專利名稱：水稻根特異啟動子Os03g01700及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，具體地說，本發明涉及水稻0s03g01700基因的啟動子序列，即從該基因ATG開始上游-l-3500bp之間的核苷酸序列，該啟動子序列能夠在水稻轉基因調控體系中驅動目標基因在根中特異表達。發明還涉及該序列在基因工程及遺傳改良中的應用。
背景技術：
植物基因工程技術的成功應用不僅需要大量調控不同水平的啟動子，而且需要適合于不同植物背景、不同的器官、組織、轉基因類型的啟動子以避免在轉基因過程中的不利影響。一直以來，非植物內源的組成型啟動子，來自于花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV 35S(0dell et al.，1985)有著重要的利用價值，能驅動目的基因在單、雙子葉轉基因植物的所有組織中高效表達(Battraw and Hall, 1990 ；Benfey et al.， 1990a)。植物內源的組成型的啟動子ZmUbil是另一個在植物轉基因中被廣泛使用的啟動子，它來自于玉米泛素，是植物內源啟動子。研究還發現，ZmUbil啟動子在單子葉植物許多的細胞中都有很高的活性，能夠調控目的基因在根、葉中強烈表達，但表達水平隨著器官的成熟顯著下降(Cornejo et al.，1993)。但是，由于組成型啟動子驅動的基因在植物的不同組織、不同生長階段均有高水平的表達，在應用中逐漸暴露出一些問題(Napoli et al.，1990)。外源基因在植物體內大量表達產生許多的異源蛋白或者產生有害物質在植物體內積累，打破了植物體內原有的代謝平衡，影響了植物正常的生長發育，例如生長延緩、開花延遲、甚至造成植物不育或死亡(Pino et al.，2007)。另外，在同一個載體中同時驅動幾個不同的基因表達而重復使用同一個組成型啟動子容易造成同源基因的沉默與失活或者共抑制現象(Lessard et al., 2002 ；Potenza et al.，2004)。因此，尋找一些能在細胞、組織、器官以及發育各階段上更為專一地調控基因表達的啟動子進行遺傳載體的構建，在可控的條件下為基礎研究和作物改良創造所需性狀顯得尤為必要。特異性啟動子調控基因只在特定的器官、組織、細胞及不同的發育階段表達，因而可以用于以莖葉為主要收獲產物的作物，使蛋白質產物富集于莖葉中，減少宿主植物無謂的物質能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以種子、果實為主要收獲產物的作物，讓抗蟲、抗除草劑等外源基因只在莖葉部分而不在種子果實等器官中表達，以提高轉基因作物的生物安全性(Dale et al.，2002)，在植物基因工程研究中具有廣泛的應用前景。目前，大多數組織特異啟動子的研究主要集中在植物的地上部分，根特異啟動子的研究及應用還很少(Potenza et al.，2004)。然而，根是植物體的地下部分，它是植物進行營養、運輸、儲存等生理功能的重要器官。由于植物根與土壤的廣泛接觸，根特異啟動子的研究具有廣泛的應用價值。利用根特異啟動子可以進行土壤污染的生物修復，提高植物的抗旱能力和對鹽、堿的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增強對病原微生物的抵抗力等；同時，利用根特異啟動子研究植物根的發育，根系的形態建成和根構型的重建并進行作物的遺傳改良具有重要意義。植物內源的根特異啟動子被開發應用之前，非植物內源的的根特異啟動子rolD 在根特異表達的轉基因研究中發揮著重要作用。發根農桿菌含有Ri質粒，侵染植物后能誘發植物細胞產生毛發狀根，即發根瘤。農桿堿型Ri質粒的T-DNA是由左、右兩個片段組成， rolD位于TL-DNA上。rolD5'端 _373bp顯示出根特異和高水平的表達。序列分析顯示啟動子區存在一個根特異的基序(RSEs) (Keller and Baumgartner, 1991 ；Elmayan and Tepfer, 1995) 0 rolD啟動子現已用于氮的同化研究，包括根特異的胞質型谷氨酰胺合成酶基因和高親和硝酸鹽轉運體基因的超表達(Fei et al. ,2003 ；Fraisier et al., 2000)。另一個非植物來源的根特異啟動子是CaMV 35S上游_90bp Domain A(Benfey and Chua, 1989)但表達水平比rolD低5-10倍，主要在根尖表達(Elmayan and Tepfer, 1995)。