多微衛星位點檢測試劑盒及檢測方法

專利名稱：多微衛星位點檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及真核生物基因組微衛星多態性的檢測技術領域，具體涉及到一種檢測 試劑盒，尤其設計一種多微衛星位點檢測試劑盒及檢測辦法，應用于基因定位、遺傳雜交育 種、親子鑒定和個體身份鑒定。
背景技術：
微衛星標記又稱為短串聯重復序列(simple tandem repeats, STRs)或簡單重復 序列(simple sequence r印eats)，廣泛存在于真核生物基因組中，重復單位核心序列為 2_6bp，不同個體間因核心序列重復次數不同而產生DNA多態性。由于重復單位的重復次數 在個體間呈高度變異性并且數量豐富，因此微衛星標記的應用非常廣泛。微衛星DNA分布廣泛均勻，多態信息含量豐富，呈共顯性遺傳，穩定性好，可比性 強，可使用PCR方法進行方便地檢測，分析技術易于自動化，是一種理想的分子標記，也成 為親子鑒定和個體身份鑒定的首選分子標記。傳統的微衛星檢測方法是聚丙烯酰胺凝膠 電泳法，此方法費時費力、重復性差、對技術人員要求很高、且由于影子帶的影響而無法達 到準確分型的目的。近期涌現出來的一種很有效的分析方法是毛細管電泳測序法，可以準 確獲得PCR擴增微衛星片段的長度，但是此方法要求每對引物中的一條必須進行熒光標 記。而熒光染料非常的昂貴，根據所用染料的不同，標記一條引物(50nmol以內)需要發費 100-130美元不等。如何形成一種快速有效且成本低廉的分子分析方法是亟待解決的問題。長期以來，微衛星的檢測一直受到時間、金錢和研究者實驗技術的制約。同時，在 遺傳雜交育種、親子鑒定等實際應用過程中，面臨的往往是大量的微衛星檢測。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種多微衛星位點檢測試劑盒。本發明所要解決的另一技術問題是克服傳統的微衛星檢測方法的不足，提供一種 簡單快捷、靈敏特異、成本低廉、對技術人員要求不高的檢測多微衛星位點的方法。為了解決上述的技術問題，本發明通過如下技術方案實現本發明的一方面，提供一種多微衛星位點檢測的試劑盒，包括下列組成(I)FAM-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 FAM-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(2)HEX-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 HEX-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(3) TET-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為: TET-5， -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’ ；(4) ROX-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 R0X-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(5) JOE-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為J0E-5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’ ；(6) PCR 反應液，包括雙蒸水和 2 XMaster PCR mix。在本發明的另一方面，提供一種多微衛星位點的檢測方法，包含如下步驟A提取實驗對象的基因組溶液；B根據不同位點的微衛星序列實驗者自行設計微衛星上下游引物，并且在各微衛 星上游引物的5，端分別連接5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'序列；C將步驟A得到的基因組溶液作為DNA模板進行PCR反應，PCR反應體系為DNA 模板、步驟B合成的引物和PCR反應液，得到PCR產物和微衛星的退火溫度Tl ；D將步驟C得到的PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，得到產物的大體長度；E進行嵌套式PCR反應，嵌套式PCR的反應體系為將步驟A得到的基因組溶液作 為DNA模板、步驟B合成的引物和所述試劑盒中5種PCR預混液中的一種； F將步驟E得到的不同位點微衛星標記的PCR產物進行混合，在ABI3730測序儀上 進行毛細管電泳；G毛細管電泳的結果以.fsa文件的形式呈現，利用Genemarker VI. 51軟件處理顯 示微衛星等位基因情況。所述步驟E中嵌套式PCR反應的反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30sec、 T1°C退火 30sec、72°C延伸 30sec 共 30 個循環，94°C變性 30sec、53°C退火 30sec、72°C延伸 30sec共8個循環，72°C再延伸5min。