專利名稱：豬氣管上皮細胞系及其建立方法
技術領域：
本發明涉及生物動物細胞系領域，具體涉及豬氣管上皮細胞系及其建立方法。
背景技術：
氣管上皮位于氣管管腔內表面，屬假復層纖毛柱狀上皮，是機體對外防御有害物質侵擾的第一道屏障。其組成細胞——氣管上皮細胞除具有機械防御作用之外，還可以合成和分泌多種粘液成分和細胞因子，用于調節氣道上皮細胞生長、維持氣管上皮完整性、濕潤和凈化呼吸道、抵抗多種病原菌對氣管上皮的侵害，另外，氣管上皮細胞還具有參與氣道黏膜免疫反應、幫助消除氣管炎癥等重要作用。目前，尚無有關豬氣管上皮細胞細胞系建立方法的研究出現，且以現有細胞系建立方法獲取的永生化的豬血管內皮細胞，由于在篩選過程中獲得單克隆陽性細胞較少，細胞生長的量也很少，且增殖緩慢，營養條件要求較高，生產成本高，不利于推廣。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種易于培養，生長速度較快，操作方法簡便的豬氣管上皮細胞系及其建立方法。本發明采用如下技術方案一種豬氣管上皮細胞系的建立方法，包括以下步驟(1)原代培養無菌獲取初生仔豬氣管，清除粘附組織，采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法消化分離獲得高純度的氣管上皮細胞；將分離得到的原代氣管上皮細胞懸浮于DF12 培養基中，置于37°C，5% CO2條件下培養；(2)轉染和篩選提取純化含有hTERT基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT，采用脂質體轉染法，將編碼hTERT和neo基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT導入步驟(1)原代培養的豬氣管上皮細胞進行轉染；(3)篩選和擴大培養。所述的方法，所述步驟( 將pCI-neo-hTERT質粒轉染原代培養的豬氣管上皮細胞，其具體步驟如下(1)轉染前Mh，將STECs用蔗糖EDTA和0.25%胰酶分步消化成單個細胞，以 IXio5個細胞/孔接種到12孔板內，使細胞在轉染當天能達到80% 90%的融合；(2)轉染前4h更換無血清的DMEM/F12 ；(3)用無血清的DMEM/F12稀釋5 μ LpCI-neo-hTERT質粒至體積為50 μ L，輕輕混勻，質粒濃度達到300ng/ μ L 400ng/ μ L室溫作用5min ；(4)用無血清的 DMEM/F12 分別稀釋 Lipofectamine 20006 μ L、9 μ L、12 μ L 到 50 μ L，輕輕混勻，室溫作用5min ；(5)混合稀釋的質粒和稀釋的Lipofectamine 2000，此時總體積為100 μ L。輕輕混勻，室溫作用20min ；
(6)將12孔板中的舊培養液吸出，用D-Hank’ s清洗，加入900 μ L無血清的DMEM/ F12 ；(7)逐滴加入脂質體/DNA混合物到不同孔中，邊加邊前后來回搖動培養板，輕輕混勻；同時設立2孔未轉染作為空白對照；(8)在37°C、體積分數比為5% CO2飽和濕度培養箱中孵育4 6h，棄去培養液， 加入完全的DMEM/F12培養基；(9)24h 48h觀察細胞，并及時換液。所述的方法，所述步驟(3)的具體操作為(1)轉染48h后待細胞匯合至80%時，將細胞傳代消化到另一個12孔板中，然后加入800 μ g/mL G418進行篩選，第7天時，可用胰酶于原皿消化細胞，棄去消化液并補加篩選液，連續培養兩周，每兩天換相同濃度G418篩選液1次，每天觀察細胞生長及死亡情況；(2)待對照孔的細胞全部死亡后，將G418的濃度減半，降至400 μ g/mL ；(3)繼續篩選細胞一個月左右，每兩天換1次液，直到陽性克隆可見為止；(4)將陽性克隆用濾紙片法消化并轉移至新12孔板，擴大培養。本發明還提供了按照上述方法建立的豬氣管上皮細胞系。本發明采用脂質體轉染法將人端粒酶逆轉錄酶基因轉入正常的豬氣管上皮細胞， 激活其端粒酶活性，以自身RNA為模板不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒，獲得無限分裂和增殖的能力，建立了豬氣管上皮細胞的永生化細胞系。
