殺甘薯莖線蟲的蘇云金芽胞桿菌ybt-008及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：殺甘薯莖線蟲的蘇云金芽胞桿菌ybt-008及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物殺蟲農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)害蟲甘薯莖線蟲具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌YBT-008的篩選及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘薯是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料，種植廣泛，在世界糧食生產(chǎn)中，總產(chǎn)量居第七位，在我國糧食生產(chǎn)中，僅次于水稻、小麥和玉米，居第四位(朱金亭，高建偉.國內(nèi)外甘薯生產(chǎn)形勢概述[J].農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，1995，7 :20-21)。目前我國甘薯常年種植面積在600 萬公頃左右，占世界總面積的65%左右，每年總產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量85%左右(FAO bulletin of statistics. 2002,3(1) :46-47)。
我國甘薯的種植面積和總產(chǎn)量居世界第一位，但是單產(chǎn)卻居世界第十二位(朱金亭等，1995)，其原因除栽培和管理技術(shù)落后以外，甘薯生產(chǎn)中的隱蔽敵人---甘薯莖線蟲病是導致甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一個重要原因。甘薯莖線蟲病又稱糠心病、空心病、空梆、 糠裂皮等，是一種毀滅性災(zāi)害，其病原線蟲為甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)。甘薯莖線蟲病在我國的北京、天津、山東、河北、河南、江蘇、安徽、浙江、福建、遼寧、甘肅等省市均有發(fā)生，其中山東、河南、河北、安徽等省發(fā)生最為嚴重。該病不僅在田間危害薯塊和莖蔓，還引起貯藏期爛窖，育苗期爛炕，減產(chǎn)可達10% -50%，嚴重時絕收；除侵染甘薯外，還危害豌豆、菜豆、蕎麥、蓖麻，中藥材當歸、薄荷、人參、胡蘿卜和花生等(楊寶君，李靜華.當歸麻口病病因初步探討.植物病理學報，1990，20 (I) :20;陳品三，鄭經(jīng)武.當歸麻口病中致病莖線蟲的鑒定研究.植物保護，1988，14 (6) :12-14)。該病害已被列為國內(nèi)檢疫對象。目前針對甘薯莖線蟲病的防治方法主要有化學防治、物理防治和抗性品種選育以及生物防治等。用于線蟲防治的化學殺蟲劑主要有用于土壤熏蒸處理的熏蒸劑和非熏蒸劑兩類。熏蒸劑主要有鹵代烴和施入土壤后能釋放出異硫氰酸甲酯的化合物兩類， 施入土壤后能對土傳線蟲、土壤害蟲等土內(nèi)幼小昆蟲具有殺傷作用。熏蒸劑為殺死性藥物，殺蟲效果徹底，防病增產(chǎn)效果明顯，還不易誘發(fā)線蟲產(chǎn)生抗性，但是累及捕食植物病原線蟲的肉食線蟲以及其他土棲動物，不利于土壤活化、天敵繁衍和環(huán)境保護。非熏蒸劑主要有除線磷(Dichlofenthion)、殺線威、克線磷、甲基異硫磷、氯唑磷等有機磷農(nóng)藥 (Organophosphates), 一般均為內(nèi)吸性。非熏蒸劑由于對植物也有危害，故只能在播種前空白地使用，使用時期有限，只能作為預防使用(陳品三.殺線蟲劑主要類型、特性及其作用機制·農(nóng)藥科學與管理，2001，22 33-35)。物理防治是指通過輪種、休閑、旱季翻耕和利用抗病、耐病品種等措施來避免線蟲為害，但由于病害易傳播造成再次感染和耕地面積限制等原因，輪作換茬的抗病方法受到很大制約；而選育抗病和耐病品種也因為甘薯遺傳上的高度雜合性和種間、種內(nèi)廣泛存在的雜交不親和性，限制了甘薯育種中親本的自由選擇，因此單純使用抗性育種方法仍有局限性。生物防治是指利用線蟲天敵、一些微生物和高等植物產(chǎn)生的拮抗性代謝物以及基因工程手段培育抗性作物來防治。自然情況下，線蟲主要是被土壤中存在的各種天敵殺死(陳品三，郝近大譯，AL泰勒著.植物線蟲學研究入門.北京農(nóng)業(yè)出版社，1976)。這些天敵生物主要有真菌、細菌、病毒、捕食性線蟲、渦蟲、昆蟲、螨類和原生動物等(Brian R K. An assessment of progress toward microbial control of plant-parasitic nematodes. Supplement J Nematol，1990，22 :621-631)，其中真菌占了 75% (張克勤，何世川，周薇，黃大飛，梅隆.真菌和細菌在線蟲生防中的作用及研究進展.殺蟲微生物，1991， 3 55-61) ο線蟲天敵真菌主要有捕食性真菌和內(nèi)寄生真菌，目前研究最多的是淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)。利用微生物和高等植物產(chǎn)生的拮抗性代謝物也可以殺死線蟲，比如吸水鏈霉菌(Streptomyces hygtoscopicus)產(chǎn)生的阿維菌素(Avermectin)是很有效的殺線蟲劑，防效是普通熏蒸劑的10 20倍((張克勤，何世川，周薇，黃大飛，梅隆.真菌和細菌在線蟲生防中的作用及研究進展.殺蟲微生物，1991，3 :55-61)。蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的蘇云金素和伴胞晶體蛋白對線蟲也有毒性(Prasad SSV, Tilak K V B R， Gollakota K G. Role of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis on the larval survivability and egg hatching of Meloidogyne spp., the causative agent of root-knot disease. J Invertebr Pathol,1972, 20 :377-378 ；Bone L W,Bottjer K P,Gill S S. Trichostrongylus colubriformis Egg lethality due to Bacillus thuringiensis crystal toxin.Exp Parasitol，1985，60 :314-322)。
