB培養基配方如下LB培養基(L—1):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g。本發明獲得的高熱穩定性及高酶活性的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白在食品，醫藥及生物相關領域有著廣泛的應用。螢火蟲熒光素酶在環境微生物檢測中的作用主要可以用于食品中微生物的殘留，餐具潔凈度，消毒效果的檢測以及水中微生物含量等的測定。具體方法是，配置一系列的ATP標準品，利用底物反應液熒光素和螢火蟲熒光素酶測定以ATP為唯一變量的標準曲線，再將待測定的樣品經過裂解液的裂解釋放待測樣本中菌體的ATP，使其與配制好的檢測工作液，即熒光素、螢火蟲熒光素酶和緩沖液進行反應，根據標準曲線可以測得樣本中ATP 的含量，而ATP存在于所有的生物體內，可以作為生物體量的一個標準，從而獲知樣本中微生物的含量。螢火蟲熒光素酶有著較為廣泛的應用，在食品工業中可用于快速檢測菌體數是否達標；在醫藥行業中可以用于分子影像，醫學診斷；在生物領域中，可以用于細胞內報告基因及其他方面的研究。所述表達載體pET_28a和感受態細胞DH5a及BL21 (DE3)(均為實驗室保存， PET28a 質粒最早購自 hvitrogen)。所述的重組質粒 pET28a_firefIy luciferase_E354K， I423L，D436G，L530R為本發明所構建。所述的大腸桿菌菌株DH5 α -firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 是具有質粒 pEI^8a_firefIy luciferase-E354K, I423L，D436G，L530R的大腸桿菌菌株，保藏編號CCTCC NO. M2011062，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011. 3. 14，分類命名 Escherichia coli DH5 α -firefly luciferase_E354K，I423L，D436G，L530R。所述的編碼基因 firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 是具有 SEQUENCE NO. 1 的核苷酸序列的高熱穩定性及高酶活特性的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白編碼基因。所述的蛋白FIREFLY LUCIFERASE-E354K, I423L, D436G, L530R 是具有 SEQUENCE NO. 2 的氨基酸序列的高熱穩定性及高酶活特性的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白。上面所述的菌株均為實驗室常用工程菌株，均為大腸桿菌，大小在 0. 4-0. 7*l-3um，沒有芽孢，有普通菌毛與性菌毛，為革蘭氏陰性桿菌。大腸桿菌的合成代謝能力很強，最適生長溫度為37°C，為兼性厭氧菌，在有氧條件下生長良好，最適生長pH為 6. 8-8.0，所用LB培養基pH為7. 0-7. 5。其中DH5a為克隆菌株，用于質粒的有效擴增， BL2KDE3)為表達菌株，待其生長到對數期后添加誘導物IPTG后可進行目的蛋白的誘導表達。本發明的優點和效果本發明提供的FIREFLYLUCIFERASE突變株的核苷酸序列和蛋白質序列是一種FIREFLY LUCIFERASE高熱穩定性及高酶活特性突變株的基因和蛋白質序列，未見報道。本株FIREFLY LUCIFERASE突變株發光能力是野生型酶的20倍左右，并且具有很好的熱穩定性，符合實際應用的要求。螢火蟲熒光素酶在食品、醫藥及生物等領域有著廣泛的應用，是一種重要的工具酶，在同等條件下，高酶活的螢火蟲熒光素酶可以有效減低同一反應所需要的酶量，節約成本；同時，高熱穩定性的螢火蟲熒光素酶可以更好的滿足它的實際需要， 可以用于30°C以上的實際運用，比如用于生物傳感器需要很好的穩定性，而野生型的螢火蟲熒光素酶不能很好的滿足這樣的應用。
圖1為一種重組質粒的構建示意圖(1)用OMEGA公司的提質粒試劑盒抽提實驗室保存有firefly Iuciferase基因的質粒，用作后面overlap-PCR的模板；(2)設計兩組誘變引物，第一組誘變引物通過overlap-PCR用來引入1267位，1307 位及1589位的突變；(3)上述PCR產物經膠回收純化后，通過pGEMT-vector試劑盒連接T載體，轉化大腸桿菌 DH5a 感受態細胞，獲得 DH5 a-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R ；(4)鑒定重組質粒 pGEMT-firefIy luciferase_I423L，D436G，L53OR 通過酶切進行鑒定，并測序檢驗，待測序驗證正確后再進行下一輪突變位點的引入；(5)以測序正確的 pGEMT-f iref Iy luciferase_I423L，D436G，L530R 質粒為模板， 再通過overlap-PCR的方法獲得帶有1060位突變位點的PCR片段；(6)將PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BioI及EcoRI進行酶切，與經過相同酶切的質粒pET_28a片段連接后，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得大腸桿菌菌株 DH5 α -firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R。