專利名稱：雞白痢沙門氏菌減毒突變株△S6702(MetE)及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將野生型雞白痢沙門氏菌毒力基因缺失的構(gòu)建方法，特別涉及以 ife坊基因作為靶基因，及一種用于基因缺失的引物設(shè)計(jì)、電轉(zhuǎn)化方法及通過表達(dá)FLP重組酶的輔組質(zhì)粒來消除抗性基因的方法，得到雞白痢沙門氏菌減毒突變株Δ S6702 (MetE)，保藏號 CGMCC NO:4374ο
背景技術(shù)：
雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起雛雞和火雞的一種敗血性傳染病。雞白痢沙門氏菌多侵害20日齡以內(nèi)幼雛，引起白色下痢，病死率極高，成年雞則可帶菌而無臨床癥狀。該病既可垂直傳播，又有嚴(yán)重的水平傳播，所以造成的危害和經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前在現(xiàn)代醫(yī)藥中使用疫苗預(yù)防傳染性疾病是最有效的措施，以疫苗接種預(yù)防雞白痢的研究一直未曾間斷過，但傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位苗免疫效果不佳，免疫途徑不便而逐漸被活疫苗所取代?，F(xiàn)代生物學(xué)和DNA重組技術(shù)以及對沙門氏菌毒力遺傳學(xué)的深入研究和了解，為該病原體基因組中引入多重、限定、減毒和不能回復(fù)的突變提供了可能性，這種突變是制備減毒活疫苗的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。近些年來，Red同源重組法作為一種新的基因打靶技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的基因敲除與基因替換，并應(yīng)用于其他細(xì)菌及病毒的基因敲除。已有學(xué)者采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入法鑒定出一些腸炎沙門氏菌與生物膜形成相關(guān)基因:ompR、spiA、steB(蛋白質(zhì)類基因)、rpoS、metE、rfaG、rfbH、rhlE(酶類基因)(董紅燕， 張小榮，潘志明等，轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入鑒定腸炎沙門氏菌生物膜形成相關(guān)基因，2008，微生物學(xué)報(bào))；焦新安等報(bào)道減毒雞沙門氏菌97A疫苗顯示出良好的安全性和免疫效果(焦新安， 潘志明，倪振亞等，減毒雞沙門氏菌安全性和免疫效力初步研究，1998，中國畜禽傳染病)， 為評價(jià)ompR、spiA、metE.rfaG基因在雞白痢沙門氏菌毒力中的作用，獲得預(yù)防雞白痢的減毒活疫苗候選株，我們分別構(gòu)建了這4個(gè)基因缺失的減毒株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供1株雞白痢沙門氏菌減毒突變株及其構(gòu)建方法。所說的雞白痢沙門氏菌減毒突變株Δ S6702 (MetE)，是雞白痢沙門氏菌 {Salmonella pullorum) CGMCC NO:4374。上述所說的雞白痢沙門氏菌減毒突變株，是用Red同源重組法將雞白痢沙門氏菌 MetE基因敲除，獲得預(yù)防雞白痢的減毒活疫苗候選株Δ S6702 (MetE)。具體的構(gòu)建方法是用一對帶有50核苷酸(nt)左右同源臂的氯霉素抗性基因 (CmK)經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入雞白痢沙門氏菌S6702 (CGMCC N0:4625)白痢沙門氏菌ife坊基因部分缺失并于其中插入CmK，獲得抗氯霉素的轉(zhuǎn)化子，再用表達(dá)FLP重組酶的輔組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入抗氯霉素轉(zhuǎn)化子，將抗性基因消除，獲得無抗性的突變株，命名為Δ S6702(MetE)。以1日齡SPF雞為模型，比較基因缺失突變株與野生株之間毒力的差異，致死率試驗(yàn)結(jié)果表明，Δ S6702 (MetE)突變株的毒力顯著降低，是潛在的雞白痢沙門氏菌減毒候選活疫苗。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)對野生型雞白痢沙門氏菌菌株的減毒。為研制雞白痢沙門氏菌減毒活疫苗及活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。
圖1.基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及其RFLP圖譜