長期以來，煙草根特異表達基因TobRB7在根特異表達的植物轉基因研究中起著重要作用，實驗顯示在主根的頂端分生組織、不成熟的維管組織和側根中表達很高，而在在熟的葉、莖、莖尖分生組織中沒有表達(Conkling et al.，1990)。TobRB7轉錄起始位點上游636bp序列分析顯示其足夠調控目的基因在根中特異表達，而299bp長的區域不能調控目的基因在根里特異表達，在_813bp -636bp存在一個負調控元件(Yamamoto et al.，1991)。隨著研究的深入，相繼報道了一些植物根特異的啟動子(Xu et al. , 1995 ； Schiinmann et al. , 2004 ；delCampillo, 2004 ；Koyama et al. , 2005 ；Nitz et al. , 2001 ； Vijaybhaskar et al. ,2008 ；Liu et al. ,2003 ；Winicov et al.，2004)，然而，能夠在基因工程遺傳改良和農業生產中應用的仍然很少。直到最近，編碼擬南芥根特異表達的黑芥子酶(myrosinase)的PIlO啟動子(Nitz et al.，2001)調控CKX3在擬南芥根中特異表達， 與野生型材料相比，轉基因植株形成了龐大的根系，主根伸長，根生物量增加，植株地下部與地下部比率加大，而地上部未受任何影響，提高了作物抗旱及吸引礦物質的能力(Werner et al. ,2010) ο另外，用根特異啟動子RCc3 (Xu et al.，1995)與組成型啟動子G0S2調控 OsNACIO在水稻中過表達研究發現，與G0S2 OsNAC 10相比，RCc3 OsNAC 10使根變大，增強了對干旱的耐受性，在干旱條件下顯著提高了作物的產量(Jeong et al.，2010)。綜上所述， 在植物中，特別是水稻等禾谷類作物基因工程遺傳載體構建中能夠選用的植物內源的根特異啟動子仍然很少，因此，發展更多的水稻等禾谷類作物的根特異啟動子對基礎研究和生產應用具有重要的意義。關于水稻0s03g01700啟動子調控外源基因根特異表達及應用目前還未見相關報道。文中所用的參考文獻具體如下1, Battraw MJ, Hall TC (1990) Hi s tochemi cal analysis of CaMV 35Spromoter-β -glucuronidase gene expression in transgenic rice plants. 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發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種水稻根特異啟動子0s03g01700及其應用。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種從水稻根中克隆的0s03g01700啟動子序列(ATG上游-l—3500bp)，如SEQ ID NO 1所示的啟動子序列，也包括與SEQ ID NO 1 所示的啟動子序列至少有80%同源性的基因序列。另外，也包括在SEQ IDNO :1中添力卩、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發明的目的。本發明還提供一種用0s03g01700進行高效的植物轉化的方法，具體地說，本發明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列的基因片段的載體。本發明還提供了一種利用0s03g01700構建遺傳載體達到植物根特異表達外源基因的方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種水稻根特異啟動子0s03g01700，其為SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列。作為本發明的水稻根特異啟動子0s03g01700的改進還包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。本發明還同時提供了上述水稻根特異啟動子0s03g01700的用途，用于構建根特異表達的轉基因植物載體。本發明還同時提供了一種轉基因植物細胞，其包含SEQ ID NO 1所示的啟動子的轉基因植物細胞。本發明的具體內容如下我們從水稻基因芯片中發現了 7個在水稻根中特異表達的基因，它們是 0s09g24370,0s04g44060,0s03g01700,0s02g44080,0s02g44310,0s03g01300,0s02g37190。 