因每種PCR預混液攜帶相應的熒光標記引物，所以需配合步驟D得到的PCR產物 長度，決定步驟E中選擇哪種PCR預混液如果不同的微衛星標記PCR產物長度相差50bp 以上(以不同的微衛星標記的等位基因不重合為原則)，則以產物長度從小到大排序，相鄰 的微衛星標記可以選擇不同的PCR預混液或者同一個PCR預混液；如果不同的微衛星標記 PCR產物長度相差50bp以內，則選擇不同的PCR預混液以區分各個微衛星的等位基因。這 樣的搭配可以保證一個毛細管電泳泳道中包含多個微衛星位點的PCR產物，從而降低微衛 星檢測的費用。本發明的有益效果在于連接5’ -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'序列的微衛星特 異的上游引物和PCR預混液中含有連接熒光信號的FAM-5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’、 HEX-5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3，、TET_5，_TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3，、R0X-5，-TGT AAA ACGACG GCC AGT-3'和 J0E-5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'在進行嵌套式 PCR 的過 程中產生了帶有熒光信號的PCR產物，用于后續微衛星標記分型實驗，實驗者不需要再合 成帶有熒光信號的微衛星引物，大大降低了合成引物的成本。步驟E中PCR產物合理的混 合，可以在后續的毛細管電泳檢測中降低檢測成本。本發明所用的嵌套式PCR方法，在檢測 人員缺乏長期實驗經驗的情況下，能夠快速的進行微衛星的檢測。本發明利用毛細管電泳 測序的方法檢測微衛星，結果更客觀，靈敏度更高。


圖1是引物1、2和3PCR產物的1. 5%瓊脂糖凝膠(含5 μ g/ml EB (溴化乙錠)) 電泳結果，M是分子量標準，單位bp，泳道1是引物1的PCR產物大約lOObp，泳道2是引物 3的PCR產物大約130bp，泳道3是引物2的PCR產物大約220bp。
圖2是引物1、2和3PCR產物混合后的毛細管電泳圖，其中方框1顯示引物1擴增 片段包括98bp和11 Obp兩個等位基因；其中方框2顯示引物3擴增片段包括13 Ibp和139bp 兩個等位基因；框3顯示引物2擴增片段包括223bp和兩個等位基因。方框1和方 框3中的信號峰顏色相同，都是FAM-PCR預混液產生的藍色信號峰，方框2中的信號峰顏色 是HEX-PCR預混液產生的綠色。此圖證實了權利要求書中介紹的PCR產物混合和選擇預混 液的原則。
(五)具體實施方案以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件的實施方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1選用家兔為實驗對象抽提基因組(采用TIANGEN公司的基因組提取試劑 盒，TIANampGenomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，產品 目錄號為DP304-02)。1.采集家兔耳部組織樣。2.家兔耳部組織先打碎處理為細胞懸液，然后10，OOOrpm( 11，200Xg)離心1分 鐘，倒盡上清，加200 μ 1緩沖液GA (購自TIANGEN公司)，振蕩至徹底懸浮。3.加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻，在56°C放置，直至組織溶解，簡短離心以去除
管蓋內壁的水珠。4.加入200 μ 1緩沖液GB (購自TIANGEN公司)，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘， 溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。5.加人200 μ 1無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離 心以去除管蓋內壁的水珠。6.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3 (購自TIANGEN公司)中 (吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm廣13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放
回收集管中。7.向吸附柱CB3中加入500 μ 1緩沖液⑶(購自TIANGEN公司)，12，OOOrpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。8.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW(購自TIANGEN公司)，12，OOOrpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。9.向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW(購自TIANGEN公司)，12，OOOrpm( 13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液。10.