M: IOObp DNA marker ；1: 分菌株S6702 基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果；2 分菌株 S&lQ2Hin6 I酶切結(jié)果。圖2. S6702生物膜狀態(tài)的掃描電鏡觀察。圖3是質(zhì)粒pkD3的圖譜。圖4 IMetE同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果 M :200 bp marker ； 1: Red 重組的片段。圖5是質(zhì)粒pKD46的圖譜。圖6是突變株的PCR鑒定
M 100 bp marker ；1野生株S6702的PCR擴(kuò)增片段；2有cat基因突變株的PCR擴(kuò)增片段；3無⑵ 基因突變株的PCR擴(kuò)增片段。本發(fā)明中所說的S6702，是指雞白痢沙門氏菌S6702，也稱野生株S6702，于2011年 3月1日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類命名為雞白痢沙門氏菌/^Bor腫)，保藏編號為CGMCC NO:4625。保藏單位地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明獲得的雞白痢沙門氏菌減毒突變株Δ S6702 (MetE)于2010年11月四日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類命名為雞白痢沙門氏菌 {Salmonella /w/Wor腫)，保藏編號為CGMCC N0:4374。保藏單位地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一 S6702基因突變株的構(gòu)建 1. S6702的鑒定
1. 1細(xì)菌分離
用接種環(huán)從疑似雞白痢病死雞的肝臟無菌取樣，三區(qū)劃線法分別接種麥康凱瓊脂平板、膽硫乳(DHL)瓊脂平板、S. S瓊脂平板，37°C溫箱培養(yǎng)Mh，觀察平板上的菌落形態(tài)。37°C 培養(yǎng)24h后，在麥康凱培養(yǎng)基、膽硫乳(DHL)瓊脂培養(yǎng)基和S. S培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)上均形成無色、半透明、邊緣整齊、光滑型圓形小菌落，直徑1. 5mm左右。 挑取可疑菌落進(jìn)一步純培養(yǎng)。1.2.細(xì)菌鑒定
1.2.1染色鏡檢革蘭氏法染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、測量細(xì)菌大小。 革蘭氏染色結(jié)果顯示鏡檢可觀察到散在排列的紅色短小直桿菌，大小約為1 μ mX 4 μ m。1. 2. 2生化試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)的單菌落接種三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基及細(xì)菌生化微量鑒定管，37°C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三糖鐵接種細(xì)菌培養(yǎng)后表現(xiàn)斜面紅色，底層變黃，不產(chǎn)氣。細(xì)菌可發(fā)酵葡萄糖、甘露糖，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、蔗糖、尿素酶、衛(wèi)矛醇，不產(chǎn)硫化氫。1.2.3 16S rDNA的序列分析按照常規(guī)方法提取細(xì)菌基因組DNA作為模板，用 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 中的Forward Primer 與 Reverse Primerl 擴(kuò)增約500bp的16S rDNA基因?？寺〉幕蚱嗡湍暇┙鹚固乜萍加邢薰緶y序。測得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索比對。PCR擴(kuò)增的16S rDNA條帶序列測定長度為526bp。Blast搜索結(jié)果表明，與其同源性超過99%的序列都屬于沙門氏菌屬，故將其歸類為沙門氏菌。該菌命名為S6702。測序的結(jié)果如SEQ ID NO :1所示。1.2.4血清學(xué)鑒定采用玻板凝集法，先用沙門氏菌A-F群0抗原多價(jià)血清檢測， 再用0抗原單因子血清和H抗原單因子血清分別鑒定。細(xì)菌與A-F群多價(jià)0抗原血清、Op 09、O12單因子血清凝集，與其余0抗原單因子血清和H抗原單因子血清均無凝集現(xiàn)象。1. 2. 5 PCR-RFLP法鑒別雞白痢與雞傷寒沙門氏菌按照參考文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行 [徐耀輝，焦新安，胡青海等.雞白痢和雞傷寒沙門氏菌的PCR-RFLP分子鑒別[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2005, 6 (1): 1-4.]，結(jié)果顯示以針對基因的引物擴(kuò)增S6702，可擴(kuò)增出600bp的目的片段，該條帶回收后經(jīng)歷I酶切消化，S6702的片段仍為600bp (見圖1)。由此確定該分離株為雞白痢沙門氏菌。1. 3.生物膜的測定