根據 TIGRE(http://rice.plantbiology.msu. edu/)注釋，0s03g01700 屬于檸檬酸鹽轉運體基因，位于3號染色體上，1419nt，具兩個外顯子和一個內含子。RT-PCR及qRT-PCR等實驗顯示，0s03g01700在水稻的葉和小穗中沒有表達，在根中表達量很高，是水稻根特異表達基因。另外，在水稻根中mRNA表達豐度很高，與OsACTIN 比較，他們的表達水平基本一致。因此，0s03g01700是水稻根特異表達基因，并且基因的表達水平很高。通過將0s03g01700啟動子(ATG上游_3500bp -Ibp)與報告基因⑶SPlus融合進行遺傳受體材料的轉化研究，我們發現0s03g01700啟動子調控下游報告基因在水稻的主根、側根的表皮、皮層、內皮層、木質部、韌皮部及側根原基發生的細胞中都有表達，但在根冠、根毛、根莖結合部、地上部分的莖、葉、穎殼、種子、雄蕊和雌蕊中沒有表達。進一步說明了 0s03g01700啟動子能夠調控目的基因在根中特異表達。為了利用根特異啟動子進行作物改良，我們構建了 _3500bp 0s03g01700 promoter:0sPT2載體(簡稱3P:0sPT2)，進行了水稻轉基因。實驗結果顯示0s03g01700啟動子能夠調控水稻磷轉運子0sPT2在根中特異表達。有效磷測定顯示，在正常營養液中，轉基因材料與野生型比葉的有效磷含量增加了 2-3倍，而根里的有效磷含量與野生型一致， 證明根中0sPT2的超量表達引起水稻植株地上部有效磷的積累。因此，水稻根特異啟動子 0s03g01700能夠成功調控0sPT2在根中特異表達。以上結果表明，我們克隆的水稻根特異啟動子0s03g01700具有一定的應用價值。我們可以通過利用該啟動子對作物品種進行轉基因改造，如通過該啟動子調控外源基因在根中的特異表達進行土壤污染的生物修復，提高植物的抗旱能力和對鹽、堿的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增強對病原微生物的抵抗力等；同時，利用根特異啟動子研究植物根的發育，根系的形態建成和根構型的重建并進行作物的遺傳改良。
下面結合附圖對理解本發明作進一步的詳細描述，但并非對發明作限定。圖1是水稻根特異表達侯選基因在根、葉、花中的表達譜分析(RT-PCR分析)； 如圖所示，0s09g24370(未知基因)，0s04g44060 (水通道 PIP2. 3 基因)，0s03g01700(檸檬酸鹽轉運體)，0s02g44080(水通道TIP2. 1)，0s02g44310 (皮層細胞表達蛋白)， 0s03g01300(皮層細胞表達蛋白)，0s02g37190(未知基因，表達蛋白)。圖上顯示 0s03g01700在水稻的根中表達強烈，但在葉及花中沒有表達。圖2是水稻根特異表達侯選基因在根、葉、花中的表達的qRT-PCR分析；結果顯示 0s03g01700為根特異表達基因。圖3是水稻根特異表達侯選基因0s03g01700與OsACTIN在根、葉、花中表達水平的比較；顯示0s03g01700在根與OsACTIN的表達水平很接近，為高水平表達，同時 0s03g01700在葉和花中沒有表達，說明其是一個根特異的高水平表達的基因。圖4是0s03g01700與OsACTIN在水稻根特異表達的標準曲線；顯示OsACTIN的標準曲線R2 = 1 ；0s03g01700的標準曲線R2 = 0. 9984 ；說明標準曲線線性較好。圖5是水稻根特異表達侯選基因0s03g01700絕對定量分析；顯示與植物中表達水平比較高的看家基因OsACTIN作為對照，根中0s03g01700的表達水平約為OsACTIN的 82. 1% ；葉中0s03g01700的表達水平約為OsACTIN的0. 02% ；花中0s03g01700的表達水平約為OsACTIN的0. 045% ；以上結果進一步充分說明0s03g01700為水稻根特異表達的基因。圖6是⑶S plus載體示意圖。圖7是水稻根特異表達基因0s03g01700驅動報告基因⑶S載體構建示意圖。圖8是水稻根特異表達基因0s03g01700驅動報告基因⑶S的表達分析；顯示0s03g01700 promoter:GUS在水稻的主根、側根(圖a)、根尖(圖b)有強烈的⑶S表達。將⑶S染色的根尖進行樹脂包埋，橫切觀察，在根的表皮(印idermis，Ep)、皮層(cortex，Co)、內皮層(endodermis，En)、木質部(xylem，X)、韌皮部(phloem, Ph)(圖 c) 及側根原基部位(lateral root primordium, LRP)(圖d)均有⑶S強烈表達。