一種驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXO1的方法

專利名稱：一種驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXO1的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl的方法。
背景技術：
炭疽桿菌是一種桿狀、能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌，能夠引起人畜的炭疽病，如果不及時治療，死亡率極高。炭疽桿菌含有兩個致病相關的毒力大質粒pX01(181. 6kb)和pX02(96. 2kb)。質粒pXOl編碼保護性抗原、致死因子和水腫因子等炭疽毒素蛋白及他們的調控基因。質粒PX02編碼參與莢膜形成和降解的基因。這兩個質粒對于炭疽桿菌的致病性至關重要，丟失任何一個質粒都會導致炭疽菌的毒力極大的減低。因此對于炭疽桿菌毒力大質粒的研究一直是研究的熱點。構建驅除毒力質粒的突變菌株對于研究質粒在炭疽桿菌致病中的作用及染色體的相關調控非常重要。驅除細菌的大質粒可以使用驅除化學試劑，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高 溫培養或紫外照射等方法。但是這些方法都有潛在的問題，第一是特異性差，即在驅除目的質粒的過程中可能驅除目的質粒以外的其他質粒，第二是可能在處理過程中宿主細胞產生隨機突變的可能性。質粒不相容是兩個不同的但是相關的質粒不能穩定地在同一個細胞中遺傳。這些質粒被放在一個相同的不相容群。這種不相容性主要是由于互相競爭相同的復制位點或分離位點，或者是由于復制起始的抑制。使用這個原理可以模擬自然機制使用一個小的、高拷貝的質粒來去除毒力大質粒。這種方法驅除質粒可以特異的構建質粒缺失菌株而避免了誘導突變的危險。在一些細菌中已經應用質粒不相容原理成功的驅除了目的質粒，證明這是一種高效、安全的方法。但是由于對炭疽桿菌大質粒PXOl的復制相關序列還不是很清楚，因而該方法還未用來驅除炭疽桿菌的大質粒pXOl。早在1881年，Pasteur首先采用高溫培養減毒方法，獲得兩株具有莢膜的弱毒菌株(pX01_pX02+)，用以制備巴氏I苗和II苗。主要用于歐洲和其它國家的畜群免疫；2006年展德文等采用42°C高溫培養法，驅除了炭疽桿菌人用減毒疫苗株A16R(pX01+pX02_)中的大質粒pXOl，獲得一株無質粒的炭疽菌A16RP(pX0rpX02-) ;2007年韓國的Sung-Ha Park等人，采用42°C高溫培養法從炭疽桿菌H9401 (pX01+pX02+)株中驅除了大質粒pXOl，獲得了一株衍生菌H9401(pX0rpX02+)。這些驅除pXOl的方法中，pXOl的丟失是隨機的，必須經過大量的篩選過程，有時甚至得不到所需要的菌株，另外，在篩選的過程中可能導致宿主菌染色體的隨機突變。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種重組載體。本發明提供的重組載體，為將DNA分子插入穿梭質粒的SmaI位點得到的載體；所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。所述穿梭質粒為溫敏型穿梭質粒，
所述溫敏型穿梭質粒具體為pKSV7。所述重組載體在驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的另一個目的是提供一種驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟將所述的重組載體轉入出發菌，得到重組菌；將所述重組菌傳代培養，至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質粒pXOl被驅除，得到驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌。所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl方法中，在將所述的重組載體轉入出發菌前，還包括將所述重組載體去甲基化的步驟，
所述去甲基化的方法包括如下步驟I)、將所述重組載體轉入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌I ;2)、提取步驟I)得到的所述重組菌I的質粒，得到去甲基化的重組載體；所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl方法中，還包括將所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌去除所述重組載體的步驟，所述將驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌去除所述重組載體的方法包括如下步驟將所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌分別接種在無所述重組載體抗性篩選標記物培養基和含所述重組載體抗性篩選標記物的培養基中培養，選取在無所述重組載體抗性篩選標記物培養基生長且在含所述重組載體抗性篩選標記物的培養基上不生長的菌，得到驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl和所述重組載體的重組菌。