專利名稱：一種提高豆科樹種抗干、熱能力的t49ma菌株及其根瘤化種苗的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種生物菌種資源，尤其是一種能有效提高干熱河谷地區豆科樹種快速生長及具有優良抗逆性即抗干、熱能力的菌株及其根瘤化種苗的培養方法。
背景技術：
在自然界中，普遍存在著由根瘤菌(root nodule bacteria)與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的共生體系，可以增加土壤中的氮素來源。提高宿主吸收磷、鉀等多種營養元素及水分，因此，增強了宿主植株的抗逆性和抗病性，使宿主產量增加和品種提高，促進了植物的生長發育。豆科樹種具有較高的經濟價值，其本身對不良環境抗逆性強，在改良土壤、提高土壤肥力、保持水土和改善生態環境中具有顯著優勢。原因在于豆科植物可以與細菌中的共生固氮菌如根瘤菌共生，起到固氮作用，為植物提供的氮素營養，有利于植物的生長。豆科植物與根瘤菌的共生固氮量可以滿足豆科植物三分之一到二分之一的氮素需要。在我國，固氮的豆科樹種和根瘤菌的資源是十分豐富的。而豆科樹種中又有很多具有速生、耐瘠薄、耐干旱的樹種。與豆科樹種共生固氮的根瘤菌除了能夠和豆科植物共生提高豆科植物的固氮能力外，其本身也具有一定的抗逆性，因此，在造林時選用能夠固氮的豆科樹種以及人工篩選出具有抗逆性強、適宜干熱河谷地區造林用的根瘤菌接種到豆科樹種上，則可以提高豆科樹種的結瘤和固氮能力，且在受到不利于植物生存的環境壓力時也可以讓植物更好的生存。干熱河谷是西南橫斷山脈地區河谷深切所形成的特有氣候類型，在中國西南地區分布非常廣泛。其氣候特征是年平均溫21—23度，最冷月均溫14一15度，不小于10 度，積溫7900— 8700度，年均降水量600— 800mm，年均蒸發量2700— 3800mm，其蒸發量大于降水量3—6倍，降水集中，年均降水量有80%—90%集中于雨季，干季更加干旱。由于干熱河谷地區的氣候特征使得該地區的植被一旦破壞就極難恢復，因此在對該地區造林時， 需要重視樹種的選擇以保證植被在受到干熱環境脅迫時能夠安全度過危險期。然而到目前為止，國內對此問題的研究還處于初期階段，尚未取得突破性進展。
發明內容
本發明的目的是提供一種提高干熱河谷地區豆科樹種生長及具有高效抗旱性能的菌株，使之能在干熱河谷地區造林恢復生態系統中得到有效的應用，同時提供一種該菌株根瘤化種苗的培養方法。本發明的提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株是日本慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No :4590，保藏日期2011年02 月18日。
該菌株是在干熱河谷野外選擇采集的具有抗干、熱能力的山毛豆根瘤中經過分離純化、鏡檢、回接獲得的菌株。該菌株在YMA培養基中培養7-10天，菌落呈圓形，表面光滑、邊緣整齊，隆起形狀低凸，透明度較好。液體培養的培養液渾濁、無可溶性色素及菌內分化。本發明T49MA菌株根瘤化種苗的培養方法如下
(1)選擇豆科植物為宿主；
(2)將本發明的菌株^ra辦力i腫japonicum,CGMCC No :4590在YMA培養基中進行培養擴繁；
(3)將選擇的豆科植物種子進行常規消毒后待用，或是將消毒的種子進行催芽使其長出小苗；
(4)在經擴繁后的本發明W^Bmdyrhizobiumjaponicum的菌液中加入按重量份計分別為1份泥炭或草炭、1份蛭石、1份經滅菌的干腐質土和1份經滅菌的泥土，并進行攪拌形成根瘤菌劑基質；
(5)將步驟(3)中的種子或是小苗根用根瘤菌劑基質包裹后種植于穴盤中，管護中保持適度溫度，置于陰涼通風處栽培，期間只需葉部噴灑水，3周后移入溫室中，進行正常水、肥管理，3. 5月后即可得根瘤化種苗。所述的YMA培養基配方為，在IOOOmL培養基中分別含有甘露醇10. 0g，K2HPO4 0. 25g, KH2PO4 0. 25g, MgSO4 · 7H20 0. 20g, NaCl 0. IOg, CaCl2 · 6H20 0. 10g，酵母粉 0. 80g, 瓊脂 15. 0g;其 pH 值為 6. 8 -7.0。本發明菌株是在對野外干熱河谷地區的絕大數的豆科樹種根瘤進行采集分離培養，并將該菌株與宿主共生培養，經過抗干熱實驗驗證后篩選出來的。該菌株適合絕大多數的豆科植物，具有較高的結瘤和固氮能力，同時具有較強的抗干、熱能力。對干熱河谷地區從未種植過豆科植物的土壤，由于其缺乏甚至沒有相應的土著根瘤菌，因此必須予以接種根瘤菌才能有效地提高干熱河谷地區豆科樹種快速生長及抗旱能力。本發明的這種菌株是在干熱河谷地區篩選出的抗干、熱的優良菌株，能有效地提高干熱河谷地區豆科樹種快速生長及抗旱能力，因此，對干熱河谷地區的植被恢復以及受到干、熱環境脅迫時豆科樹種能夠安全度過危險期，保證大面積在干熱河谷地區造林的成活率具有重要的利用價值。