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蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是土壤中廣泛存在的革蘭氏陽性細菌，其在生長過程中會產(chǎn)生具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal Proteins, I CPs)，該蛋白對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆蟲綱10個目500多種昆蟲以及原生動物、線形動物門、扁形動物門、瘧原蟲、血吸蟲、螨類等具有毒殺活性(SchMpf H E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler D R, Dean D
H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev，1998,62 :775-806)。由于蘇云金芽胞桿菌對目標生物具有特異高毒力，對昆蟲天敵、人畜安全，不污染環(huán)境而且昆蟲不容易產(chǎn)生抗性等特點，因此被廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林、 醫(yī)、倉貯等領(lǐng)域的害蟲生物防治。蘇云金芽胞桿菌已成為世界上應(yīng)用最廣泛而且最為成功的生物殺蟲劑(喻子牛.蘇云金芽胞桿菌制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用.北京農(nóng)業(yè)出版社，1993)。 自1972年P(guān)rasad首次報道蘇云金芽胞桿菌對線蟲有作用以來(Prasad S S V，Tilak K VBR, Gollakota K G. Role of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis on the larval survivability and egg hatching of Meloidogyne spp., the causative agent of root-knot disease. J Invertebr Pathol, 1972, 20 :377-378),利用蘇云金芽胞桿菌防治動植物寄生線蟲越來越得到國內(nèi)外的關(guān)注。上個世紀80年代Bone等人的研究首次證實了蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白對線蟲的殺蟲活性(Bone L W，Bottjer K P，Gill S S.Trichostrongylus colubriformis Egg lethality due to Bacillus thuringiensis crystal toxin. Exp Parasitol, 1985,60 :314-322)。之后，美國 Mycogen 公司的大量研究工作也進一步證實了蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白對線蟲的作用(Bradfish G A. Process for controlling lepidopteran pests. EP19920920639)。此外他們還克隆了多個殺線蟲毒素蛋白的編碼基因并申請了相關(guān)專利，而我們所能看到的關(guān)于蘇云金芽胞桿菌對線蟲防治的報道也多見于這些專利中的描述。
目前，已經(jīng)有越來越多的抗線蟲的蘇云金芽胞桿菌制劑在田間應(yīng)用。Shanna等用蘇云金亞種(subsp. thuringiensis)和以色列亞種(subsp. israelensis)菌劑處理大麥根際土壤，發(fā)現(xiàn)對南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)起到了一定的防效；此外，他們還發(fā)現(xiàn)，用以色列亞種菌株Bti-H14的毒素蛋白處理大豆和玉米種子，能夠使大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)的寄生率顯著降低(Sharma R D. Bacillus thuringiensis a biocontrol agent of Meloidogyne incognica on barely. Nematologia Brasilera， 1994,18 :79-84)。Ivanova則報道某種蘇云金芽胞桿菌制劑能夠用于防治黃瓜和番茄上的根結(jié)線蟲(Ivanova T S. Efficiency of biopreparation in control of gall nematode in protected soil. Agrokhimiya, 1996, 3 101-106);而 Ensard 則用蘇云金桿菌制劑防治香蕉穿孔線蟲也取得了顯著效果(Ensard J. Effects of three microbial broth cultures on growth and populations of free living and plant-parasitic nematodes on banana. European Journal of Plant Pathology, 1998,104(5) :457-463)。雖然如此， 到目前為止，利用蘇云金芽胞桿菌防治甘薯莖線蟲的研究工作開展很少，相關(guān)菌株和基因資源缺乏，國內(nèi)外未見報道
