專利名稱：腺伴隨病毒(aav)進化支、序列、含有這些序列的載體及它們的應用的制作方法
腺伴隨病毒(AAV)進化支、序列、含有這些序列的載體及它
們的應用本發明專利申請是國際申請號為PCT/US2004/(^8817，國際申請日為2004年9月 30日，進入中國國家階段的申請號為“200480027905. 2”，發明名稱為“腺伴隨病毒(AAV)進化支、序列、含有這些序列的載體及它們的應用”的發明專利申請的分案申請。關于聯邦政府資助的研究或開發的聲明本申請包括由國家衛生研究院(NIH)的NIDDK P30DK47757和NHLBI P01HL59407 撥款資助的工作。美國政府享有本發明的一定權力。
背景技術：
腺伴隨病毒(AAV)是細小病毒科家族的成員，它是小的無包膜、二十面體病毒，具有4. 7千堿基(1Λ)到61Λ的單鏈線形DNA基因組。由于該病毒是作為純化的腺病毒原種的污染物被發現，AAV指定為依賴病毒屬(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潛伏期(AAV 基因組在感染后位點特異性地整合進宿主染色體)，感染期(腺病毒或單純皰疹病毒感染后，整合的基因組接著得到拯救、復制并包裝進感染性病毒)。非致病性的特性、感染性的寬宿主范圍(包括非分裂細胞)與潛在的位點特異性染色體整合使得AAV成為用于基因轉移的有吸引力的工具。近來的研究表明AAV載體是用于基因遞送的優選運載體。迄今為止，已從人或非人靈長類(NHP)分離了幾種表征良好的不同AAV。已發現不同血清型的AAV表現出不同的轉染效率，也表現出對不同細胞或組織的向性。然而，以前還未對這些不同血清型之間的關系進行研究。基于AAV的構建物用于遞送異源分子是理想的。發明概述本發明提供AAV的系統發生相關序列的“超家族”或“進化支”。這些AAV進化支提供用于將分子靶向和/或遞送至所需靶細胞或組織的AAV序列源。本發明一方面提供具有至少三個AAV成員的AAV進化支，這些成員是基于AAV VPl氨基酸序列對比，使用自引值為至少75% (基于至少1000次復制)的鄰接啟發式算法(Neighbor-Joining heuristic)與不大于0. 05的泊松校正距離測量值(Poisson correction distance measurement)確定為系統發生相關的。合適的AAV進化支由用于產生載體的AAV序列組成。本發明還提供以前未知的人AAV血清型，這些血清型在本文中稱為克隆觀.4/ hu. 14或AAV血清型9。因此，本發明另一方面提供一種由AAV衣殼組成的血清型9的AAV， 該衣殼在血清學上與SEQ ID NO :123的氨基酸1-736的序列的衣殼相關，在血清學上與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7 或 AAV8 中的任一衣殼蛋白不同。用該huAAV9的衣殼構建的載體表現出的基因轉移效率類似于肝臟中的AAV8、優于肌肉中的AAV并且比肺中的AAV5高200倍。此外，該新的人AAV血清型與以前所述的 AAVl到AAV8的序列同一性小于85%，并且不被任何這些AAV交叉中和。本發明也提供其它新的AAV序列、含有這些序列的組合物及它們的應用。有利的是，這些組合物特別適用于出于治療或預防目的需要反復施用的AAV載體。本發明的這些和其它方面可通過以下發明詳述得到明白。附圖簡述
圖1是使用帶泊松校正距離測量值的鄰接啟發式算法構建的系統發生關系樹。基于分離的AAV vpl衣殼蛋白與分組于進化支中分離的AAV確定關系。單個衣殼克隆的組基于它們共同的祖先分類在進化支中。進化支以A到F命名；亞型以進化支字母加上一個數值表示。圖2A-2AE對比了本發明的AAV vpl衣殼蛋白的氨基酸序列(公布了各個序列的編號)與以前公布的 AAVl [SEQ ID NO :219]、AAV2 [SEQ ID NO :221]、AAV3-3 [SEQ ID NO: 217]、AAV4-4[SEQ ID NO :218]、AAV5 [SEQ ID NO :216]、AAV6 [SEQ ID NO :220]、AAV7 [SEQ ID NO :222]、AAV8[SEQ ID NO :223]與 rh. 25/42_15、29. 3/bb. 1、cy. 2、29. 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前稱為 41. 10)、 rh. 25(以前稱為 41. 15)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、 rh. 37、rh. 36、rh. 23、rh. 8 和 ch5 [公開的美國專利申請號 2003/0138772A1 (2003 年 7 月 24 日)]。本發明的序列包括 hu. 14/AAV9[SEQ ID NO 123]、hu. 17[SEQ ID NO :83]、 hu. 6[SEQ ID NO :84]、hu. 42 [SEQ ID NO :85]、hu. 38 [SEQ ID NO :86]、hu. 40 [SEQ ID NO:
87]、hu.37 [SEQ IDNO :88]、rh. 40 [SEQ ID NO :92]、rh. 52 [SEQ ID NO :96]、rh. 53 [SEQ ID NO :97]、rh. 49 [SEQ ID NO :103]、rh. 51 [SEQ ID NO :104]、rh. 57 [SEQ ID NO :105]、 rh. 58[SEQID NO :106]、rh. 61 [SEQ ID NO : 107]、rh. 50 [SEQ ID NO : 108]、rh. 43 [SEQ ID NO :163]、rh.62[SEQ ID NO :114]、rh.48[SEQ ID NO :115]、4_9/rh. 54[SEQ ID NO :116]和 4-19/rh. 55[SEQ ID NO :117]、hu. 31[SEQ ID NO : 121]、hu. 32[SEQ ID NO : 122]、hu. 34[SEQ ID NO :125]、hu. 45 [SEQ ID NO : 127]、hu. 47 [SEQ ID NO : 128]、hu. 13 [SEQID NO :129], hu. 28 [SEQ ID NO :130]、hu. 29 [SEQ ID NO : 132]、hu. 19 [SEQ IDNO : 133]、hu. 20 [SEQ ID NO :134]、hu. 21 [SEQ ID NO : 135]、hu. 23. 2 [SEQ ID NO : 137]、hu. 22 [SEQ ID NO :138]、 hu. 27 [SEQ ID NO : 140]、hu. 4 [SEQ ID NO :141]、hu. 2 [SEQ IDNO : 143]、hu. 1 [SEQ ID NO: 144], hu. 3 [SEQ ID NO : 145]、hu. 25 [SEQ ID NO : 146]、hu. 15 [SEQ ID N0:147]、hu. 16 [SEQ ID NO :148]、hu. 18 [SEQ ID NO : 149]、hu. 7 [SEQID NO : 150]、hu. 11 [SEQ ID NO: 153]、 hu. 9 [SEQ ID N0:155]、hu. 10 [SEQ ID NO :156]、hu. 48 [SEQ ID NO :157]、hu. 44 [SEQ ID NO: 158],hu. 46[SEQ ID NO : 159]、hu.43[SEQID NO :160]、hu.35[SEQ ID NO :164]、hu.24[SEQ ID NO :136]、rh. 64 [SEQ ID NO :99]、hu. 41 [SEQ ID NO :91]、hu. 39 [SEQ ID NO: 102]、 hu. 67[SEQ ID NO : 198]、hu.66[SEQID NO :197]、hu. 51[SEQ ID NO :190]、hu. 52[SEQ ID NO: 191],hu.49[SEQ IDNO :189]、hu.59[SEQ ID NO :192]、hu.57[SEQ ID NO : 193]、hu.58[SEQ ID NO :194]、hu. 63 [SEQ ID NO :195]、hu. 64 [SEQ ID NO :196]、hu. 60 [SEQ ID NO :184]、 hu.61[SEQID NO :185]、hu. 53[SEQ ID NO :186]、hu. 55[SEQ ID NO :187]、hu. 54[SEQ ID NO:
88],hu. 6 [SEQ ID NO :84]與rh. 56 [SEQ ID NO :152]。這些衣殼序列也見引為參考的序列表中。圖3A-3CN對比了本發明的AAV vpl衣殼蛋白的核酸序列(公布了各個序列的編號)與以前公布的 AAV5(SEQ ID NO 199)、AAV3-3 (SEQ ID NO :200)、AAV4-4 (SEQ ID NO: 201)、AAVl (SEQ ID NO :202)、AAV6 (SEQ ID NO :203)、AAV2 (SEQ ID NO :211)、AAV7 (SEQID NO 213)與 AAV8(SEQ ID NO :214)、rh. 25/42_15、29· 3/bb. 1、cy. 2、29· 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前稱為 41. 10)、 rh. 25(以前稱為 41. 