具體實施例方式實施例1 本發明的菌株是在經過選用2004年在云南省元某、元江及東川三個干熱河谷地區野外采集具有抗干熱的豆科樹種，如臺灣相思等的根瘤進行分離培養，通過對不同豆科樹種無菌種苗的共生培養試驗，待根瘤化后，對根瘤化種苗進行抗干、熱試驗，通過生物量測定、根瘤形態觀察及根瘤數量等指標，選擇能明顯促進樹木生長和抗干熱能力、 并與對照生物量達到顯著差異的優良菌株進行分子鑒定后篩選出的。該菌株的特點是抗干熱能力強，對多個樹種具有結瘤能力，接種成功后能提高宿主的抗干熱能力。整個實驗過程從2004年6月份開始在西南林業大學實驗室和溫室大棚內進行，本發明菌株培養的抗干、 熱種苗成活率達到了 98%以上，具體的種苗繁育過程如下
豆科樹種根瘤菌的篩選首先采集干熱河谷野外具有抗干熱的豆科重要樹種，如山毛豆的飽滿、圓潤的根瘤，將根瘤在4度冰箱中冷藏1周，用流水沖洗20分鐘，在70 75%的酒精中表面消毒30 50秒，無菌水漂洗一次，又用m的次氯酸鈉消毒20分鐘，用無菌水沖洗4 5次，再以0.1%的升汞溶液消毒10 15分鐘，最后用無菌水沖洗5次。取滅菌的培養皿3-4個，每皿加滅菌水0. 5ml，將以上根瘤放入第一皿中用滅菌玻棒搗碎，靜置30min 使組織內細菌流入水中配成懸浮液，用接種環從第一皿內移植2-3環到第二皿內充分混合后再移植到第三皿，依次稀釋到最后一皿將熔化的YMA根瘤菌培養基冷卻到一定溫度后倒入每個皿中，使培養基與菌懸液混勻，冷卻后翻轉培養皿在30°C培養箱培養，直到分離到純菌落進行菌種保存(為一級菌種)。根瘤菌二級菌種培養將分離得到的純菌種在YMA液體中進行培養。YMA液體培養基配方為在IOOOmL培養基中分別含有甘露醇10. 0g, K2HPO4 0. 25g, KH2PO4 0. 25g, MgSO4 · 7H20 0. 20g, NaCl 0. IOg, CaCl2 · 6H20 0. IOg,酵母粉 0. 80g,其 pH 值為 6. 8 _7· 0， 每50毫升三角瓶中加入2接菌環的根瘤菌，搖床培養7天，即得渾濁根瘤菌液體菌液。根瘤菌三級菌種培養取上述菌液1升與等重量的泥炭1kg、蛭石1kg、經過121度 1. 5小時高壓滅菌的干腐殖土 Ikg和泥土 Ikg攪拌混勻，形成根瘤菌的三級菌種。接種試驗和根瘤化過程選擇一種豆科植物，如相思樹種、山毛豆，種子消毒、催芽后，將其小苗用根瘤菌三級菌種基質包裹種植于穴盤中，在適度溫度下，置于陰涼通風處栽培，期間向葉部噴灑水，促進種子萌發或新根生長，3周后移入溫室中進行正常水、肥、藥管理，3. 5月后即可得根瘤化種苗。
權利要求
1.一種提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株，其特征在于該菌株是日本慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號=CGMCC No :4590，保藏日期:2011年 02月18日。
2.如權利要求1所述的一種提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株根瘤化種苗的培養方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)選擇豆科植物為宿主；(2)將本發明的菌株^ra辦力i腫japonicum,CGMCC No :4590在YMA培養基中進行培養擴繁；(3)將選擇的豆科植物種子進行常規消毒后待用，或是將消毒的種子進行催芽使其長出小苗；(4)在經擴繁后的本發明W^Bmdyrhizobiumjaponicum的菌液中加入按重量份計分別為1份泥炭或草炭、1份蛭石、1份經滅菌的干腐質土和1份經滅菌的泥土，并進行攪拌形成根瘤菌劑基質；(5)將步驟(3)中的種子或是小苗根用根瘤菌劑基質包裹后種植于穴盤中，管護中保持適度溫度，置于陰涼通風處栽培，期間只需葉部噴灑水，3周后移入溫室中，進行正常水、肥管理，3. 5月后即可得根瘤化種苗。
3.如權利要求2所述的根瘤化種苗的培養方法，其特征在于所述的YMA培養基配方為，在 IOOOmL 培養基中分別含有甘露醇 10. 0g, K2HPO4 0. 25g，KH2PO4 0. 25g，MgSO4 · 7H20 0. 20g, NaCl 0. 10g，CaCl2 · 6H20 0. 10g，酵母粉 0. 80g，瓊月旨 15. Og ；其 pH 值為 6. 8 -7.0。
全文摘要
一種提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株及其根瘤化種苗的培養方法，涉及一種生物菌種資源，尤其是一種能有效提高干熱河谷地區豆科樹種快速生長及具有優良抗旱能力即抗干、熱能力的菌株及其根瘤化種苗的培養方法。本發明的T49MA菌株是Bradyrhizobiumjaponicum，CGMCCNo4590。根瘤化種苗的培養方法包括菌株的分離純化、鏡檢、回接和接種。本發明的這種菌株是在干熱河谷地區篩選出的抗干、熱的優良菌株，能有效地提高干熱河谷地區豆科樹種快速生長及抗旱性，因此，對干熱河谷地區的植被恢復以及受到干、熱環境脅迫時豆科樹種能夠安全度過危險期，保證大面積在干熱河谷地區造林的成活率具有重要的利用價值。
文檔編號C12R1/01GK102181391SQ20111006969
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月23日 優先權日2011年3月23日
發明者伍建榕, 周利平, 張東華, 曾小紅, 郭瑞超, 馬煥成 申請人:西南林業大學