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服目前利用傳統(tǒng)的化學、物理方法防治甘薯莖線蟲的局限性，篩選一株對甘薯莖線蟲具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌，同時也為高效殺蟲工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建提供新型菌株和基因資源。篩選得到的蘇云金芽胞桿菌應(yīng)該具有殺蟲毒力高、起效作用快、實施方法簡單有效的特點，同時也能為以后的理論研究和實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)目前利用蘇云金芽胞桿菌防治甘薯莖線蟲的研究工作鮮有開展，相關(guān)報道缺乏， 申請人:利用報道的蘇云金芽胞桿菌相關(guān)菌株如YBT-007、YBT-008、YBT-017、YBT-020、 YBT-021、YBT-027、YBT-032、YBT-037，蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(subsp. Israelensis, 血清型H14)和庫斯塔克亞種(subsp. kurstaki,血清型H3abc),以及對北方根結(jié)線蟲具有高毒力的兩個蘇云金芽胞桿菌工程菌株BMB171/pHT304-cry5Ba2和BMB171/ PHT304-cry6Aa2(以下分別簡稱為Cry5和Cry6)進行微生物學篩選，得到殺甘薯莖線蟲的候選菌株。方法如下蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白生物測定樣品的制備。將蘇云金芽胞桿菌YBT-007、 YBT-008等12株菌株分別進行搖瓶培養(yǎng)，待芽胞完全成熟并脫落后，離心收集胞晶混合物。 用lmol/L NaCl和無菌去離子水洗滌數(shù)次后，Na2CO3溶液(pH9. 5，臨用前加入20mMDTT)溶解其中的伴胞晶體蛋白，然后用4MNaAc(pH4. 4)調(diào)節(jié)蛋白等電點至沉淀最大量析出，沉淀洗滌數(shù)次后用Na2CO3溶液溶解保存?zhèn)溆?。此為對甘薯莖線蟲進行生物測定的蛋白樣品。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白對甘薯莖線蟲的生物測定程序。具體生物測定程序參考實施例三。室內(nèi)生物測定過程在96孔細胞培養(yǎng)板上進行。生物測定的甘薯莖線蟲用去離子水洗凈，懸浮于無菌水中，調(diào)整蟲口密度至IO3條/ml。在每孔中加入40μ I線蟲(約 40條)懸浮液和260 μ I蛋白溶解液樣品，20 μ g/ml氯霉素抑制雜菌生長，每個處理3個重復，50mmol/L Na2CO3溶液做對照，置于28°C培養(yǎng)箱，每隔3天和7天觀察并統(tǒng)計死亡率。經(jīng)過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，蘇云金芽胞桿菌YBT-008、YBT-032、H14在3天即取得良好殺蟲效果(致死率50 %以上)，第7天時致死率達到95 %以上，相較其余菌株在殺蟲效果上具有明顯的優(yōu)勢。將蛋白樣品稀釋二倍后按同樣方法進行生物活性的測定，發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌 YBT-008仍然具有很高的殺蟲活性(3天時致死率仍能保持在90%以上)，而其余菌株殺蟲效果并不明顯。對蘇云金芽胞桿菌YBT-008的防治效果測定顯示，其對甘薯莖線蟲的LCki 為 203. 76 μ g/ml。申請人:將篩選得到的對甘薯莖線蟲具有明顯防治效果的蘇云金芽胞桿菌YBT-008 菌株于2011年2月17日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保存中心 (CCTCC)保藏，其保藏號為 CCTCC NO M2011039o蘇云金芽胞桿菌YBT-008的生物學特征革蘭氏染色陽性，營養(yǎng)體呈桿狀，長約5-7 μ m,兩端鈍圓，通常2_8個呈鏈狀。芽胞卵圓形，有光澤，通常在菌體一端，伴胞晶體在菌體另一端，形態(tài)不一。在含7% NaCl (w/v) 的肉湯中生長，在檸檬酸培養(yǎng)基中不生長，最適生長溫度為28°C，最適生長pH為7. 0-7.2， 在含有核糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、甘油、可溶性淀粉的培養(yǎng)基中產(chǎn)酸。 搖瓶培養(yǎng)蘇云金芽胞桿菌YBT-008，每隔一段時間測量其0D600值，做出生長曲線，如圖4所示。從圖中可以看出，蘇云金芽胞桿菌YBT-008在培養(yǎng)大約12個小時之后進入穩(wěn)定期。為了進一步鑒定蘇云金芽胞桿菌YBT-008的殺蟲晶體蛋白成分，對其進行的 SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，此菌株產(chǎn)生包括130kDa殺蟲晶體蛋白在內(nèi)的多種晶體蛋白成分； 挖取SDS-PAGE凝膠上蛋白表達量最高的六個電泳條帶，進行LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜連用) 檢測，結(jié)果顯示，這些晶體蛋白成分分別為Cyt2Ba、CrylIAa> Cry4Aa和Cry4Ba。為了進一步確認蘇云金芽胞桿菌YBT-008含有上述四種殺蟲晶體蛋白編碼基因，根據(jù)EMBL數(shù)據(jù)庫中 cyt2Ba、cryllAa、cry4Aa和cry4Ba的保守序列設(shè)計特異性引物進行PCR擴增,得到了正確大小的片段，將得到的擴增片段進行T/A克隆、測序和Blast比對，結(jié)果顯示測序的PCR擴增片段與數(shù)據(jù)庫中已知cyt2Ba、cryllAa、cry4Aa和cry4Ba的保守序列同源性達到98%以上?？梢宰C實，蘇云金芽胞桿菌￥81'-008含有編碼07丨28&、071認&、0744&和0748&的殺蟲晶體蛋白基因。本發(fā)明篩選的蘇云金芽胞桿菌YBT-008對甘薯莖線蟲具有高毒力(3天即可殺死供試線蟲)、起效作用快(3天即可發(fā)揮毒力效用)，實施方法便捷等優(yōu)點，并含有多種殺蟲晶體蛋白編碼基因cyt2Ba、cryllAa、cry4Aa和cry4Ba等,預示著可以作為農(nóng)業(yè)防治甘薯莖線蟲的新型殺蟲劑和轉(zhuǎn)基因植物的基因資源。更詳細的技術(shù)方案見《具體實施方式