所述出發菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ；所述抗性篩選標記物為氯霉素。所述傳代培養的溫度為不高于30°C，所述傳代培養的溫度具體為30°C ；所述將驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌去除所述重組載體的方法中，所述培養溫度為37°C -42°C，所述培養溫度具體為37°C。所述方法制備的驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌和/或驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl和所述重組載體的重組菌也是本發明保護的范圍。所述重組載體、所述的重組菌在制備疫苗中的應用也是本發明保護的范圍；所述疫苗具體為炭疽疫苗。本發明的第三個目的是提供一種炭疽疫苗。本發明提供的炭疽疫苗，其活性成分為所述的重組菌。本發明的實驗證明，本發明根據質粒不相容原理構建一個不相容質粒，特異地從炭疽桿菌A16R(pX01+pX02_)中驅除了毒力大質粒pXOl，然后在37°C培養，驅除導入的外源質粒，從而獲得了一株驅除PXOl的菌株A16R0。該方法具有簡單、快速、特異性好、安全性高的特點。該方法對于構建炭疽桿菌的質粒缺失株，從而研究大質粒PXOl與染色體的相互作用具有極其重要的意義，對于構建新的疫苗株提供了新的實驗手段，為炭疽桿菌的防治提供了新的思路。


圖I為外源重組質粒pKS5K的酶切鑒定2為驅除pXOl的初步篩選圖3為驅除pXOl的PCR方法鑒定圖4為Western Blotting方法檢測PA蛋白圖5為外源重組質粒pKS5K從A16R中驅除鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、驅除pXOl的重組菌的獲得及鑒定I、驅除質粒構建I. I溫敏型質粒線性化將溫度敏感型穿梭質粒pKSV7(6.9Kb)用限制性內切酶SmaI酶切線性化，之后
0.6%瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠上切下目標條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體pKSV7片段，操作步驟按照說明書進行。骨架質粒pKSV7質粒(其上既沒有轉座子也沒有插入序列)Smith K, YoungmanP. Use of a new integrational vector to investigate compartment-specificexpression of the Bacillus subtilis spoIIM gene[J] Biochimie，1992，74 :705-711.，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得。1.2.驅除片段的PCR獲得以炭疽桿菌(Bacillus anthracis) A16R(購自蘭州生物制品研究所)基因組為模板，使用引物對5K_F和5K_R (表1)，進行PCR擴增。PCR的體系為IOOul (I y L PyrobestDNA polymerase, 10 u L 10 X polymerase buffer, 8 u L dNTP mixture, 2 u L模板DNA, 2 u Lprimer 5K_F, 2 u L primer 5K_R,用去離子水補足IOOuL體系)；PCR的條件為先94°C變性5min，接著進行30個循環反應94°C變性40s，56°C退火40s，72°C延伸6min，最后在結束前在在72°C延伸5min。之后用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(博邁德公司)回收PCR片段，操作按照說明書進行。I. 3驅除片段與線性化載體連接、轉化、培養、鑒定使用CloneEZ連接試劑盒(南京金斯瑞公司)進行I. I得到的線性化載體pKSV7與I. 2得到的PCR片段的連接反應。方法按照試劑盒說明書進行。連接體系熱激轉化化學感受態細胞DH5a，之后在ImL不含抗生素的LB培養基中在200rpm搖床上30°C培養3小時；在含氨芐青霉素(100ug/mL)的LB瓊脂板上涂布，在30°C孵箱中培養12小時。挑取單克隆進行菌落PCR，引物為5K_F和5K_R，得到4848bp的為陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，用SmaI酶切，結果如圖I所示，I和2分別為質粒酶切前和酶切后的圖，M為DNA標準，得到約6900bp和4848bp的片段為陽性質粒，將該陽性質粒送去測序，該陽性質粒含有序列表中序列I所示的核苷酸，通過比對，即為炭疽桿菌質粒pXOl (GenBank accession no. AF065404)上的一段序列，范圍包括第19072到23919位，長度為4848bp，該陽性質粒為將序列表中的序列I插入PKSV7的SmaI酶切位點間得到的載體，將該質粒命名為pKS5K。