將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm( 13，400 Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。11.將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將 吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ 1洗脫緩沖 液TE (購自TIANGEN公司)，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm( 13，400 X g)離心2分鐘，將 溶液收集到離心管中。12.得到DNA模板，4°C保存備用。實施例2引物設計根據GenBank公布的家兔微衛星數據，選擇AJ874520、AJ874385和AJ874433三個微衛星標記分別設計引物并且在每個微衛星上游引物的5’端連接5’-TGT AAA ACG ACG GCCAGT-3，序列引物1的序列(AJ874520)為上游5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTAACCTAGTTGGGAGCAGTGTG-3，；下游5’ -GATTCATAGCTGTGCCTTTCAA-3’ ；擴增片段長度IOObp左右。引物2的序列(AJ874385)為上游5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTGTTTAGCAAGTGGGGGAAGG-3’下游5， -GGAGATGGAGCTGCACTGTT-3，；擴增片段220bp左右。引物3的序列(AJ874433)為上游5’ -TGTAAAACGACGGCCAGTCGGAAAAACTTACCTCATGTTC-3，下游5， -TCCAACTTCTCCATGCCTCTA-3‘擴增片段130bp左右。上述引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實施例3梯度PCR摸索各位點退火溫度在200μ 1的PCR管中依次加入以下試劑DNA模板1μ l(50-100ng/y 1，由實施 例1制得)，引物1上游0. 5 μ 1 (10 μ m)，引物1下游0. 5 μ 1 (10 μ m)，PCR反應液12. 5 μ 1， ddH20(雙蒸滅菌水)補足25 μ 1。反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30sec、50-60°C 退火30sec、72°C延伸30sec共30個循環，72°C再延伸5min。PCR產物4°C保存，進行1. 5% 瓊脂糖凝膠(含5yg/ml EB(溴化乙錠))電泳，根據電泳結果得到引物1最佳退火溫度為 53. 5°C，PCR產物長度為IOObp左右。弓丨物2和引物3反應體系和條件同引物1，瓊脂糖凝 膠電泳得到引物2和引物3的最佳退火溫度分別為59. 6°C和53. 5°C，PCR產物長度分別是 220bp 和 130bp 左右。實施例4選擇適當的PCR預混液根據實施例3得到的PCR產物長度搭配相應的PCR預混液引物1產物長度IOObp左右，搭配FAM-PCR預混液；引物2產物長度220bp左右，搭配FAM-PCR預混液；引物3產物長度130bp左右，搭配HEX-PCR預混液。實施例5嵌套PCR反應嵌套式PCR反應體系為在200μ1的PCR管中依次加入以下試劑DNA模板 1μ l(50-100ng/y 1,由實施例1制得)，實施例2合成好的引物1上游0. 125μ I(IOym),引 物1下游0. 5μ I(IOym), FAM-PCR預混液12. 5 μ 1，最后加ddH20 (雙蒸滅菌水)補足25 μ 1反應體系。反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30sec、53. 5°C退火30sec (引物2和引 物3進行嵌套式PCR反應體系時相應改變退火溫度，即引物2的退火溫度為59. 6°C ；引物 3的退火溫度為53. 50C )、72°C延伸30sec共30個循環，94°C變性30sec、53°C退火30sec、 72°C延伸30sec共8個循環，72°C再延伸5min。PCR產物4°C保存，進行1. 5%瓊脂糖凝膠 (含5yg/ml EB(溴化乙錠))電泳，得到引物1的PCR產物。上述同樣的反應得到引物2 和引物3的PCR產物。將引物1、引物2和引物3的產物等體積混合(各10 μ 1)后送國家 人類基因組南方研究中心做毛細管電泳。 實驗結果圖1為1.5%瓊脂糖凝膠(含5yg/ml EB(溴化乙錠))電泳圖，泳道1 為引物IPCR產物檢測結果，泳道2為引物3PCR產物檢測結果，泳道3為引物2PCR產物檢 測結果，M為分子量標準。圖2顯示引物1、2和3PCR產物混合后的毛細管電泳圖，其中方 框1顯示引物1擴增片段包括98bp和IlObp兩個等位基因；其中方框2顯示引物3擴增片 段包括131bp和139bp兩個等位基因；框3顯示引物2擴增片段包括223bp和226bp兩個 等位基因。方框1和方框3中的信號峰顏色相同，都是FAM-PCR預混液產生的藍色信號峰， 方框2中的信號峰顏色是HEX-PCR預混液產生的綠色。
權利要求
