專利名稱：一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種選育芽孢桿菌的方法，具體是一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，屬于生物技術(shù)與生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌(Bacillaceae)，細菌的一科，能形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌或球菌。 一般為好氧或兼性厭氧，革蘭氏染色呈陽性。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。在某種環(huán)境下，菌體內(nèi)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，經(jīng)過前孢子階段， 形成一個完整的芽孢。芽孢對熱、放射線和化學物質(zhì)等有很強的抵抗力。在化學組成方面， 在芽孢內(nèi)含有大量營養(yǎng)細胞中不存在的二吡啶羧酸的鈣鹽；在結(jié)構(gòu)方面，芽孢的原生質(zhì)外圍有三層膜，從內(nèi)到外是厚的皮層、孢子殼和孢子外膜。在芽孢桿菌屬中，對種的劃分是以菌體的大小、孢子的形狀及其在菌體內(nèi)的位置、糖的利用及其產(chǎn)物、能否還原硝酸，以及在高濃度的食鹽條件下能否生長等為依據(jù)。其廣泛分布在水、空氣和土壤中以及動物腸道等處。代表種是枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等。芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用，其中枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌可用于畜牧水產(chǎn)飼料添加劑和水環(huán)境凈化；蘇云芽孢桿菌可用于植物保護，殺滅害蟲；巨大芽孢桿菌具有解磷固鉀作用用來生產(chǎn)生物有機肥；多粘芽孢桿菌具有固定分子態(tài)氮的能力。在加工生產(chǎn)中芽孢桿菌是否能快速大量形成穩(wěn)定芽孢狀態(tài)關(guān)系整個生產(chǎn)及其后期保存使用的效果，其中高產(chǎn)芽孢率的芽孢桿菌種顯得尤其重要，所以采取措施建立一套快速有效的選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案根據(jù)芽孢的熱穩(wěn)定性特點，采用逐級加熱處理后培養(yǎng)的手段， 選育出高產(chǎn)芽孢率的芽孢桿菌，從而能夠在發(fā)酵生產(chǎn)過程中縮短發(fā)酵時間，降低生產(chǎn)成本， 延長成品保存時間，提高使用效果。實現(xiàn)本技術(shù)方案，包括以下步驟①芽孢桿菌激活將待選育的芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上， 30 38°C靜止培養(yǎng)3 5天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于50 60°C的水浴鍋中水浴1 他；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30 38°C靜止培養(yǎng)3 5天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于70 80°C的水浴鍋中水浴10 60min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30 38°C靜止培養(yǎng)3 5天；
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⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于90 100°C的水浴鍋中水浴1 5min ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30 38°C靜止培養(yǎng)5 7天，收集固體培養(yǎng)基上的菌落，得到高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌種；所述滅菌的固體培養(yǎng)基，為同一配方的培養(yǎng)基，其組分按質(zhì)量百分比計包括牛肉膏0. 30%、氯化鈉0. 50%、蛋白胨1.00%、瓊脂2. 00%，pH 7. 2 ；其滅菌條件為121°C、 0. llMpa，滅菌 20 30min ；所述芽孢桿菌為能形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌或球菌，包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等，優(yōu)選枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌或丁酸梭菌。本發(fā)明的一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，具有以下有益效果使用本發(fā)明選育出高產(chǎn)芽孢率的芽孢桿菌，能夠在發(fā)酵生產(chǎn)過程中快速形成芽孢，從而縮短發(fā)酵時間，降低生產(chǎn)成本，延長成品保存時間，提高使用效果。而且工藝簡單、 成本低廉，具有可操作性強的優(yōu)點。
具體實施例方式為了更好理解本發(fā)明，以下用實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1 ①芽孢桿菌激活將_70°C保存于甘油中枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)4天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于的水浴鍋中水浴池；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)4天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于75°C的水浴鍋中水浴30min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)4天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于95°C的水浴鍋中水浴aiiin ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)5天后得到高芽孢率的枯草芽孢桿菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基，其組分按質(zhì)量百分比計包括牛肉膏0. 30%、氯化鈉0. 50%、蛋白胨1. 00%、瓊脂2. 00%, pH 7.2; 其滅菌條件為121°C、0. llMpa，滅菌25min)；將得到的高芽孢率枯草芽孢桿菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基，其組分按質(zhì)量百分比計包括牛肉膏0. 30%、蛋白胨1. 00%、氯化鈉0. 50%、酵母膏0.04%、氯化鐵0.02%、碳酸鈣0.02%、硫酸錳0.01%，pH 7. 2 ；其滅菌條件為121°C、 0. llMpa，滅菌25min)，30°C、150rpm培養(yǎng)48h后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察，96%形成芽孢。實施例2