2.驅除炭疽炭疽A16R中的pXOl質粒A、轉化將I得到的質粒PKS5K先電轉入大腸桿菌SCSllO (購自TransGen公司，電轉感受態制備參照Shatalin KY, Neyfakh AA(2005)Efficient gene inactivation inBacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett 245:315-319;)去甲基化后(將電轉化的菌株再次提取質粒后，電轉入A16R，因為非去甲基化的質粒進入炭疽后，將會被降解，影響質粒的轉化)，再將其電轉入炭疽桿菌A16R感受態細胞中(制備參照Shatalin KY,NeyfakhAA(2005)Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett245 :315-319),電轉化炭疽桿菌時的電擊條件是電壓，0.6kv ;電阻，500 Q ;電容，25yF ;所用電擊儀為產自美國的Bio-RAD GenePulser II electroporator ;電擊杯規格為
0.1cm。B、篩選過程電轉完畢后加ImL不含抗生素的LB培養基，在200rpm搖床上30°C培養3小時；在含氯霉素(5y g/mL)的LB瓊脂平板上涂布(炭疽芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，在 革蘭氏陽性菌中使用氯霉素進行篩選)，在30°C培養箱中培養12小時。然后對平板上長出的單克隆進行PCR鑒定，鑒定引物采用pKSV7-F/pKSV7-R(表I)，得到約4900bp (AF065404第19072到23919位)的片段為陽性克隆，提取陽性克隆的質粒送去測序，結果為該質粒為PKS5K，將含有該質粒的克隆命名為pKS5K/A16R。C.鑒定結果I)菌落PCR初步篩選將pKS5K/A16R接入含氯霉素(5 u g/mL)的Luria-Bertani (LB)液體培養基中，在30°C搖床上225rpm培養12小時，吸取50uL培養液轉接到5mL新鮮的LB肉湯中(含氯霉素5 ii g/mL)，在30°C搖床上225rpm培養12小時，如此轉接和培養5次，吸取部分菌液適當稀釋后，涂LB平板(含氯霉素5 u g/mL)。挑取單克隆進行菌落PCR，對質粒pXOl上的特異的幾個基因(pagA, lef,cya和atxA)進行PCR檢測，以A16R作為陰性對照，以菌落為模板，pagA的特異引物pag_F、pag_R, Ief的特異引物lef_F、lef_R, cya的特異引物cya_F、cya_R，atxA的特異引物atxA_F、atxA_R分別作為引物(引物的序列見表I)，結果如圖2所示，2為pKS5K/A16R，I為A16R，從圖中可以看出，A16R菌均含有質粒pXOl上的特異的幾個基因(pagA (pag, 1627bp), Ief (2086bp), cya (1354bp)和 atxA (1202bp),而 pKS5K/A16R 菌株單菌落卻沒有陽性擴增條帶，表明PXOl質粒可能已經丟失。菌落鑒定沒有擴增條帶的菌株為陽性pKS5K/A16R。傳代5次，即可篩選出陽性菌株，傳代10次，篩選率可達到91 %。2)使用另外16對引物進一步確定的結果為了進一步確認pXOl的丟失情況，提取初步篩選為陽性PKS5K/A16R的基因組DNA JfpXOl質粒上的16個特異基因(16個特異基因比較均勻的分布在整個pXOl質粒上)進行檢測，pX01_07的特異引物為pX01_07F和pX01_07R、pX01_13的特異引物為pX01_13F 和 pX01_13R、pX01_16 的特異引物為 pX01_16F 和 pX01_16R、pX01_23 的特異引物為 pX01_23F 和 pX01_23R、pX01_32 的特異引物為 pX01_32F 和 pX01_32R、pX01_42 的特異引物為 pX01_42F 和 pX01_42R、pX01_51 的特異引物為 pX01_51F 和 pX01_51R、pX01_59 的特異引物為 pX01_59F 和 pX01_59R、pX01_67 的特異引物為 pX01_67F 和 pX01_67R、pX01_70 的特異引物為 pX01_70F 和 pX01_70R、pX01_90 的特異引物為 pX01_90F 和 pX01_90R、pX01_95 的特異引物為 pX01_95F 和 pX01_95R、pX01_98 的特異引物 pX01_98F 和 pX01_98R、pX01_116的特異引物 pX01_116F 和 pX01_116R、pX01_133 的特異引物 pX01_133F 和 