1.一種多微衛星位點檢測的試劑盒，其特征在于包括下列組成(1)FAM-PCR預混液包括雙蒸水、2XMasterPCR mix和一條引物 FAM-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(2)HEX-PCR預混液包括雙蒸水、2 X Master PCR mix和一條引物 HEX-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(3)TET-PCR預混液包括雙蒸水、2XMasterPCR mix和一條引物 TET-5， -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’ ；(4)ROX-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物 R0X-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(5)JOE-PCR預混液包括雙蒸水、2 X Master PCR mix和一條引物 J0E-5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；(6)PCR反應液，包括雙蒸水和2XMasterPCR mix。
2.一種多微衛星位點的檢測方法，其特征在于包含如下步驟 A提取實驗對象的基因組溶液； B 根據不同的微衛星序列實驗者自行設計微衛星上下游引物，并且在各微衛星上游引物的5’端分別連接5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'序列；C將步驟A得到的基因組溶液作為DNA模板進行PCR反應，PCR反應體系為DNA模板、 步驟B合成的引物和PCR反應液，得到PCR產物和微衛星的退火溫度Tl ；D將步驟C得到的PCR產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，得到產物的大體長度； E進行嵌套式PCR反應，嵌套式PCR的反應體系為將步驟A得到的基因組溶液作為DNA 模板、步驟B合成的引物和PCR預混液；F將步驟E得到的不同微衛星標記的PCR產物進行混合，在ABI3730測序儀上進行毛細 管電泳；G毛細管電泳的結果以.fsa文件的形式呈現，利用Genemarker VI. 51軟件處理顯示微 衛星等位基因情況；步驟C中所述的PCR反應液包括雙蒸水和2 XMaster PCR mix ； 步驟E中所述的PCR預混液是指FAM-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 FAM-5' -TGTAAA ACG ACG GCC AGT-3'或HEX-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 HEX-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'或TET-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 TET-5，-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'或ROX-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 R0X-5' -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'或JOE-PCR預混液包括雙蒸水、2XMaster PCR mix和一條引物；引物序列為 J0E-5， -TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；所述PCR預混液的選擇根據PCR產物長度決定，以不同的微衛星標記的等位基因不重 合為原則如果不同的微衛星標記PCR產物長度相差50bp以上，則以產物長度從小到大排 ；引物序列為 ；引物序列為 ；引物序列為 ；引物序列為 ；引物序列為序，相鄰的微衛星標記可以選擇不同的PCR預混液或者同一個PCR預混液；如果不同的微衛 星標記PCR產物長度相差50bp以內，則相鄰的微衛星標記選擇不同的PCR預混液以區分各 個微衛星的等位基因；所述步驟E中嵌套式PCR反應的反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30seC、Tl°C 退火 30sec、72°C延伸 30sec 共 30 個循環，94°C變性 30sec、53°C退火 30sec、72°C延伸 30sec 共8個循環，72°C再延伸5min。
全文摘要
本發明涉及一種多微衛星位點檢測試劑盒及檢測方法，用于微衛星標記基因分型實驗，以嵌套式PCR為基礎利用毛細管電泳測序的方法檢測微衛星，結果更客觀，靈敏度更高。實驗者不需要再合成帶有熒光信號的微衛星引物，大大降低了合成引物的成本。PCR產物合理的混合，可以在后續的毛細管電泳檢測中降低檢測成本。本發明在實驗者掌握普通PCR技術的情況下，能夠快速的進行微衛星標記基因分型工作。
文檔編號C12Q1/68GK102140524SQ20111008080
公開日2011年8月3日 申請日期2011年3月23日 優先權日2011年3月23日
發明者于希江, 劉東君, 唐輝, 姜運良, 曾勇慶, 樊新忠, 譚景和, 馬豐收 申請人:山東農業大學