》所述。


SEQ ID NO : I是cyt2Ba擴增片段經(jīng)測序后得到的核苷酸序列，序列長度為455bp。SEQ ID NO :2是cryllAa擴增片段經(jīng)測序后得到的核苷酸序列，序列長度為 604bpoSEQ ID NO 3是cry4Aa擴增片段經(jīng)測序后得到的核苷酸序列，序列長度為1809bp
SEQ ID NO :4是cry4Ba擴增片段經(jīng)測序后得到的核苷酸序列，序列長度為2541bp圖I :本發(fā)明實施例中蘇云金芽胞桿菌對甘薯莖線蟲的生物測定結(jié)果分析；圖2 :本發(fā)明實施例中蘇云金芽胞桿菌YBT-008、YBT-032、H14和YBT-007菌株蛋白樣品在稀釋二倍后對甘薯莖線蟲的生物測定結(jié)果分析。圖3 :蘇云金芽胞桿菌YBT-008在相差顯微鏡下的菌體形態(tài)圖；圖中=Spore示芽胞，Crystal示其伴胞晶體蛋白。圖4 :本發(fā)明中蘇云金芽胞桿菌YBT-008的生長曲線；圖中橫軸示培養(yǎng)時間，縱軸示不同培養(yǎng)時間下的0D600值。圖5:本發(fā)明實施例中蘇云金芽胞桿菌YBT-008 SDS-PAGE檢測圖，圖中 ①②③④⑤⑥示挖取的6個蛋白條帶；圖6 :本發(fā)明實施例中蘇云金芽胞桿菌YBT-008抽提總質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳分析；圖中M，Ikb DNA分子量標準；1，蘇云金芽胞桿菌YBT-008總質(zhì)粒。 圖7 :本發(fā)明實施例中PCR擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳分析；圖中M，Ikb DNA分子量標準；1，殺蟲晶體蛋白基因cyt2Ba的PCR擴增廣物；2，殺蟲晶體蛋白基因cryllAa的 PCR擴增產(chǎn)物；3，殺蟲晶體蛋白基因cry4Aa的PCR擴增產(chǎn)物；4，殺蟲晶體蛋白基因cry4Ba 的PCR擴增產(chǎn)物；D，DL2000分子量標準。圖8 :本發(fā)明實施例中cyt2Ba擴增片段的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中其CDS序列的 Blast比對結(jié)果。圖中Query示數(shù)據(jù)庫中cyt2Ba⑶S序列107 560段的核苷酸序列； Sbjct示測序得到的cyt2Ba擴增片段核苷酸序列。圖9 :本發(fā)明實施例中cryllAa擴增片段的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中其CDS序列的 Blast比對結(jié)果。圖中Query示數(shù)據(jù)庫中cryllAa CDS序列1210 1808段的核苷酸序列；Sbjct示測序得到的cryllAa擴增片段核苷酸序列。圖10 :本發(fā)明實施例中cry4Aa擴增片段的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中其CDS序列的 Blast比對結(jié)果。圖中=Query示數(shù)據(jù)庫中cry4Aa CDS序列626 1505和1716 2602段的核苷酸序列；Sbjct示測序得到的cry4Aa擴增片段核苷酸序列。圖11 :本發(fā)明實施例中cry4Ba擴增片段的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中其CDS序列的 Blast比對結(jié)果；圖中Query不數(shù)據(jù)庫中cry4Ba CDS序列中240 1422和1442 2584 段的核苷酸序列；Sbjct示測序得到的Cry4Ba擴增片段核苷酸序列。
具體實施例方式實施例I蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白生物測定樣品的制備篩選過程中利用的菌株資源為華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室公開報道的蘇云金芽胞桿菌株系，其原始編號分別為YBT-007、YBT-008、YBT-017, YBT-020、YBT-021、YBT-027、YBT-032、YBT-037 (來源見文獻Yu Zi-Quan 等，Bacillus thuringiensis crystal protein toxicity against plant-parasitic nematodes. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology. 2008，5(I) :13-17)和蘇云金芽胞桿菌以色列亞種和庫斯塔克亞種，以及兩個蘇云金芽胞桿菌工程菌株BMB171/ pHT304-cry5Ba2 (Suxia Guo 等，New strategy for isolating novel nematicidalcrystal protein genes from Bacillus thuringiensis strain YBT1518. Applied and Environment Microbiology. 