圖1原代培養傳至第3代的細胞(X 100)電鏡圖。圖2轉染后第50代細胞(X100)電鏡圖。圖3轉染后第50代細胞(X 200)電鏡圖。圖4轉染前第3代和轉染后第15代、35代永生化的STECs hTERTmRNA RT-PCR檢測結果圖。圖5轉染后永生化的STECs氣管上皮細胞8型角蛋白免疫熒光檢測(X400)電鏡圖。圖6原代STECs和永生化的STECs生長曲線比較。圖7原代第3代STECs細胞生長周期分布圖。圖8永生化的STECs第35代細胞生長周期分布圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例11、無菌獲取初生仔豬氣管，清除粘附組織，采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法消化分離獲得高純度的氣管上皮細胞，形態呈圓球狀，多單個存在，顯微鏡下可見纖毛擺動。2、將分離得到的原代氣管上皮細胞懸浮于DF12培養基中，置于37°C，5% CO2條件下培養。6 他，細胞貼壁；24h左右，細胞呈單層貼壁生長；2 4d細胞鋪滿平皿底部。經 8型角蛋白間接免疫熒光鑒定，細胞核無特異性熒光，細胞膜有熒光，結合細胞形態觀察，證實所分離培養的細胞為豬氣管上皮細胞。3、提取純化含有hTERT基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT，采用脂質體轉染法， 利用Lipofectamine 2000 Regent轉染試劑盒將編碼hTERT和neo基因的真核表達質粒 pCI-neo-hTERT導入原代培養的豬氣管上皮細胞進行轉染。4、轉染4 后通過G418進行篩選，第2天細胞開始死亡，第14天，未轉染組細胞在G418作用下全部死亡，轉染組仍有較多細胞，且已有G418抗性細胞開始生長，G418濃度降至一半維持篩選，繼續篩選一個月左右，待發現抗G418陽性細胞克隆后，于37°C、5%的 CO2培養箱內擴大培養，利用有限稀釋法對陽性細胞進行單克隆純化，獲得單克隆的氣管上皮細胞，并將其傳代培養。5、RT-PCR技術在轉染hTERT的細胞中均檢測到hTERT mRNA在轉染細胞中表達， 用抗hTERT單克隆抗體進行Western Blot檢測，發現有特異性條帶產生，而原代培養的細胞沒有檢測到。表明外源性hTERT基因可以在轉染豬氣管上皮細胞中表達，并激活豬氣管上皮細胞的端粒酶活性。6、將陽性單克隆氣管上皮細胞在體外于37°C、5%的(X)2培養箱內連續培養，單層細胞呈鋪路石樣，細胞間界限分明，存在接觸抑制，具有正常細胞的增殖周期，培養超過80 代次，即得永生化的細胞系。本發明所述DMEM/F12培養基購自invitrogen公司，完全培養基是在原培養基中加入10%胎牛血清。本發明所述的無血清DMEM/F12培養液是不加10%胎牛血清的DMEM/F12培養液。實施例3上述陽性細胞的篩選過程和轉染細胞的純化過程，具體步驟如下1、G418篩選及陽性細胞的獲得(1)轉染48h后待細胞匯合至80%時，將細胞傳代消化到另一個12孔板中，然后加入800 μ g/mL G418進行篩選，第7天時，可用胰酶于原皿消化細胞，棄去消化液并補加篩選液(完全DF12培養基加G418)。連續培養兩周，每兩天換相同濃度G418篩選液1次，每天觀察細胞生長及死亡情況。(2)待對照孔的細胞全部死亡后，將G418的濃度減半，降至400 μ g/mL。(3)繼續篩選細胞一個月左右，每兩天換1次液，直到陽性克隆可見為止。(4)將陽性克隆用濾紙片法消化并轉移至新12孔板，擴大培養。2、轉染細胞的純化(1)將擴大培養的陽性細胞消化后制成細胞懸液(2)用完全DMEM/F12培養基將細胞稀釋成100個/mL、50個/mL、25個/mL、10個 /mL和1個/mL的懸液。(3)將細胞懸液分別種入96孔培養板，每孔0. lmL，細胞含量分別為10個/孔、5 個/孔、2.5個/孔和1個/孔。(4)在37°C、體積分數比為5% CO2飽和濕度培養箱中培養。(5)每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況，選擇只有一個集落生長的孔，做好標記，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔。(6)待孔中細胞達到70% 80%的融合時，用蔗糖EDTA和胰酶分步消化法將細胞轉移到新的12孔板，進行擴大培養。實施例4細胞鑒定試驗過程1、轉染細胞形態學觀察原代培養的STECs (圖1)與永生化的STECs (圖2和圖3)形態相似，呈典型的上皮樣。細胞中央核明顯，常有2個以上的核仁，細胞可以鋪滿單層，單層細胞呈典型的鵝卵石鋪路石狀排列，細胞間存在接觸抑制。2、RT-PCR檢測永生化細胞中外源性hTERT的表達(1)細胞總RNA的提取方法如下①待原代第3代、永生化的第15代和35代細胞達到70% 80%時，將細胞消化下來轉移到1. 5mL的Eppendorf管內。