15 ；GenBank 登錄號 AY530557)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、 cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、rh. 36、rh. 37、rh. 23、rh. 8 與 ch. 5[公開的美國專利申請號 2003/0138772A1 (2003 年 7 月 24 日)]。本發明的核酸序列包括 hu. 14/AAV9 (SEQ ID NO 3)、LG-4/rh. 38 (SEQ IDNO 7)、LG-10/rh. 40 (SEQID NO 14)、N721-8/rh. 43 (SEQ ID NO 43) U-8/rh. 49 (SEQ IDNO :25)、2_4/rh. 50 (SEQ ID NO :23)、2_5/rh. 51 (SEQ ID NO :22)、 3-9/rh. 52(SEQ IDNO :18)、3_ll/rh.53(SEQ ID NO : 17)、5_3/rh.57(SEQ ID NO :26)、 5-22/rh. 58(SEQ IDNO :27)、2_3/rh. 61(SEQ ID NO :21)、4_8/rh.64(SEQ ID NO :15)、 3. 1/hu. 6(SEQ IDNO :5)、33. 12/hu. 17(SEQ ID NO :4)、106. 1/hu. 37 (SEQ ID NO :10)、 LG-9/hu. 39(SEQ IDNO :24)、114. 3/hu. 40(SEQ ID NO :11),127.2/hu. 41(SEQ ID NO :6)、 127.5/hu.42(SEQID NO :8)與 hu. 66(SEQ ID NO :173)、2_15/rh. 62(SEQ ID NO :33)、 1-7/rh. 48(SEQ IDNO :32)、4_9/rh. 54(SEQ ID NO :40)、4_19/rh. 55(SEQ ID N0:37)、52/ hu. 19 (SEQ IDNO 62) ,52. 1/hu. 20 (SEQ ID NO :63)、54. 5/hu. 23 (SEQ ID N0:60)、54.2/ hu. 22 (SEQ IDNO :67)、54. 7/hu. 24 (SEQ ID NO :66),54. 1/hu. 21 (SEQ ID NO :65)、54. 4R/ hu. 27(SEQ IDNO :64)、46.2/hu. 28(SEQ ID NO :68)、46.6/hu. 29(SEQ ID NO :69)、128.1/ hu. 43(SEQ IDNO :80)、128.3/hu.44 (SEQ ID NO :81)與130.4/hu. 48(SEQ ID NO :78)、3.1/ hu.9 (SEQ IDNO :58)、16.8/hu. 10(SEQ ID NO :56)、16. 12/hu. 11(SEQ ID NO :57)、145. 1/ hu.53 (SEQID NO :176),145.6/hu.55 (SEQ ID NO :178),145. 5/hu. 54(SEQ ID NO :177)、 7. 3/hu. 7 (SEQ ID NO :55)、52/hu. 19 (SEQ ID NO :62)、33. 4/hu. 15 (SEQ ID N0:50)、33.8/ hu.16 (SEQ ID NO 51),58. 2/hu. 25(SEQ ID NO :49)、161. 10/hu. 60(SEQ IDNO : 170)、H_5/ hu. 3 (SEQ ID NO :44)、H-1/hu. 1(SEQ ID NO :46)、161. 6/hu. 61(SEQ IDNO : 174)、hu.31 (SEQ ID NO 1),hu. 32 (SEQ ID NO 2),hu.46(SEQ ID NO :82)、hu.34 (SEQ ID NO :72)、hu.47 (SEQ ID NO :77)、hu. 63 (SEQ ID NO :204)、hu. 56 (SEQ IDNO :205)、hu. 45 (SEQ ID NO :76)、 hu. 57 (SEQ ID NO :206)、hu. 35 (SEQ ID NO :73)、hu. 58 (SEQ ID NO :207)、hu. 51 (SEQ ID NO: 208),hu. 49(SEQ ID NO :209)、hu. 52(SEQID NO :210)、hu. 13(SEQ ID NO :71)、hu. 64 (SEQ ID NO :212)、rh. 56 (SEQ ID NO :54)、hu. 2 (SEQ ID NO :48)、hu. 18 (SEQ ID NO :52)、hu. 4 (SEQ ID NO 47)與hu. 67 (SEQ IDNO :215)。這些衣殼序列也見引為參考的序列表中。圖4A-4D提供了對基于AAV的新靈長類載體在體外和體內基因轉移效率的評價。 