2008,74 :6997-7001)和 BMB171/pHT304-cry6Aa2(余子全等，蘇云金芽胞桿菌殺線蟲伴胞晶體蛋白cry6Aa的克隆與表達.微生物學報，2007，47 : 865-868)。I、蘇云金芽胞桿菌供試菌株的培養(yǎng)將上述12株待試蘇云金芽胞桿菌菌株接5ml液體LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基配方胰蛋白胨，10g/L ;酵母提取物，5g/L ;氯化鈉，10g/L ；pH 7. 0,1211下高壓蒸汽滅菌20min) 經(jīng)過夜活化后，按1/100 (v/v)接種量轉(zhuǎn)接至50ml新鮮滅菌PM培養(yǎng)基中(PM培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨，10g/L ;葡萄糖，5g/L ;酵母提取物，2g/L ；KH2PO4, lg/L ；MgS04 · 7Η20，0· 3g/L ； FeSO4 · 7Η20，0· 02g/L ；ZnSO4 · 7Η20，0· 02g/L ；MnS04 · 7Η20，0· 02g/L ；pH7. 2，在 115°C高壓蒸汽下滅菌20min)，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)大約48_52h后，取發(fā)酵液制作鏡檢鏡片，在相差顯微鏡下(所用型號為日本Nikon E600)觀察，待視野中大部分芽胞脫落時即可收集。2、蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白的提取(I)將發(fā)酵液在4°C下經(jīng)8，OOOrpm離心lOmin，所得沉淀即為蘇云金芽胞桿菌胞晶混合物；
·
(2)分別用預冷的lmol/L NaCl溶液和無菌去離子水洗滌3次(8，OOOrpm離心 10min，4°C )，期間充分去掉芽胞；(3)洗漆后的胞晶混合物加入50mmol/L Na2CO3溶液(ρΗ9· 5,臨用前加入20mmol/ L 01'1')，371處理4511^11 ；(4)8, OOOrpm離心IOmin收集上清,加入約1/10體積的4mol/L乙酸鈉(ρΗ4· 4), 冰上靜置I 2h ;(5) 8，OOOrpm離心IOmin收集沉淀，經(jīng)去離子水洗滌I 2次后，即可得到用作生物測定的殺蟲晶體蛋白樣品。生物測定前，加入適量50mmol/L Na2CO3溶液(pH9. 5)溶解即可。實施例2甘薯莖線蟲的接種、培養(yǎng)和收集依據(jù)甘薯莖線蟲的生活方式，申請人提供了一種簡便的人工培養(yǎng)甘薯莖線蟲的方法，其中甘薯莖線蟲由中國科學院上海植物生理研究所提供。I、甘薯莖線蟲的接種和培養(yǎng)無菌去離子水洗凈甘薯莖線蟲，懸浮于無菌水中，并稀釋至蟲口密度約5000條/ ml備用。將形狀均勻、表面無破損的新鮮甘薯用水洗凈表面，再用75 %酒精擦洗2次后，超凈臺內(nèi)吹干備用。用無菌手術(shù)刀在甘薯的中間部分切一小塊，吸取約200μ I線蟲懸浮液緩慢打入甘薯凹孔內(nèi)，靜置片刻，待水完全滲入甘薯內(nèi)后，將切下的甘薯小塊放回凹孔內(nèi)，用蠟封口。接種后的甘薯用報紙包裹，26 °C培養(yǎng)。2、甘薯莖線蟲的收集線蟲接種后，約2個半月后即可進行收集，超過三個月培養(yǎng)的甘薯收集的線蟲量會大大降低。感染甘薯莖線蟲的病薯變軟，表面有褐色龜裂斑塊，內(nèi)部呈褐色糠心，縱剖面有點狀空隙，密集成條，空隙中有白粉狀物，嚴重的呈褐色干腐狀。
將感染線蟲的甘薯切成小立方體狀，兩層抽紙包裹置于平皿中央，放入自來水，水盡量浸沒抽紙中的甘薯小塊。靜置數(shù)小時后待線蟲游出，先用5ml槍將平皿底部白色絮狀密集的線蟲緩慢吸出，置于15ml離心管中3000rpm離心2_3min，將離心管底部線蟲混合入一管。再將大平皿中的抽紙放入新的平皿中，同樣方法再收集一次，可過夜收集。初步收集的線蟲用蒸餾水多次洗滌去掉雜質(zhì)，洗干凈后，滅菌水配制I %次氯酸鈉溶液消毒5min，洗滌干凈后分裝于1.5ml離心管中，4°保存。保存的甘薯莖線蟲每隔2 3周左右需要換水洗滌2 3次，此種方法保存的甘薯莖線蟲可保存數(shù)月甚至半年。實施例3蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白對甘薯莖線蟲生物活性的測定蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白對甘薯莖線蟲生物活性的測定程序參考文獻余子全等，蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白對植物寄生線蟲生物測定方法的建立和高毒力菌株的篩選，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2007 (15) :867-871。此實施例中使用的供試線蟲為老、幼混雜的甘薯莖線蟲，生物測定過程在96孔細胞培養(yǎng)板上進行。I、蘇云金芽胞桿菌對甘薯莖線蟲的生物活性測定 (I)甘薯莖線蟲和殺蟲晶體蛋白樣品的準備。使用前將線蟲充分混勻，并用無菌去離子水洗滌數(shù)次后，懸浮于水中，同時調(diào)整其蟲口密度至IO3條/ml備用。制備好的殺蟲晶體蛋白樣品加入適量50臟01/1似20)3溶液(pH9. 5)充分溶解。(2)生物測定過程。整個生物測定過程在超凈工作臺中進行。每孔中加入40μ I稀釋好的線蟲懸浮液(約40條)，然后加入260 μ I殺蟲晶體蛋白樣品，同時加入20 μ g/ml氯霉素抑制雜菌生長。每組處理3個重復，以50mmol/L Na2CO3(pH9. 5)溶液做陰性對照。置于 28°C培養(yǎng)箱中，用平皿蓋住細胞培養(yǎng)板，減少水分的蒸發(fā)。3天和7天時分別統(tǒng)計其死亡率， 將死亡率換算成校正死亡率。校正死亡率=處理組死亡率/(I-對照組死亡率)X 100%。(3)線蟲的觀察。