②離心去掉細胞培養液，計入750 μ LTrizol，振蕩混合，室溫靜置lOmin。③加入200 μ L三氯甲烷，顛倒混勻，室溫靜置;3min。④4°C條件下，12000r/min 離心 15min。⑤吸取上清液550 μ L，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置15min。⑥4°C條件下，12000r/min 離心 15min。⑦棄去上清，加入預冷DEPC水處理過的70%乙醇。⑧4°C條件下，12000r/min 離心 15min。⑨棄去上清，瞬時離心，吸棄多余液體，室溫干燥lOmin。⑩加入M μ LDEPC水處理，融解lOmin，置_20°C備用。(2)引物設計與合成根據GenBank 中 hTERT 的 mRNA 序列，利用 Primer Premier 5. 0，設計了一對檢測外源性人端粒酶逆轉錄酶基因的引物，最終得到的產物為461bp，引物由南京金斯瑞公司合成。表IPCR引物序列
引物核苷酸序列
Pl5'-GCAAAGCATTGGAATCAG-3'
P25'-GTGTTCTGGGGTTTGATG-3'(3) RT-PCR 擴增①反轉錄合成cDNA反應體系如下總RNA提取液7 μ LOlig(dt) 152μ LdNTP2 μ LRNase-free Η20 2. 5 μ L70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，簡短離心收集反應液后加入如下成分
5XFirst-strand Buffer 4μ L0. IM DTT1 μ LRNasin0. 5 μ LTiANScript-M-MLV1 μ L混勻42°C溫浴50min，95°C加熱5min后終止反應，加液過程在冰上進行。②PCR擴增反應體系如下
Pl1 μ
Ρ21 μ
滅菌去離子水10 μL
MIX12.5 μ
反轉錄cDNA液0.5 μLPCR 反應條件為94°C 4min 預變性；94°C 30s，45°C 30s, 72°C 40s，共 30 個循環； 最后72°C延伸6min，4°C保存。③RT-PCR產物凝膠電泳鑒定取上述PCR產物5 μ L于10g/L TAE瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含0. 5μ g/mL溴化乙錠，電泳緩沖液為1XTAE，120V, 15min電泳完畢后于紫外凝膠成像系統觀察、拍照。結果顯示，在永生化的STECs兩個不同代次的細胞中均能擴增出特異性片段，片段長度與預期一致，約為461bp，而第3代的STECs擴增結果為陰性(見圖4)。3、角蛋白8的間接免疫熒光鑒定將永生化的細胞以1 X 105/cm2密度接種于預先放置2張蓋玻片的60mm培養皿內 24h后，棄掉培養液，收集2張爬片，PBS沖洗3次，丙酮固定15min，PBS沖洗，取1張爬片滴加一抗(小鼠抗人8型角蛋白單克隆抗體)，另一張做對照滴加PBS，4°C孵育24h，PBS洗滌 3次，再滴加二抗(羊抗小鼠FITC-IgG)，37°C避光作用30min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察。觀察結果顯示，角蛋白位于細胞膜上，細胞胞膜著色，顯示特異性的綠色熒光，細胞核不著色無熒光顯示，對照組無熒光，結果表明永生化的STECs為上皮源性(見圖5)。4、MTT法檢測細胞活力情況(1)將永生化的細胞按1 X IOVcm2接種于96孔板中，接于8排孔中，每孔再做3個重復，另接原代STECs做對照。(2)待細胞融合成單層，給第一排的3個孔加入20 μ LMTT液，繼續培養3 4h。(3)棄去培養基，加入DMSO 150 μ L，均勻混合，轉入新的酶標板中。(4)在酶標儀上，490nm波長，測其吸光度。(5)依此方法連續測8天，采集數據，繪制活力曲線圖。從圖中可以看到，永生化的STECs和STECs的活力曲線均呈倒置的“S”型(見圖 6)，兩種細胞在接種后的第3 5d為增殖活躍的對數生長期，然后進入平臺期。從圖中看出，永生化的STECs較STECs增殖活躍。5、流式細胞儀檢測細胞周期將培養至35代的永生化的STECs和培養至第3代的原代STECs消化下來，分別收集到1. 5mL的無菌離心管中，至少保證細胞濃度達到1 X IO6個，PBS液清洗，3000r/min離心5min，棄掉PBS液，再加入ImLPBS重懸，加入2mL無水乙醇充分混勻，吹散，使細胞成單個，4°C狀態下，送至流式細胞儀進行細胞周期檢測，對結果進行分析。