圖2為一種重組質粒的酶切鑒定，其中圖2(a)是重組質粒 pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G, L530R 的酶切鑒定結果；圖 2 (b)是重組質粒 pET28a-fireflyluciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 的酶切鑒定結果 (1 %瓊脂糖凝膠電泳)。如圖2(a)所示，使用酶切位點Ncol，NdeI進行重組質粒 pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G, L530R，獲得兩條片段，其中一條是與 firefly Iuciferase基因大小1650bp相對應，另一條為pGEMT載體的線性大小；圖2(b)所示的為第二輪overlap-PCR構建的重組質粒的鑒定，使用的酶切位點為EcoRI和BioI，同樣鑒定出陽性克隆，獲得最終所要的 pEI^8a-fireflyluciferase-E354K，I423L, D436G, L530R 重組表達載體。鑒定所用的酶切位點均為基因firefly Iuciferase上所不存在的。圖3為一種純化后的BL21 (DE3)菌株誘導表達產生的高熱穩定性及高酶活性的突變株蛋白(10% SDS-PAGE膠電泳檢測)示意圖螢火蟲熒光素酶分子量約為61KD，與電泳所示結果相符。圖4為一種與野生型的發光強度比較示意圖利用Promega公司的E1500Luciferase Assay System進行熒光測定，比較經過改造的螢火蟲熒光素酶與野生型的螢火蟲熒光素酶的發光強度。測定體系為50ul，其中包括 0. lmg/ml 的蛋白酶 10ul、Luciferase Assay System 不同梯度的底物 10ul、30ul pH 7.4的Tris-Hcl緩沖液，測定儀器為GloMax 20/20Luminometer,根據測得結果可以判斷，改造的螢火蟲熒光素酶發光強度提高了 20倍左右。圖5(a)為一種與野生型的不同水浴溫度下的熱穩定性比較示意圖將野生型螢火蟲熒光素酶與改造的熒光素酶分別在25°C，30°C，350C，40°C水浴鍋中水浴20min后置于冰上，待冷卻后同等條件下測定水浴后的熒光素酶發光情況，與水浴前的發光強度進行比較。野生型的在40°C水浴后發光強度降至原來的10%不到，而改造型的還可以有50%左右的發光強度。圖5(b)為一種與野生型37°C水浴不同時間后的熱穩定性比較示意圖將野生型螢火蟲熒光素酶與改造的熒光素酶分別在37°C水浴鍋中水浴5min， IOmin, 15min, 20min后置于冰上，待冷卻后同等條件下測定熒光素酶的發光情況，與水浴前的發光強度進行比較。野生型在5min后發光強度降至原來的20%左右，隨著水浴時間的加長，發光性能幾乎散失，而改造型的在水浴20min以后還可以保有超過50%的發光強度，這對熒光素酶可以用于固相免疫分析等有著重要意義。
具體實施例方式實施例1 一種高熱穩定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白的編碼基因的制備方法，其步驟是1. PCR模板的制備將實驗室現有的保存購自Promega公司的帶有firefly Iuciferase基因的 pGL3-Basic Vector質粒大腸桿菌菌株于固體LB活化，挑取單克隆于5mlLB液體培養基中 37°C搖床培養后，用OMEGA公司的質粒提取試劑盒抽提質粒，用作PCR的模板。2. Overlap PCR擴增獲得含有4個點突變的firefly Iuciferase片段(1)設計兩組誘變引物(誘變引物見表1)，以第一組誘變引物Al，Bi, Cl，Dl按照如下條件進行擴增以野生型熒光素酶基因為模板，引物Al，Bl擴增片段A1B1，按照 940C IOmin ；94°C lmin，63°C lmin，72°C lmin25sec，30 個循環；72°C IOmin 的擴增條件。引物 Cl，Dl 擴增片段 C1D1，按照 94°C IOmin ；94°C Imin, 65°C lmin，72°C 30sec，30 個循環； 72°C IOmin的擴增條件，PCR擴增產物經(質量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。將回收的兩種PCR產物AlB 1和ClD 1等摩爾比混合，加入上、下游引物A1，D1進行第二次 PCR，PCR 反應條件為94°C IOmin ；94°C lmin, 56°C 45sec，72°C lmin25sec，5 個循環；94°C lmin, 65°C lmin, 72°C lmin35sec，30 個循環；72°C IOmin0 PCR 擴增產物經瓊 脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點I423L，D436G，L530R的螢火蟲熒光素酶基因片段；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，通過pGEMT-vector試劑盒與T載體于16 °C 連接過夜，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用氨芐青霉素(Amp)-LB平板篩選得到陽性菌落，經過鑒定(見下一步驟)，命名為大腸桿菌DH5a-fireflyluciferase-I423L，D436G， L530R ；(3)鑒定重組質粒 pGEMT-firefIy luciferase_I423L，D436G, L530R 用 OMEGA 公司的質粒提取試劑盒抽提質粒pGEMT-E354K，I423L，D436G，L530R，用限制性內切酶NcoI和NdeI進行雙酶切鑒定，1 %瓊脂糖膠電泳檢查，結果產生約1. 