專利名稱：南海紅樹林內生真菌bl321的制作方法
技術領域：
本專利涉及一株產抗腫瘤活性化合物的南海紅樹林內生真菌，屬于生物技術領域。
背景技術：
紅樹林是熱帶和亞熱帶沿海地區特有的植物群落，紅樹林真菌是共生于其中的一個特殊群體，由于其獨特的生存環境，能夠產生出許多結構新穎的代謝產物，成為目前研究最多和最系統的海洋真菌，目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200種，隨著對其研究的深入，紅樹林內生真菌作為一種海洋微生物資源，許多結構新穎、生物活性良好的次級代謝產物不斷被報道，已成為海洋藥物開發的一種重要資源[林永成，周世寧，《海洋微生物及其代謝產物》，北京化工出版社，2003。劉愛榮，吳曉鵬，徐同，紅樹林內生真菌研究 進展，廢原生態學報，2007,18(4) :912-918。]
對于紅樹林真菌辦sp.，我們先后從辦hria sp. 2508菌株中發現了具有鈣離子通道抑制作用的Xyloketal A、B、F，其中Xyloketal F的最大最強抑制濃度達至Ij 0.03 μ M，[X. -Y. ffu, X. -H. Liu, Y. -C, Lin, J. -H. Luo, Ζ. -G. She, H. -J. Li, L. -ff. Chan, S. Antus, T. Kurtan, B. Elsasser, K. ￥,ro\m,Eur. J. Org. Chem. 2005, 4061-4064.]和具有對 DNA 親和性的 xylopyridine A[Xu Fang. Pang Jiyang, et al. Chinese Journal of Chemistry, 2009，27, 365-368]等活性天然化合物。Xylaria sp. BL321是一株產抗腫瘤天然產物的內生真菌，對其深入研究，有助對該方面先導化合物的認識與開發。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可產生抗腫瘤化合物的南海紅樹林內生真菌BL321。本發明的另一目的在于保護南海紅樹林內生真菌BL321在制備抗腫瘤藥物方面的應用。發明通過以下技術方案實現上述目的
本發明提供了南海紅樹林內生菌BL321，采自廣東陽江紅樹林海岸帶白欖樹葉，經鑒定為鹿角菌屬a>7ariasp.)，于2010年12月20日寄存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)， 菌種保藏號為CCTCC M 2010357，該菌株的16S rDNA的Genbank登錄號為HM569607 ；該菌生物學特性為菌落表面為乳白色細絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴散型生長，無孢子生成，為好氧型真菌；其所產部分新型化合物具有明顯的抗腫瘤活性。該內生真菌BL321的基因序列如SEQ ID NO 1所示
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(1)南海紅樹林內生真菌BL321產獨特結構的化合物，經測試，部分化合物具有高效的腫瘤細胞抑制作用。(2)本發明生產成本低，節能環保，是開發新型天然藥物的理想載體。 (3)本發明生產周期短，分離制備較容易，易于擴大生產。
具體實施例實施例1.
菌種的分離與保藏。將采來的白欖樹葉表面徹底消毒后，在超凈臺內將其剪碎，放入預先準備好的無菌水中浸泡十分鐘，用浸提液涂布于PDA平板上，28°C靜置培養5-7天，等菌長出后，挑取單個菌落二次涂布平板，直到所長菌落為單一菌落為止。于PDA斜面內4°C保藏。BL321的菌落形態為無包子生成的乳白色細絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴散型生長。實施例2. 菌種BL321的鑒定。將BL321從PDA斜面培養基轉入PDA平皿培養基培養，培養5_7天，形成白色匍匐菌絲，刮去菌絲體，用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA用ITS4RATSiF 50 μ L反應體系，擴增 ITS-rRNA。反應條件為 94°C 3min，35 次循環-MV 30s, 50°C 30s, 72°C lmin, 72°C8min。DNA鑒定用DNA雙向測序，測序結果經基因文庫檢索比對為Max index為91%， 確定為鹿角菌。實施例3.
活性成分的提取與分離。B321從斜面活化后，將帶有菌絲體的瓊脂快接種于含250mL GYT培養基的500mL 三角瓶中，在28°C下，搖床rpm 120，培養5_7天，在對數生長期轉接擴大培養，每個含500mL GYT培養基的IL三角瓶接種lmL，在28°C下，搖床rpm 120，培養5_7天(或靜置30天)，收取菌體。菌體經干燥粉碎后，用3倍體積乙酸乙酯(EA)萃取5次，萃取液濃縮后用EA/石油醚(PE)以10%的梯度進行柱色譜層析，得到極性EA/PE在40%左右的組分，組分經濃縮、 重結晶后得含量在80%左右的已知艾里莫芬烷類的倍半萜化合物S6-2 (07H239-A)，其每升發酵液的產量達到20mg左右，對其進行進一步色譜柱層析和HPLC，在極性為甲醇水 乙酸=75:25:0. 1、流速為1. 5mL/min、254nm波長檢測的條件下，又得到同系列的4個微量新化合物。初步檢測部分化合物具有明顯的抗腫瘤活性和α-葡萄糖甘酶的激活活性。 07Η239-Α曾有報道其對24株腫瘤細胞的平均IC5tl為3. 2 μ g/mL [L. A. McDonald, L. R. Barbieri, V. S. Bernan, J. Janso, P. Lassota, G. T. Garter, J. Nat. Prod. 2004, 67, 1565.]。
權利要求
1.南海紅樹林內生菌BL321，為分自廣東陽江紅樹林海岸帶白欖樹葉的內生真菌， 經鑒定為鹿角菌屬(Jylariasv.)，于2010年12月20日寄存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號為CCTCC M 2010357，該菌株的16S rDNA的Genbank登錄號為 HM569607 ；該菌生物學特性為菌落表面為乳白色細絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴散型生長，無孢子生成，為好氧型真菌。
2.如權利要求1所述的南海紅樹林內生菌BL321在制備抗腫瘤藥物方面的應用。
3.如權利要求1所述的南海紅樹林內生菌BL321，其特征在于其基因序列如SEQID NO 1所示。
全文摘要
本發明公開了一種南海紅樹林內生真菌，屬于生物高技術領域。所用菌株為BL321，經鑒定為鹿角菌屬(Xylariasp.)，菌種保藏號為CCTCCM2010357，該菌株的16SrDNA的Genbank登錄號為HM569607。主要生物學特性為該菌菌落表面為乳白色細絲羽絨狀，背面為麥黃色，匍匐擴散型生長，無孢子生成，為好氧型真菌，其所產部分新型化合物具有明顯的抗腫瘤活性。本發明生產方便，成本低，節能環保，是開發新型天然藥物的一種理想載體。
文檔編號C12N1/14GK102181370SQ20111006238
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月16日 優先權日2011年3月16日
發明者劉嵐, 宋永相, 林永成, 王軍 申請人:中山大學