AAV 載體是如[Gao 等，Proc Natl Acad Sci 美國，“11邪4_11859 O002 年，9 月 3 日)]所述具有 AAV1、2、5、7、8 和 6 與 ch. 5、rh. 34,cy. 5、rh. 20,rh. 8 和 AAV9 衣殼的假型。如圖 4A 所示，為進行體外研究，接種于95-孔板的84-32細胞(表達腺病毒血清型E4的293細胞) 以每細胞1 X IO4GC的感染復數(MoI)用假型AAVCMVEGFP載體感染。感染后48小時使用紫外顯微鏡將相對EGFP轉導效率估計為綠色細胞的百分比并顯示在Y軸上。為進行體內研究，分別經門內(intraportal)(圖4B)、氣管內(圖4C)和肌肉內(圖4D)以每只動物 1 X IO11GC的劑量給予NCR裸鼠周齡)的肝(圖4B)、肺(圖4C)和肌肉(圖4D)以表達分泌的報道基因AlAT的載體。在基因轉移后第觀天比較血清AlAT水平(ng/ml)并示于Y軸上。X軸表示所分析的AAV與它們所屬的進化支。發明詳述
在任何用于治療或預防的載體庫中，為所需應用選擇載體源，需要能將大分子攜帶至靶細胞的各種不同載體。迄今為止，關于將AAV用作載體的一個問題是缺乏各種不同的病毒來源。本發明通過提供AAV的進化支來克服該問題，所述進化支用于選擇系統發生相關的(或選擇治療方案所需的)，或系統發生不同的AAV并用于預測功能。本發明還提供新的AAV病毒。當術語“基本同源性”或“基本相似性”指核酸或其片段時意味著當合適的核苷酸插入物或缺失物與另一核酸(或其互補鏈)最佳對比時，對比序列中至少約95%到99%的核苷酸序列同一性。優選在全長序列、或其開放讀框、或另一至少長15個核苷酸的合適片段上具有同源性。合適片段的例子描述于本文。文中用于核酸序列的術語“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”指當對比最大一致性時，兩條序列中的殘基相同。序列同一性比較的長度可是基因組全長、基因編碼序列的的全長，或需要至少約500到5000個核苷酸的片段。然而，較小片段中的同一性也是需要的，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20到M個核苷酸、至少約28到32 個核苷酸、至少約36或更多個核苷酸的片段。類似地，氨基酸序列、蛋白全長、或其片段的 “序列同一性百分比”可容易地確定。合適片段的長度至少約8個氨基酸，也可達約700個氨基酸。合適片段的例子描述于文中。當術語“基本同源性”或“基本相似性”指氨基酸或其片段時意味著當合適的氨基酸插入物或缺失物與另一氨基酸(或其互補鏈)最佳對比時，對比序列中至少約95%到 99%的氨基酸序列同一性。優選在全長序列，或其蛋白質(例如，cap蛋白、r印蛋白)，或其至少8個氨基酸，或更希望至少15個氨基酸長度的片段上具有同源性。合適片段的例子描述于本文。術語“高度保守的”表示至少80%的同一性、優選至少90%的同一性、更優選超過 97%的同一性。本領域的技術人員可憑借本領域技術人員已知的算法和計算機程序容易地
確定同一性。—般當提及在兩種不同的腺伴隨病毒之間的“同一性”、“同源性”或“相似性”時， “同一性”、“同源性”或“相似性”是參考“對比”的序列確定的。“對比”的序列或“對比”指多核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，與參考序列相比，該序列通常含有缺失的或附加的堿基或氨基酸的校正。在實施例中，使用公開的AAV2或AAVl序列作為參考點進行AAV對比。然而，本領域的技術人員可容易地選擇另一 AAV序列作為參考。可使用任何各種公用或市售可得的多序列對比程序進行對比。這種程序的例子包括通過因特網的萬維服務器可得的“Clustal W”、“CAP序列組件”、“MAP”和“MEME”。這種程序的其它來源是本領域技術人員已知的。或者也可使用VectorNTI實用程序。許多本領域已知的算法，包括包含在上述程序中的算法也可用于測量核苷酸序列同一性。使用GCG6. 1 版中的程序hsta 來比較多核苷酸序列是另一個例子。hsta 提供在查詢和檢索序列之間最佳重疊區域的對比和序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用GCG6. 1版提供的具有默認參數的i^staTM(字長為6和用于計分矩陣的NOPAM系數) 來確定，該程序納入本文引作參考。多序列對比程序也可應用于氨基酸序列，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME” 和"Match-Box” 程序。雖然本領域的技術人員可視需要改變這些設置，但通常這些程序以默認設置使用。或者，本領域的技術人員可利用另一種算法或計算機程序，該算法或程序提供的同一性或算法的水平至少同參考的算法和程序提供的一樣。