專利名稱：一種分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，屬于生物化工技術領域。
背景技術：
丁醇是重要的精細化工原料，也是新型的可再生能源，有著十分廣泛的用途。在世界未來的能源結構中，可再生生物能源將占重要比重。近年來，科研人員在改良丁醇發酵菌種，改進丁醇發酵技術，提高丁醇產量和產率，降低丁醇成本等方面取得很大進展[鄭海洲等.丁醇生物發酵的研究進展.河北化工.2008，31(12)，36 37]。生物丁醇具有高能量、可混合性、低揮發性、污染少等優點，可以取代乙醇作為一種可再生的燃料添加劑 [Richard VN. Biobutanol enters battle of the alcohols[J]. Chemistry World, 2008, 5(2) :21 21]。工業上生產丁醇的方法有3種羰基合成法、醇醛縮合法和發酵法。其中羰基合成法和醇醛縮合法均屬于化學合成法，二者都以石油為原料，投資大，技術設備要求高。而丁醇生物發酵一般是利用丙酮丁醇梭菌在嚴格厭氧條件下進行的，其主要產物是丁醇、丙酮和乙醇，含量約為6:3:1，簡稱AB或ABE發酵[陳駒聲.發酵法丙酮和丁醇生產技術.北京化學工業出版社，1991]。然而實際發酵過程中丁醇轉化碳源的產率要比乙醇低的多，因此限制了丁醇燃料的發展[何景昌，張正波，裘娟萍.生物丁醇合成途徑中關鍵酶及其基因的研究進展. 食品與發酵工業.2009，35(2), 116 120]。制約丙酮、丁醇發酵產業發展的因素主要是溶劑產率、生產強度、生產成本，尤其是溶劑產率(單位質量的原料產生的總溶劑質量)低， 以玉米原料為例，總溶劑產率一般只有30%左右，這樣低的溶劑產率使得發酵法在和化學法競爭時處于劣勢。高濃度的底物對丙酮丁醇梭菌有較強的抑制作用，為防止底物對生物體的毒害作用，以一定的稀釋比率流加高濃度的底物，可以減小底物的抑制作用。不同的碳氮比對丁醇發酵特定的發酵時期——產酸期和產醇期有著不同的影響，可以使溶劑的產量得到提高。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，以提高丁醇和總溶劑的產量和產率，達到碳源的高效利用。為了解決上述問題，本發明的技術方案在于
一種分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養、厭氧發酵三步驟，其特征在于在厭氧發酵步驟中，在原始不含碳源的發酵培養基中加入10 20 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，接入種子液開始厭氧發酵，發酵進行8 12小時后再向發酵體系補加入40 50 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，至完成厭氧發酵。其中，本發明所述的發酵菌種是丙酮丁醇梭菌(C/^irii/i acetobutylicum)； 本發明所述的丙酮丁醇梭菌是 Clostridium acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M2010011)，丙酮丁醇梭菌 C/osirii/i腫 acetobutylicum ASl. 134(CGMCC 1. 134)，或者丙酮 Til Clostridium acetobutylicum ASl. 135 (CGMCC 1. 135)。本發明所述的菌種活化步驟是常規的丙酮丁醇梭菌所采用的菌種活化方法。在本發明中，菌種由凍存的甘油管中接入50 mL血清瓶的pH為6. 0 7. 0的含有淀粉的能提供碳源、氮源以及無機鹽的液體培養基中，通入隊或CO2，在恒溫培養箱中培養，溫度為30 40°C，活化培養12 M h，用于種子培養基接種和菌種保存。本發明所述的種子培養步驟是常規的丙酮丁醇梭菌所采用的種子培養方法。在本發明中，種子培養的培養基為PH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源以及無機鹽的液體培養基，培養時將500 mL血清瓶中加入種子培養基100 400 mL，通入隊或0)2，115 121°C滅菌15 30 min，冷卻后接入活化的種子液，培養溫度為30 40°C，在恒溫培養箱中培養，培養時間為8 16 h，用于發酵罐接種。本發明所述的厭氧發酵生產丁醇的步驟中，發酵培養的培養基為pH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的常規液體培養基，5 L發酵罐中發酵培養基的體積為2 4 L ；且厭氧發酵的操作和發酵條件也是常規的利用丙酮丁醇梭菌厭氧發酵產丁醇的方法，在本發明中，接種量為體積比5% 10%，溫度為35 40°C，發酵罐通入隊或C02， 以保持發酵體系的厭氧環境，攪拌轉速在100 200 rpm，發酵時間為48 72 h。本發明的有益效果在于