根毛(圖 a)、根冠(圖b)、根莖結合部(圖e)、地上部的穎殼(圖f)、雄蕊和雌蕊(圖g)、莖(圖h)、 葉(圖i)、種子(圖j、k)均沒有⑶S表達。圖9是構建水稻根特異表達超0sPT2選用的載體pGOFSl。圖10是水稻根特異表達超0sPT2載體基本載體pG0FSl-R。圖11 是過渡載體 pG0FSl-R-P。圖 12 是過渡載體 pGOFSl-R-P-G。圖13是0s03g01700啟動子驅動水稻磷轉運子0sPT2根特異的超表達轉化載體 PG0FS-R-3P的構建示意圖。
圖14是0s03g01700啟動子驅動水稻磷轉運子0sPT2在轉基因水稻TO代植株陽性材料鑒定；圖中DL2000為DNA marker, WT(wild type，野生型)作為對照，數字1_10分別表示10個轉基因株系，即株系1、株系2、……、株系10，結果顯示在隨機選取的3P:0sPT2 10個TO轉基因株系中，有9個潮霉素篩選為陽性，陽性率為90%。圖15是0s03g01700啟動子驅動水稻磷轉運子0sPT2在轉基因水稻TO植株中根和葉中的超表達檢測(qRT-PCR分析)，圖中WT為水稻日本晴野生型，數字表示獨立的轉基因株系編號；顯示在隨機選取的9個轉基因材料中，株系2、4、5、6、7共5個株系成功實現根特異超表達。另外，有2個株系3和10根和葉都超表達，但根中表達水平比葉中更高。盡管各株系之間表達水平不一，根特異超表達率達56%，說明0s03g01700啟動子介導的根特異超表達是成功的，0s03g01700啟動子是一個根特異啟動子。圖16是0s03g01700啟動子驅動水稻磷轉運子0sPT2在轉基因水稻TO植株拷貝數鑒定；圖上顯示了水稻日本晴野生型(wild type, WT)和4個TO代轉基因株系3P:0sPT2_2、 3P:0sPT2-4、3P:0sPT2-6、3P:0sPT2-7 Southern blot雜交結果，結果表明四個株系分別為獨立株系，其中3P:0sPT2-4為單拷貝的株系3P:0sPT2-2、3P:0sPT2-6、3P:0sPT2-7為多拷貝株系。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明范圍。實施例1、根特異表達基因的篩選一、樣品制備挑選飽滿的日本晴野生型水稻種子剝殼用清水沖洗，后換成清水浸泡，于37°C浸種至露白(1-2天)，期間早晚換水。將發芽的種子直播于3L水稻全營養液中( !1值5.5)， 水稻全營養液母液配方見(表1)，水稻全營養液的具體配制如下，即每4L培養液中加I-VI 號貯備液各5ml，調節pH值至5. 5。于水稻光溫可控生長室(白天30°C，夜晚22°C，光強 30001UX，光照時間12小時)中生長10天。對地上部和根部分別取樣。另取于正常營養液生長至抽穗開花期水稻的小穗，用液氮凍存。所有樣品均在-70°C保存以備RNA提取。表1、水稻完全營養液配方和母液配方(EDTA-Fe)；
試劑每10升母液中的克數
Γ NH4NO3914 1 IcaCl2886
Π MgS04-7H203240
Π K2SO4714
!V NaH2P04-2H2040權利要求
1.水稻根特異啟動子 似7洲，其特征是為SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的水稻根特異啟動子《sft%^77i^，其特征是還包括在SEQID NO 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
3.如權利要求1、2所述的水稻根特異啟動子的用途，其特征是用于構建根特異表達的轉基因植物載體。
4.一種轉基因植物細胞，其特征是包含SEQ ID NO :1所示的啟動子的轉基因植物細胞。
全文摘要
本發明公開了一種水稻根特異啟動子Os03g01700，其為SEQIDNO1所示的核苷酸序列。該水稻根特異啟動子Os03g01700能用于構建根特異表達的轉基因植物載體。本發明還提供了一種轉基因植物細胞，其包含SEQIDNO1所示的啟動子的轉基因植物細胞。通過該啟動子調控外源基因在根中的特異表達能提高植物的抗旱能力和對鹽、堿的耐受力等。
文檔編號C12N15/113GK102242119SQ20111007378
公開日2011年11月16日 申請日期2011年3月25日 優先權日2011年3月25日
發明者劉于, 劉紹軍, 吳平, 張為民, 張帆, 李援亞 申請人:浙江大學