統(tǒng)計死亡率時，將細胞培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察線蟲。死亡的甘薯莖線蟲蟲體僵直，略向腹部彎曲，呈半透明，易于與活蟲區(qū)分。經(jīng)過3天和7天后統(tǒng)計的12株Bt菌株對甘薯莖線蟲的生物活性測定結(jié)果如圖I 所示。從圖I可以看出，蘇云金芽胞桿菌YBT-008、YBT-032和H14菌株相較其余菌株在 3天時即可達到50%以上的致死率，在7天時可達到90%以上的致死率，殺蟲效果明顯。2、蘇云金芽胞桿菌YBT-008、YBT-032和H14對甘薯莖線蟲的生物活性比較將蘇云金芽胞桿菌YBT-008、YBT-032、H14和YBT-007 (做為對照)菌株的蛋白樣品分別稀釋二倍，按照同樣的方法再次測定它們對甘薯莖線蟲的生物活性。生物活性測定結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，將蘇云金芽胞桿菌￥81'-007、￥81'-008、￥81'-032和!114菌株的蛋白樣品稀釋二倍后，YBT-008在3天即達到90%以上的致死率，7天時即能完全殺死供試線蟲；而其余三個菌株蛋白樣品在稀釋二倍后，殺蟲效果并不顯著。本發(fā)明得到的蘇云金芽胞桿菌YBT-008菌株相較其余菌株具有非常高的殺蟲效率和殺蟲效果，為甘薯莖線蟲的生物防治提供了新型菌株資源，也為轉(zhuǎn)基因抗蟲甘薯品種提供了基因儲備資源。3、蘇云金芽胞桿菌YBT-008對甘薯莖線蟲的防治效果測定
以甘薯莖線蟲做為靶標線蟲檢測蘇云金芽胞桿菌YBT-008的生物活性。殺蟲晶體蛋白待測樣品和甘薯莖線蟲的準備按實施例I、二中所述，生物測定過程按實施例三中所述。整個實驗設(shè)置5 7個濃度梯度，每個濃度3個重復，50mmol/L Na2CO3 (pH9. 5)溶液做為陰性對照，20 μ g/ml氯霉素抑制雜菌生長，280C培養(yǎng)，7天后統(tǒng)計死亡率，將死亡率校正后換算成幾率值，蛋白濃度換算成對數(shù)值，求出二者之間的回歸方程并計算LC5tl，結(jié)果見表
Io表I蘇云金芽胞桿菌YBT-008對甘薯莖線蟲的防治效果測定
待測樣品_冋歸方程_R2值j_半致死濃度(MgAnL)
YBT-008_y=l. 6060x+2. 0150_0.9180_203. 76_實施例4蘇云金芽胞桿菌YBT-008殺蟲晶體蛋白及其編碼基因驗證分析 I、蘇云金芽胞桿菌YBT-008菌株蛋白的SDS-PAGE和LC-MS分析蘇云金芽胞桿菌YBT-008經(jīng)搖瓶培養(yǎng)約48_52h后，相差顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，芽胞和伴胞晶體均已形成，如圖3所示。待芽胞和伴胞晶體完全脫落后進行收集。殺蟲晶體蛋白樣品按照實施例一所述方法制備。溶解于Na2CO3溶液(pH9. 5)中的蛋白樣品加入等體積的2X上樣緩沖液(2X上樣緩沖液配方IOOmmoI/L Tris-Cl (pH6. 8)，200mmol/L 二硫蘇糖醇，4% SDS，0.2% 溴酚藍， 20%甘油)，混勻后，沸水浴中處理3-5min，12，OOOrpm離心5min，取上清液進行SDS-PAGE 電泳。SDS-PAGE電泳操作步驟參見Laemmli描述的方法(Laemmli, UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970(227) :680-685)。SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示，可以看出，YBT-008除可以產(chǎn)生130kDa大小的晶體蛋白外，尚能產(chǎn)生多種蛋白成分，對于這些未知成分蛋白進行LC-MS(液相色譜多級質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國ThermoFisher Scientific生產(chǎn))分析，通過LC-MS以期獲知YBT-008未知晶體蛋白的信息。在上述操作制備的凝膠上選取六個表達量最高的蛋白條帶，如圖5中 ①②③④⑤⑥所示，用干凈的刀片將其切下，置于I. 5ml離心管中，送樣進行LC-MS檢測，檢測單位為中國科學技術(shù)大學生命科學實驗中心。樣品①②③④⑤⑥的LC-MS結(jié)果分別如表2、3、4、5、6和7所示。據(jù)LC-MS結(jié)果， 蘇云金芽胞桿菌YBT-008產(chǎn)生的晶體蛋白為Cyt2Ba、CryllAa、Cry4Aa和Cry4Ba，其分子量分別為29kDa、72kDa、134kDa和128kDa,其對按蚊屬(Anopheles)、伊蚊屬(Aedes)和庫蚊屬(Culex)等均具有很高的毒性(喻子牛.蘇云金桿菌.北京科學出版社，1990)。2、蘇云金芽胞桿菌YBT-008殺蟲晶體蛋白編碼基因的分析(I)蘇云金芽胞桿菌YBT-008總質(zhì)粒的抽提蘇云金芽胞桿菌YBT-008經(jīng)過夜活化后，按1/100 (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，28°C，200rpm培養(yǎng)至對數(shù)中期。STE溶液(10mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA (pH 8.0))洗滌菌體 I 次后，加入 9(^1^溶液1(50_01/1蔗糖，25_01/1 Tris-HCl (pH