1. 3. 1結(jié)晶紫染色定量法按I^ratt等方法進(jìn)行[Pratt LA, Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm form ation: roles of flagella, m otility, chem otaxis and type I pili. Molecular microbiology, 1998, 30: 285-293·],將單個(gè)菌落接種于3 ml TSB中，于37°C 200 r/m搖振培養(yǎng)過夜；然后用1:10稀釋的TSB按 1 100稀釋上述培養(yǎng)菌液，轉(zhuǎn)移至96孔聚苯乙烯U型細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μ 1/孔培養(yǎng)M h ；傾去培養(yǎng)物，去離子水洗三遍，輕輕拍干；每孔加100 μ 1 0. 4%結(jié)晶紫染色20 min，再用去離子水洗三次，輕輕拍干；滴加100 μ 1乙醇，溶解后測定OD55tl值，重復(fù)三次取平均值。結(jié)果顯示陽性對照C533的OD55tl值為0. 523 士 0. 036，分離株S6702的OD55tl值為0. 5；34 士 0. 038， 與空白對照差異極顯著(OD55tl值0. 105士0.017)。因此該分離株可形成生物膜。
1.3. 2掃描電子顯微鏡觀察法 6孔板內(nèi)放置無菌蓋玻片，按上述方法接種細(xì)菌后靜置培養(yǎng)Mh，在蓋玻片上形成生物膜后，3%戊二醛(0. IM磷酸鹽緩沖液)固定池，依
次用50%、70%、80%、90%酒精各脫水1次，然后用100%酒精脫水2次，醋酸異戊酯脫水2次， 每次均為5 min, CO2冷凍干燥5 h。載體表面在真空條件下鍍金粉，于場發(fā)射電子顯微鏡 (FESEM) S4800 觀察結(jié)果。結(jié)果顯示S6702表現(xiàn)為細(xì)菌群聚性增加，在細(xì)菌周圍有高密度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)樣物質(zhì)，呈典型的生物膜狀態(tài)(圖2)。2. S6702基因突變株的構(gòu)建
2.1靶基因序列測定 2. 1. 1靶基因的擴(kuò)增
煮沸裂解法制備雞白痢沙門氏菌S6702基因組DNA模板，取適量過夜培養(yǎng)的菌液12000 rpm離心10 min，沉淀用滅菌超純水重懸，100°C水浴10 min，置于冰浴中冷卻；12000 rpm55°C退火45 s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min，12°C保存。
表1擴(kuò)增靶基因及鑒定突變株的引物序列
2. 1. 2 T-A克隆及鑒定
PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性條帶切膠后用Agarose Gel DNA Purification Kit 回收純化 DNA 片段，并連接到 pGEM-TEasyVector (從 PR0MEGA 公司購買)
咼心10 min，取上清作為PCR模板。根據(jù)GenBank上發(fā)表的沙門氏菌ife坊基因的序列設(shè)計(jì)引物(見表1)，擴(kuò)增上述基因。25 μ PCR擴(kuò)增體系如下4°C過夜連接、轉(zhuǎn)化、涂板，菌落的挑取、培養(yǎng)，以及質(zhì)粒的小量提取等，均按分子克隆所述步驟進(jìn)行；提取的質(zhì)粒用i^oR I酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。陽性質(zhì)粒送往南京金斯特科技有限公司進(jìn)行測序。2. 2打靶片段的制備
權(quán)利要求
1.雞白痢沙門氏菌減毒突變株ΔS6702 (MetE)，是雞白痢沙門氏菌(^Salmonella pullorum ) CGMCC NO 4374。
2.雞白痢沙門氏菌減毒突變株ΔS6702 (MetE)的構(gòu)建方法，其特征在于，是用Red同源重組法將雞白痢沙門氏菌ife坊基因敲除而獲得。
3.雞白痢沙門氏菌CGMCCN0:4374作為雞白痢沙門氏菌減毒候選活疫苗的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將野生型雞白痢沙門氏菌毒力基因缺失的菌株及其構(gòu)建方法。所說的雞白痢沙門氏菌減毒突變株△S6702(MetE)，是雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)CGMCC NO:4374。該菌株是用Red同源重組法將雞白痢沙門氏菌MetE基因敲除而獲得。雞白痢沙門氏菌CGMCC NO:4374可作為雞白痢沙門氏菌減毒候選活疫苗應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK102191210SQ20111006288
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者劉秀梵, 盧艷, 張小榮, 彭大新, 董洪燕, 陳素娟 申請人:揚(yáng)州大學(xué)