7Kb和3Kb大小的兩條帶，如圖 2(a)，與預期大小相符。質粒上firefly luciferase_I423L，D436G, L530R基因的測序由華大基因生物技術有限公司進行。測序引物是利用購自Promega公司的質粒pGEMT上的通用引物5’M13F/ T7 和 3，SP6/M13R，測序結果表明獲得的 fireflyluciferase-I423L，D436G, L530R 基因序列與預期設計完全一致；(4)以測序正確的 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G, L530R 質粒為模板，以第二組誘變引物A2，B2, C2，D2按照如下條件進行擴增以 pGEMT-fireflyluciferase-I423L, D436G, L530R 質粒為模板，引物 A2，B2 擴增片段 A2B2， 按照 940C IOmin ；94°C Imin, 58. 5°C lmin，72°C 55sec，30 個循環；72°C IOmin 的擴增條件， 引物C2，D2擴增片段C2D2，擴增條件同片段A2B2。PCR擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。將回收的兩種PCR產物A2B2和C2D2混合，加入上、下游引物A2，D2進行第二次 PCR，PCR 反應條件為94°C IOmin ；94°C lmin，55°C 45sec，72°C 50sec，5 個循環；94°C lmin, 59°C lmin，72°C lmin35sec，30個循環；72°C IOmin0 PCR擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點E3MK，I423L，D436g，L530R的螢火蟲熒光素酶基因片段。(5)將PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BioI及EcoRI進行酶切，與經過相同酶切的質粒pET_28a片段16°C過夜連接后，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞， 于帶有卡納抗性(Kan)的LB平板上篩選陽性克隆，經過鑒定(見下一步驟)獲得大腸桿菌菌株 DH5 α-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R ； (6)鑒定重組質粒 pET28a-firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 用 OMEGA 質粒提取試劑盒抽提質粒pET28a-E;354K，I423L，D436G，L530R，用限制性內切酶XhoI和EcoRI進行雙酶切鑒定， 1 %瓊脂糖膠電泳檢查，結果產生約1. 7Kb和5. 4Kb大小的兩條帶，如圖2 (b)，與預期大小相符。質粒上firefly luciferase_E354K，I423L，D436g，L530R 基因的測序由北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司進行。測序引物是利用針對PETISa質粒上的通用引物5，T7和3，T7ter (由測序公司提供)，測序結果表明獲得的fireflyluCiferase-E354K， I423L，D436G，L530R基因序列與預期設計完全一致，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示序列的高熱穩定性及高酶活性編碼基因fireflyluciferase-E;354K，I423L，D436G，L530R 基因全長1650(不包括終止密碼TAA)，編碼550個氨基酸的蛋白。將產生的質粒命名為 pET28a-fireflyluciferase-E354K, I423L, D436G, L530R。表1 用于構建帶有4個突變位點的firefly Iuciferase基因的引物序列
權利要求
1.一種大腸桿菌，其特征在于大腸桿菌DH5 α -firefly luciferase--E354K, I423L, D436G, L530R, CCTCC NO. M2011062。
2.一種分離的蛋白編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
4.權利要求3所述的一種分離的蛋白在細菌檢測中的應用。
全文摘要
本發明一種螢火蟲熒光素酶的編碼基因及制備方法和應用，包括步驟1.突變酶突變位點的引入2．鑒定重組質粒；3．測序，獲得帶有1060位突變位點的PCR片段；4．經膠回收純化后，用限制性內切酶，獲得大腸桿菌；5．鑒定重組質粒，得到一種分離的蛋白基因；6．培養大腸桿菌；7．將重組質粒轉化BL21感受態細胞，得到表達突變酶的菌株；8．將上述獲得的BL21表達菌株培養；9．將5蛋白的菌液離心，再通過超聲破碎，離心獲取上清；10．測定，獲得有高熱穩定性又有高酶活的螢火蟲熒光素酶。一種螢火蟲熒光素酶的基因在食品、醫藥、菌體檢測上的應用。該突變酶的發光強度是野生型的15-20倍左右，并且較野生型具有良好的熱穩定性。
文檔編號C12N1/21GK102191213SQ20111009348
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月14日 優先權日2011年4月14日
發明者危宏平, 張先恩, 張治平, 王殿冰, 趙金鳳 申請人:中國科學院武漢病毒研究所