參見，例如J. D. Thomson等，Nucl. Acids. Res.，“多序列對比的綜合比較，，(A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignments)，27 (13) 2682-2690(1999)。術語“血清型”區分具有在血清學上不同于其它AAV血清型的一種衣殼的AAV。血清學特殊性是基于與其它AAV相比，針對AAV的抗體之間缺乏交叉反應性來確定。交叉反應性通常在中和抗體試驗中測定。就該試驗而言，使用腺伴隨病毒在家兔或其它合適的動物模型中產生抗特異性AAV的多克隆血清。然后在該試驗中測試所產生的抗特異性AAV的血清中和相同(同源)或異源AAV的能力。達到50%中和作用的稀釋度看作中和抗體滴度。如果就兩種AAV而言，倒數形式的異源滴度除以同源滴度的商小于16，則此兩種AAV可視為是相同的血清型。相反，如果倒數形式的異源滴度與同源滴度之比是16 或更大，此兩種AAV視為是不同血清型。如本文所定義，為形成血清型9，所產生針對所選AAV衣殼的抗體必須與AAVl、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中任一種不交叉反應。在一個實施方案中，本發明提供一種在本文中鑒定為人AAV血清型9的新血清型的AAV衣殼。本說明書與權利要求書使用的術語“含有”和“包括”是包括其它成分、元素、整數、 步驟等在內。相反，術語“由...組成”和其變體不包括其它成分、元素、整數、步驟等在內。1.進化支在一方面，本發明提供了 AAV的進化支。進化支是基于AAV vpl氨基酸序列對比， 使用自引值為至少75% (至少1000次復制)的鄰接啟發式算法與不大于0.05的泊松校正距離測量值確定為互相系統發生相關的一組AAV。鄰接算法詳細描述于參考文獻。參見，例如M. Nei與S. Kumar,《分子進化與系統發生學》(Molecular Evolution and Phylogenetics)(牛津大學出版社，紐約 Q000)。計算機程序可用于執行該算法。例如，MEGA v2.1程序執行改進的Nei-Gojobori方法。使用這些技術與計算機程序，AAV vpl衣殼蛋白的序列，本領域的技術人員可容易地確定所選擇的AAV是否包含在文中所鑒定的一種進化支內、另一種進化支內、或在這些進化支之外。雖然本文所定義的進化支主要基于天然的AAV vpl衣殼，這些進化支不限于天然的AAV。這些進化支可包括非天然AAV，包括(但不限于)重組、修飾、嵌合、雜交、合成、人工的等，基于AAV vpl氨基酸序列對比，使用自引值為至少75% (至少1000次復制)的鄰接啟發式算法與不大于0. 05的泊松校正距離測量值確定為系統發生相關的AAV。本文所述的進化支包括進化支A(以AAVl和AAV6表示)、進化支B(以AAV2表示)、進化支C (以AAV2-AAV3雜交體表示)、進化支D (以AAV7表示)、進化支E (以AAV8表示)與進化支F(以人AAV9表示)。這些進化支以前文所述AAV血清型的進化支的成員代表。前文所述的AAVl和AAV6是單一進化支(進化支A)的成員，該進化支中4種分離物回收自3種人。前文所述AAV3和AAV5血清型明顯相互不同，但在本文所述的篩選中未檢測到，并且未包括于任何這些進化支中。進化支B(AAV2)和進化支C(AAV2-AAV3雜交體)是在人中發現的AAV最豐富的 (AAV2有22種分離物來自12種個體，進化支C有17個分離物來自8種個體)。大量的序列分組于進化支D (AAV7)或進化支E (AAV8)。有趣的是，這些進化支普遍存在于不同物種中。進化支D對恒河猴與南美彌猴是獨特的，具有分離自10種不同動物的 15個成員。由于進化支E在人和非人靈長類中發現，它是令人感興趣的9種分離物回收自 7種人而21種分離物得自9種不同的非人靈長類，包括恒河猴、狒狒和豚尾彌猴(pigtail monkey)。在其它兩種動物中證實了某些序列的雜交特性，雖然在該情況中所有的序列似乎具有起源于兩種協同感染病毒(在兩種動物中是進化支D與進化支E病毒)的獨立而不同的重組。這些重組體無一在其它動物或受試對象中鑒定到。因為進化支C(AAV2_AAV3雜交體)在6種不同的人對象中鑒定到，重組甚至導致了合適的后代。另一方面，就AAV7-AAV8雜交體而言，僅有少數重組情況涉及AAV進化。這些重組情況說明AAV能重組，從而產生框內基因以及在一些情況中產生可包裝和/或感染性衣殼結構。另一方面，進化支C(AAV2-AAV3雜交體進化支)是一組通過重組獲得選擇性優點的病毒，這種重組使它們忍受環境壓力。A.進化支A (以AAVl禾Π AAV6表示)在另一方面，本發明提供進化支Α，其特征在于含有前文公開的AAVl和AAV6。 參見，例如2000年5月18日的國際
發明者G·高, J·M·威爾森, L·H·范登伯格, M·R·阿爾維拉 申請人:賓夕法尼亞州立大學托管會