從結果發現，永生化的STECs核型正常，依然為2倍體(見圖7和圖8)。第35代永生化的STECs在Gl期的細胞占53. 66%，少于第3代原代的STECs的75%，在S期細胞占46. 34%，多于第3代原代的STECs的22. 76%，表明永生化的STECs較原代的STECs增殖活力增加。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種豬氣管上皮細胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟(1)原代培養無菌獲取初生仔豬氣管，清除粘附組織，采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法消化分離獲得高純度的氣管上皮細胞；將分離得到的原代氣管上皮細胞懸浮于DF12培養基中，置于37°C，5% CO2條件下培養；(2)轉染和篩選提取純化含有hTERT基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT，采用脂質體轉染法，將編碼hTERT和neo基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT導入步驟(1)原代培養的豬氣管上皮細胞進行轉染；(3)篩選和擴大培養。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟( 將pCI-neo-hTERT質粒轉染原代培養的豬氣管上皮細胞，其具體步驟如下(1)轉染前Mh，將STECs用蔗糖EDTA和0.25 %胰酶分步消化成單個細胞，以1 X IO5 個細胞/孔接種到12孔板內，使細胞在轉染當天能達到80% 90%的融合；(2)轉染前4h更換無血清的DMEM/F12；(3)用無血清的DMEM/F12稀釋5μ L pCI-neo-hTERT質粒至體積為50 μ L，輕輕混勻， 質粒濃度達到300ng/ μ L 400ng/ μ L室溫作用5min ；(4)用無血清的DMEM/F12 分別稀釋 Lipofectamine 2000 6 μ L、9 μ L、12 μ L 到 50 μ L, 輕輕混勻，室溫作用5min ；(5)混合稀釋的質粒和稀釋的Lipofectamine2000，此時總體積為100 μ L。輕輕混勻， 室溫作用20min ；(6)將12孔板中的舊培養液吸出，用D-Hank’s清洗，加入900 μ L無血清的DMEM/F12 ；(7)逐滴加入脂質體/DNA混合物到不同孔中，邊加邊前后來回搖動培養板，輕輕混勻； 同時設立2孔未轉染作為空白對照；(8)在37°C、體積分數比為5%CO2飽和濕度培養箱中孵育4 6h，棄去培養液，加入完全的DMEM/F12培養基；(9)24h 4 觀察細胞，并及時換液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的具體操作為(1)轉染4 后待細胞匯合至80%時，將細胞傳代消化到另一個12孔板中，然后加入 800 μ g/mL G418進行篩選，第7天時，可用胰酶于原皿消化細胞，棄去消化液并補加篩選液，連續培養兩周，每兩天換相同濃度G418篩選液1次，每天觀察細胞生長及死亡情況；(2)待對照孔的細胞全部死亡后，將G418的濃度減半，降至400μ g/mL ；(3)繼續篩選細胞一個月左右，每兩天換1次液，直到陽性克隆可見為止；(4)將陽性克隆用濾紙片法消化并轉移至新12孔板，擴大培養。
4.根據權利要求1所述的方法建立的豬氣管上皮細胞系。
全文摘要
本發明公開了一種豬氣管上皮細胞系的建立方法，包括以下步驟(1)原代培養無菌獲取初生仔豬氣管，清除粘附組織，采用鏈酶蛋白酶灌注冷消化法消化分離獲得高純度的氣管上皮細胞；將分離得到的原代氣管上皮細胞懸浮于DF12培養基中，置于37℃，5％CO2條件下培養；(2)轉染和篩選提取純化含有hTERT基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT，采用脂質體轉染法，將編碼hTERT和neo基因的真核表達質粒pCI-neo-hTERT導入步驟(1)原代培養的豬氣管上皮細胞進行轉染；(3)篩選和擴大培養。本發明方法易于培養，生長速度較快，操作方法簡便。
文檔編號C12R1/91GK102174573SQ20111005076
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月3日 優先權日2011年3月3日
發明者張彥明 申請人:張彥明, 陳寶玉