8.0)，IOmmoI/L EDTA)懸浮菌體，再加100mg/mL的溶菌酶(在溶液I中加溶菌酶)10 μ L,冰浴2h以上；加入200 μ L新鮮配制的溶液II (O. 2mol/L NaOH溶液，I %十二烷基硫酸鈉， 即SDS)，輕緩混勻后置冰上5 IOmin ;加150 μ L溶液III (5mol/LKAc溶液60mL,冰乙酸 11. 5mL,定容至IOOmL),混勻后置冰上放5min ；12, OOOrpm離心5min,吸取上清液到一個新的離心管，苯酚/氯仿/異戊醇溶液(體積比為25 24 Lv V V)抽提2次；上清液中加入2倍體積的無水乙醇或等體積的異丙醇，于室溫靜置5 IOmin ;12，000離心5min， 棄上清，加入70%乙醇，離心洗滌沉淀I次；真空干燥沉淀，用30 μ L含有20 μ g/mL RNase 的 TE 溶液(lmmol/L EDTA, 10mmol/T, Tris-HCl, pH 8. O)溶解沉淀。抽提得到的總質(zhì)粒經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖6所示。(2)蘇云金芽胞桿菌YBT-008殺蟲晶體蛋白基因的PCR驗證和序列比對分析依據(jù)EMBL 數(shù)據(jù)庫(http://www. ebi. ac. uk/embl/)中 cyt2Ba (序列登錄號 AAB63254)、cryllAa(序列登錄號 CAD30081)、cry4Aa(序列登錄號 CAD30148)和 cry4Ba(序列登錄號BAA00178)的CDS序列分別設(shè)計特異性引物對，進行PCR擴增。引物對序列如下。F_cyt2Ba:5， -CACTGTTCAGGACCTATT-3’
R-cyt2Ba:5’ -TATTGCCATAAATCTACC-3’F-cry11Aa : 5，-AGCACCAGCAGACCTATT-3，R-cry11Aa : 5 ’ -CTTGAAGTTGTAATCCCTAA-3 ’F_cry4Aa:5， -ACACCCTTAGGACTTGCT-3’R-cry4Aa:5’ -GTGTTCCCAATGTTAGCC-3’F-cry4Ba:5， -TAATACTCCAACGCCTGAAA-3’R-cry4Ba:5’ -ATGGGAATCCTGACATACGA-3’25 μ I PCR 反應(yīng)體系為10 X buffer 2· 5 μ 1，lOmmol/L dNTP I μ 1，10umol/L 的上下游引物各0.5 μ 1，模板(ΥΒΤ-008總質(zhì)粒)0. 5 μ 1，Taq酶0. 25 μ 1，補加去離子水至 25 μ I。PCR擴增反應(yīng)程序為第I步94°C預變性5min ;第2步94°C變性lmin，第3步55°C 復性45s，第4步72°C延伸2. 5min ;第5步轉(zhuǎn)到第2步繼續(xù)運行29個重復；第6步72°C延伸 5min。PCR擴增完成之后的電泳檢測結(jié)果如圖7所示，分別擴增得到了 507bp(cyt2Ba)、 699bp (cryllAa)、2348bp (cry4Aa)和 2341bp (cry4Ba)的特異性 DNA 片段，與預期目標片段
大小一致。將擴增得到的目標片段通過PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購自愛思進生物技術(shù)杭州有限公司)純化回收后通過T/A克隆連接到T載體pMD18-T Simple Vector上(購自寶生物工程大連有限公司)，之后將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5 α，并涂布氨芐青霉素抗性平板(AmpK，終濃度為100μ g/mL)。將抗性平板置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12_16h，待轉(zhuǎn)化子長到一定大小以后，通過質(zhì)粒快檢(大腸桿菌質(zhì)粒快檢方法參考張桂敏等，一種簡便快速篩選重組子的方法，湖北大學學報(自然科學版)，2005，27 (3) =280-281.)對轉(zhuǎn)化子進行篩選。將篩選到的轉(zhuǎn)化子用5mL的液體LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒進行酶切驗證， 酶切片段大小與預期大小一致。最后將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子用5mL的液體LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，取ImL的過夜培養(yǎng)物送樣測序(由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。cyt2Ba、cryllAa、cry4Aa和cry4Ba擴增片段經(jīng)測序后得到的核苷酸序列分別如SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示，將其分別與數(shù)據(jù)庫中 cyt2Ba> cryllAa、cry4Aa和cry4Ba的CDS序列進行Blast比對，比對結(jié)果分別如圖8、圖
9、圖10和圖11所示。Blast比對結(jié)果顯示，測序得到的核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中cyt2Ba、 cryllAa、cry4Aa和cry4BaO)S序列的同源性均在98%以上,排除測序誤差的影響,可以肯定，蘇云金芽胞桿菌YBT-008中含有能編碼Cyt2Ba、CryllAa、Cry4Aa和Cry4Ba的殺蟲晶體蛋白基因。表2YBT-008 SDS-PAGE切膠樣品①的LC-MS結(jié)果
_蛋白質(zhì)類期_Mscot分值分子量NCBI登錄號
1unnamed protein product [Bacillus thuringiensis]730.36127684.240354
2pesticidial crystal protein cry4BA [Bacillus thuringiensis serovar is·raelensis]730.36127684.221685442
3pesticidial crystal protein cry4BA [Bacillus thuringiensis serovar israelensis]730.36127684,2161598576
4130 kDa crystal protein [Bacillus thuringiensis]730.36127684.260459410