pX01_133R、pX01_142的特異引物pX01_142F和pX01_142R，引物具體序列如下表I中所示，以A16R為對照；結果如圖3A-3C所示，I為A16R，2為pKS5K/A16R，以A16R基因組DNA為模板時，16對特異引物都能擴增出特異條帶，具體如下pX01_07(1104bp，AF065404第8352到6544) ;pX01_13(787bp，AF065404 第 19002 到 15040) ;pX01_16 (742bp，AF065404 第 22188 到23897) ;pX01_23(1286bp，AF065404 第 33006 到 31621) ;pX01_32 (733bp，AF065404 第 40152到 39169) ；pX01_42(890bp, AF065404 第 53370 到 52012) ；pX01_51 (718bp, AF065404 第65012 到 66490) ；pX01_59 (783bp，AF065404 第 74068 到 75501) ；pX01_67 (1072bp, AF065404第 79684 到 81432) ；pX01_70 (757bp, AF065404 第 84298 到 85611) ；pX01_90 (1250bp,AF065404 第 106772 到 108730) ；pX01_95(1076bp, AF065404 第 113430 到 114761)；pX01_98(767bp, AF065404 第 118950 到 117718) ；pX01_116 (799bp, AF065404 第 143333 到146110) ;pX01_133(981bp，AF065404 第 170713 到 169256) ;pX01_142 (1012bp，AF065404 第179399到176736)(這里的位置是閱讀框全長的位置，標示的長度為實際擴增的閱讀框中的一部分序列，引物的位置見引物列表)，而當以PKS5K/A16R的基因組DNA為模板時，16對特異引物都沒有擴增出特異條帶，這進一步確定了 PXOl確實從炭疽桿菌A16R中丟失了。3)表型鑒定因為pXOl上有編碼保護性抗原(PA)的基因，驅除了 pXOl后的菌株一定不能產生PA,所以通過Western Blotting來檢測PA的表達情況來進一步確認pXOl的丟失情況。pKS5K/A16R在含0. 9%碳酸氫鈉的LB瓊脂平板上劃線，在37°C，15% CO2條件下培養12h，從平板上刮去菌苔制成菌懸液，加上樣緩沖液(配方參見科學出版社《分子克隆實驗指南》第二版)沸水浴煮lOmin，離心，取上清，SDS-PAGE上樣，電泳結束后將蛋白轉印至PVDF膜上，做WB檢測。一抗為PA抗體，二抗為IgG-HRP。醫用膠片，顯影液，定影液購自柯達公司。以A16R為對照(樣品制備方法同上所述)。抗體購自Santa Cruz公司，一抗PA抗體貨號sc-52123，二抗羊抗小鼠IgG-HRP sc-2031。結果如圖4所示，從圖中看出，顯示A16R的菌體蛋白能夠與PA抗體產生特異的Western雜交帶,而pKS5K/A16R的菌體蛋白與PA抗體沒有特異的Western雜交帶,這再次說明PXOl已經從A16R中驅除。3、把不相容質粒pKS5K從炭疽桿菌A16R中驅除的過程篩選因為構建的外源質粒的骨架質粒pKSV7為溫敏性質粒，在37°C _42°C下丟失，而37°C為炭疽桿菌的最佳生長溫度，為了避免炭疽菌在過高的溫度生長傳代，所以選擇在37°C丟外源重組質粒。挑取去掉pXOl質粒的pKS5K/A16R接5mL無抗性LB液體培養基在37°C的搖床上培養12h，然后按I %轉接到另一 5mL無抗性LB液體培養中于37°C搖床上培養12h，反復按I %轉接多次后，對菌液進行梯度稀釋，取10-4、10-5兩個稀釋度的菌液，涂布無抗平板。次日，挑取平板上的單克隆進行點板，每一個單克隆分別點板于LB無抗板和含氯霉素(Cm濃度為5 ii g/mL)的LB瓊脂平板，將點板后的平板置30°C培養箱中培養。次日，挑取在無抗性平板上生長而在Cm抗性瓊脂平板上不生長的單克隆進行菌落PCR鑒定(pKSV7P3_F 和 pKSV7P3_R，pKSV7P6_F 和 pKSV7P6_R)和 Cm 抗性試管(5 u g/mL)轉接培養、(30°C，225rpm搖床培養)，確定其在Cm抗性試管中不長，由此選出陽性克隆，記作pKS5K/A16R(-pKSV7)。對選出的陽性克隆pKS5K/A16R(_pKSV7)進行接種于無抗性試管培養，然后提取它的基因組，以基因組做模板，以PKSV7P3的特異引物為pKSV7P3_F和pKSV7P3_R、pKSV7P6的特異引物為口1 ￥7 6_ 和pKSV7P6_R(pKSV7P3和pKSV7P6為pKSV7載體的特異片段)，進行PCR鑒定，以pKS5K/A16R為對照，結果如圖5所示，其中，I為p KS5K/A16R，2為陽性克隆pKS5K/A16R(-pKSV7)，可以看出，2陽性克隆中均未有片段擴增，I分別得到843bp pKSV7P3和535bp pKSV7P6的片段。將PCR鑒定無片段的陽性克隆命名為A16R0。該菌株A16R0為PXOl質粒的缺失同時又不含外源質粒的突變株。表I :實驗中使用的引物
權利要求