①芽孢桿菌激活將-70°C保存于甘油中地衣芽孢桿菌(ATCC 11946)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C靜止培養(yǎng)5天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于60°C的水浴鍋中水浴證；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C 靜止培養(yǎng)5天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于78°C的水浴鍋中水浴35min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C 靜止培養(yǎng)5天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于96°C的水浴鍋中水浴aiiin ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C靜止培養(yǎng)7天后，得到高芽孢率的地衣芽孢桿菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基的配方， 同實施例1的固體培養(yǎng)基)；將該高芽孢率的地衣芽孢桿菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基的配方，同實施例1液體培養(yǎng)基)，37°CU50rpm培養(yǎng)7 后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察， 94%形成芽孢。實施例3 ①芽孢桿菌激活將-70°C保存于甘油中巨大芽孢桿菌(ATCC 14581)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)5天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于58°C的水浴鍋中水浴證；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)5天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于74°C的水浴鍋中水浴40min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)5天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于98°C的水浴鍋中水浴:3min ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)7天后，得到高芽孢率的巨大芽孢桿菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基的配方， 同實施例1的固體培養(yǎng)基)；將該高芽孢率的巨大芽孢桿菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基的配方，同實施例1的液體培養(yǎng)基)，30°C、150rpm培養(yǎng)4 后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察， 98%形成芽孢。實施例4 ①芽孢桿菌激活將_70°C保存于甘油中凝結(jié)芽孢桿菌(ATCC 7050)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)5天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于60°C的水浴鍋中水浴證；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)5天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于78°C的水浴鍋中水浴50min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)5天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于98°C的水浴鍋中水浴^iin ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)7天后得到高芽孢率的凝結(jié)芽孢桿菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基的配方，同實施例1固體培養(yǎng)基)；將該高芽孢率的凝結(jié)芽孢桿菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基的配方，同實施例1液體培養(yǎng)基)，30°CU50rpm培養(yǎng)4 后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察， 97%形成芽孢。實施例5 ①芽孢桿菌激活將-70°C保存于甘油中蠟樣芽孢桿菌(ATCC 14579)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)5天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于58°C的水浴鍋中水浴他；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)4天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于75°C的水浴鍋中水浴50min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)4天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于97°C的水浴鍋中水浴^iin ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)6天后得到高芽孢率的蠟樣芽孢桿菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基的配方，同實施例1的固體培養(yǎng)基)；將該高芽孢率的蠟樣芽孢桿菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基的配方，同實施例1固體培養(yǎng)基)，30°CU50rpm培養(yǎng)4 后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察， 96%形成芽孢。實施例6 ①芽孢桿菌激活將-70°C保存于甘油中納豆芽孢桿菌(AS 1. 1086)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)5天；