本發明通過在微生物發酵的不同階段控制補糖，達到葡萄糖的高效利用，提高了丁醇以及總溶劑的產率。本發明采在不同階段控制補糖，對于控制發酵的產酸和產醇，提高分批和連續發酵的丁醇和總溶劑產量，高效利用碳源都有重要的理論意義和應用價值。該方法同樣可以用于利用低劣生物質進行的丁醇發酵。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1
菌種丙酮丁醇梭菌 CZo1SiriiZi腫 acetobutylicum XY16 (CCTCC NO :M 2010011) 種子培養基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L，NaCl 2g/L， MgSO4 3g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, pH 6. 0 ；
發酵培養基(P2):碳源(葡萄糖 60 g/L 分消)，K2HPO4 0. 5g/L, KH2PO4 0. 5g/L， CH3COONH4 2. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, MnSO4 · H2O 0. Olg/L, NaCl 0. Olg/L, FeSO4 · 7H20 0.01g/L;玉米漿 lg/L。5L發酵罐培養時培養基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50 mL血清瓶中30 mL的種子培養基中，通入隊，在恒溫培養箱中培養，溫度為37°C，活化培養。培養 12h后，用無菌的移液槍將活化的菌種按5%的比例接入含有300 mL種子培養基的500mL血清瓶中，擴大培養，1 后用于上述發酵培養基接種(5L發酵罐)，接種量為10% (v/v)，攪拌轉速在120rpm，37°C發酵培養。接種后通入N2，通氣量為0. 25 vvm，IOmin后停止通氣，關閉通氣口，保證發酵的厭氧環境。補糖方式1 發酵培養基的總碳源需求為分消的葡萄糖，其總濃度為60 g/L;在原始不含碳源的發酵培養基中先加入10 g/L的葡萄糖后開始接入種子液發酵，發酵進行12 h后將余下的50 g/L的葡萄糖補入發酵罐中，并與對照組的發酵結果對比，發酵至總溶劑產量不再變化。結果如表1。
表1補糖方式1與對照組的發酵結果對比
權利要求
1.一種分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養、厭氧發酵三步驟，其特征在于在厭氧發酵步驟中，在原始不含碳源的發酵培養基中加入10 20 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，接入種子液開始厭氧發酵，發酵進行8 12小時后再向發酵體系補加入40 50 g/L的葡萄糖、木糖或者其組合，至完成厭氧發酵。
2.根據權利要求1所述的分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，其特征在于所述的厭氧發酵生產丁醇的微生物菌種為丙酮丁醇梭菌(C/osirii/i腫eicetobutylicum)。
3.根據權利要求2所述的分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，其特征在于所述的丙酮丁醇梭菌是 Clostridium acetobutylicum XY16，丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum ASl. 134,Clostridium acetobutylicum ASl. 135。
全文摘要
本發明涉及一種分階段補糖厭氧發酵生產丁醇的方法，屬于生物化工技術領域。本發明的技術方案包括菌種活化、種子培養、厭氧發酵生產丁醇三步驟，且根據丙酮丁醇梭菌在不同的碳氮比時顯示出的不同發酵特性，在同樣的總糖(濃度下調整了發酵的補糖策略，當選擇在發酵開始補糖10～20g/L，8～12h后再將余下的糖一次性補足，與在發酵開始補糖相比，丁醇產量提高了18.4%，總溶劑產量提高了19.3%，丁醇產率提高了39.5%，總溶劑產率可以達到0.424gABE/g糖，提高了35.9%。此方法提高了丁醇的產量和產率，操作簡便，碳源得到了更有效地利用，可顯著地提高丁醇的工業產量。
文檔編號C12R1/145GK102174596SQ20111006906
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月22日 優先權日2011年3月22日
發明者奚永蘭, 姜岷, 孫佰軍, 杜騰飛, 歐陽平凱, 賀愛永, 郭亭, 陳可泉 申請人:南京工業大學