1.一種重組載體，為將DNA分子插入穿梭質粒的多克隆位點得到的載體； 所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。
2.根據權利要求I所述的重組載體，其特征在于 所述穿梭質粒為溫敏型穿梭質粒， 所述溫敏型穿梭質粒具體為PKSV7。
3.權利要求I或2所述重組載體在驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl中的應用。
4.一種驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的方法，包括如下步驟 將權利要求I或2所述的重組載體轉入出發菌，得到重組菌；將所述重組菌傳代培養， 至所述重組菌中的炭疽桿菌毒力大質粒PXOl被驅除，得到驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于 所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl方法中，在所述將權利要求I或2所述的重組載體轉入出發菌前，還包括將權利要求I或2所述重組載體去甲基化的步驟， 所述去甲基化的方法包括如下步驟 1)、將權利要求I或2所述重組載體轉入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌I; 2)、提取步驟I)得到的所述重組菌I的質粒，得到去甲基化的重組載體； 所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl方法中，還包括將所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl的重組菌去除權利要求I或2所述重組載體的步驟， 所述將驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl的重組菌去除權利要求I或2所述重組載體的方法包括如下步驟 將所述驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl的重組菌分別接種在無所述重組載體抗性篩選標記物培養基和含所述重組載體抗性篩選標記物的培養基中培養，選取在無所述重組載體抗性篩選標記物培養基生長且在含所述重組載體抗性篩選標記物的培養基上不生長的菌，得到驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl和所述重組載體的重組菌。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于 所述出發菌為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)； 所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ； 所述抗性篩選標記物為氯霉素。
7.根據權利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于 所述傳代培養的溫度為不高于30°C，所述傳代培養的溫度具體為30°C ； 所述將驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl的重組菌去除權利要求I或2所述重組載體的方法中，所述培養溫度為37°C -42°C，所述培養溫度具體為37°C。
8.由權利要求4-7中任一所述方法制備的驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXOl的重組菌和/或驅除炭疽桿菌毒力大質粒PXOl和所述重組載體的重組菌。
9.權利要求I或2所述重組載體、權利要求8所述的重組菌在制備疫苗中的應用；所述疫苗具體為炭疽疫苗。
10.一種炭疽疫苗，其活性成分為權利要求8所述的重組菌。
全文摘要
本發明公開了一種驅除炭疽桿菌毒力大質粒pXO1的方法。本發明提供了的重組載體，為將DNA分子插入穿梭質粒pKSV7的SmaI位點得到的載體；所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發明的實驗證明，本發明根據質粒不相容原理構建一個不相容質粒，特異地從炭疽桿菌A16R(pXO1+pXO2-)中驅除了毒力大質粒pXO1，然后在37℃培養，驅除導入的外源質粒，從而獲得了一株驅除pXO1的菌株A16RO。該方法具有簡單、快速、特異性好、安全性高的特點。該方法對于構建炭疽桿菌的質粒缺失株，從而研究大質粒pXO1與染色體的相互作用具有極其重要的意義，對于構建新的疫苗株提供了新的實驗手段，為炭疽桿菌的防治提供了新的思路。
文檔編號C12N1/21GK102732544SQ201110087128
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月7日 優先權日2011年4月7日
發明者馮爾玲, 劉先凱, 王東澍, 王華貴, 王恒樑 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所