②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于56°C的水浴鍋中水浴他；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)5天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于80°C的水浴鍋中水浴50min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C 靜止培養(yǎng)5天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于98°C的水浴鍋中水浴:3min ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，30°C靜止培養(yǎng)7天后得到高芽孢率的納豆芽孢桿菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基的配方，同實施例1固體培養(yǎng)基)；將該高芽孢率的納豆芽孢桿菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基的配方，同實施例1液體培養(yǎng)基)，30°CU50rpm培養(yǎng)4 后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察， 95%形成芽孢。實施例7 ①芽孢桿菌激活將-70°C保存于甘油中丁酸梭菌(ATCC 8260)無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37 °C靜止厭氧培養(yǎng)5天；②一級加熱處理將①中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于的水浴鍋中水浴證；③一級培養(yǎng)將②中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C 靜止厭氧培養(yǎng)5天；④二級加熱處理將③中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于75°C的水浴鍋中水浴50min ；⑤二級培養(yǎng)將④中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C 靜止厭氧培養(yǎng)5天；⑥三級加熱處理將⑤中固體培養(yǎng)基上的菌落用無菌生理鹽水洗下后裝在帶硅膠塞的無菌試管中，置于98°C的水浴鍋中水浴^iin ；⑦三級培養(yǎng)與收集將⑥中試管里的菌懸液無菌劃線接種于滅菌的固體培養(yǎng)基上，37°C靜止厭氧培養(yǎng)7天后得到高芽孢率的丁酸梭菌(所述滅菌的固體培養(yǎng)基的配方，同實施例1固體培養(yǎng)基)；將該高芽孢率的丁酸梭菌接種于滅菌的液體培養(yǎng)基上(所述滅菌的液體培養(yǎng)基的配方，同實施例1液體培養(yǎng)基)，37°C、靜止厭氧培養(yǎng)4 后，結(jié)晶紫染色油鏡觀察，98%形成芽孢。
權(quán)利要求
1.一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，其特征在于采用逐級加熱處理后培養(yǎng)的手段，選育出高產(chǎn)芽孢率的芽孢桿菌，其步驟包括芽孢桿菌激活、一級加熱處理、一級培養(yǎng)、 二級加熱處理、二級培養(yǎng)、三級加熱處理、三級培養(yǎng)與收集；所述一級加熱處理，其加熱條件為50 60°C的水浴加熱1 他；所述二級加熱處理，其加熱條件為70 80°C的水浴加熱10 60min ；所述三級加熱處理，其加熱條件為90 100°C的水浴加熱1 5min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，其特征在于所述一級培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為30 38°C靜止培養(yǎng)3 5天；所述二級培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為30 38°C靜止培養(yǎng)3 5天；所述三級培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為30 38°C靜止培養(yǎng)5 7天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，其特征在于所述芽孢桿菌激活的培養(yǎng)條件為30 38°C靜止培養(yǎng)3 5天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一權(quán)利要求所述的一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法， 其特征在于一級培養(yǎng)、二級培養(yǎng)和三級培養(yǎng)中所用的固體培養(yǎng)基為同一配方的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有以重量百分比計的下述組份牛肉膏0. 30%、氯化鈉0. 50%、蛋白胨1.00%、瓊月旨 2. 00%, pH 7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基的滅菌條件為121°C、0. llMpa，滅菌20 30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，其特征在于所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌或丁酸梭菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選育高產(chǎn)芽孢率芽孢桿菌的方法，該方法是根據(jù)芽孢的熱穩(wěn)定性特點，采用逐級加熱處理后培養(yǎng)的手段，選育出高產(chǎn)芽孢率的芽孢桿菌。其步驟包括芽孢桿菌激活、一級加熱處理、一級培養(yǎng)、二級加熱處理、二級培養(yǎng)、三級加熱處理、三級培養(yǎng)與收集。所述一級加熱處理，其加熱條件為50～60℃的水浴加熱1～6h；所述二級加熱處理，其加熱條件為70～80℃的水浴加熱10～60min；所述三級加熱處理，其加熱條件為90～100℃的水浴加熱1～5min。該芽孢桿菌能夠在發(fā)酵生產(chǎn)過程中快速形成芽孢，從而縮短發(fā)酵時間，降低生產(chǎn)成本，延長成品的保存時間，提高使用效果。而且工藝簡單、成本低廉，具有可操作性強的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/125GK102181389SQ201110066748
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者吳俊罡, 崔京春, 張獻, 郭海勇 申請人:大連民族學院