5unnamed protein product [Bacillus thuringiensis]720.36127769.340310
6130 kDa insecticidal protein (ISRH4) [Bacillus thuringiensis serovar israelensis]702.33134454.4216290
7pesticidial crystal protein cry4AA [Bacillus thuringiensis serovar israelensis]702.33134454.421685485
8pesticidial crystal protein cry4AA [Bacillus thuringiensis serovar israelensis]702.33134454.4161598618
91405201B insecticidal protein ISRH4702.33134454.4225983
10pesticidaJ crystal protein [Bacillus thuringiensis]690.36127557.2149211793
11unnamed protein product [Bacillus thuringiensis]662.33134436.440352
12pesticidal crystal protein [Bacillus thuringiensis]660.33127454.3149211799
13130 kDa insecticidal protein (ISRH3) [Bacillus thuringiensis serovar israelensis]650.36127542.2216288
141405201A insecticidal protein ISRH3650.36127542.2225982
15delta-endotoxin [Bacillus thuringiensis serovar israelensis]650.36127551.157639076
16Cry4A [Bacillus thuringiensis]650.33134460.5124263655
17Cry4A [Bacillus thuringiensis]620.33134609.6148787933
18Cry4A [Bacillus thuringiensis]614.33134491.6148787929
19pesticidal crystal protein [Bacillus thuringiensis]606.33127539.3149211803
20pesticidal crystal protein [Bacillus thuringiensis]600.33127186.0149211797
21Cry4A [Bacillus thuringiensis]600.33134444.5148787937
23mosquitocidal protein552.36128426.1142738
24Cry4A [Bacillus thuringiensis]540.33134755.7148787931
25Cry4A [Bacillus thuringiensis]540.33134755.7148787935
26pesticidal ciystal protein [Bacillus thuringiensis]460.32127136.0149211801表3YBT-008SDS-PAGE切膠樣品②的LC-MS結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株對甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌,其特征在于，該菌株為蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)YBT-008,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO M2011039o
2.包含權(quán)利要求I所述菌株的微生物菌劑。
3.權(quán)利要求I中所述的蘇云金芽胞桿菌YBT-008在防治甘薯莖線蟲中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I中所述的微生物菌劑在防治甘薯莖線蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物殺蟲農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一株對甘薯莖線蟲具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌的篩選及其在防治甘薯莖線蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明從蘇云金芽胞桿菌中篩選出一株對甘薯莖線蟲具有高毒力的菌株YBT-008，該菌株保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2011039。本發(fā)明還包括由YBT-008制備的微生物菌劑對甘薯莖線蟲的防治效果應(yīng)用，以及YBT-008可產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白的類型，包括Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba的驗證，證明本發(fā)明中的微生物及其菌劑屬于一種新的殺甘薯莖線蟲微生物。
文檔編號C12N1/20GK102703338SQ20111007505
公開日2012年10月3日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者何進, 侯艷飛, 劉金輝, 喻子牛, 孫明, 李明順, 王慧, 班虎棟 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學