專利名稱：基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法
技術領域：
本發明涉及寄生蟲領域，特別涉及瘧原蟲子孢子的分離技術。
背景技術：
瘧原蟲(Plasmodium)寄生于人及多種哺乳動物，目前已知有130余種。人體瘧原蟲的生活史，需要人和雌性按蚊做宿主，瘧原蟲在人體內先后經在肝細胞和紅細胞內發育。 在肝細胞內為裂體增殖，稱紅細胞外期(紅外期)；在紅細胞內發育包括紅細胞內裂體增殖期(紅內期)和配子體形成的有性期開始。蚊唾液腺內含有瘧原蟲子孢子的雌性按蚊刺吸人血時，感染性子孢子隨蚊的唾液進入人體，經血液循環約30分鐘孢子侵入肝細胞導致瘧疾感染。蟲體經紅外期、紅內期發育致瘧疾發病。子孢子入侵肝細胞是由于子孢子表面有一種蛋白(環子孢子蛋白，CSP)能與肝細胞表面的瘧原蟲受體相結合，使兩者接觸。然后，子孢子釋放由棒狀體內貯存的分泌物，作用于接觸的肝細胞膜，而主動侵入肝細胞。一個蚊唾液腺內可含有1000 10000 個子孢子。瘧原蟲子孢子呈梭形，長約10 15Mm，寬約lMm。在瘧疾的實驗研究中，，有時需大量有感染力的子孢子，但感染按蚊分離和純化子孢子較困難。現有技術中已公開了一種錐形試管低速離心分離蚊蟲體內子孢子的快速、簡單方法，具體為取一支0. 5mL的錐形管，用熱的20號皮下注射針在其底部穿一小孔，塞以小塊的玻璃棉，放入另1支1. 5ml的錐形試管中。將去頭蚊體放入錐形試管中，離心2-3分鐘，從蚊體組織和碎片中濾出的子孢子集中在錐形試管中形成一個球狀物。該方法分離按蚊數量有限(約30 — 50蚊/管)；分離效率低(約20 - 30%)；含大量蚊的碎片，影響其后的實驗結果等。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種瘧原蟲子孢子的分離方法，該方法將專用層析柱分離法和梯度離心法相結合，其分離效果好，適用于大規模分離、純化瘧原蟲子孢子。為實現上述目的，本發明的技術方案為
1、基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，具體包括以下步驟
A、預處理
將含有瘧原蟲子孢子的按蚊勻漿液離心，收集上清液，并對瘧原蟲子孢子計數，得子孢子勻漿液；
B、纖維素柱(Diethylaminoethylcellulose, DE 52)分離瘧原蟲子孢子
將步驟A所得子孢子勻漿液與緩沖液以體積比1:1 一 3的比例混合，得子孢子勻漿稀釋液，將所述子孢子勻漿稀釋液在重力作用下過纖維素柱，流速為5-7mL/分鐘，收集洗脫液，所述洗脫液中含有瘧原蟲子孢子。2、根據1所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，步驟B所述纖維素柱包括底部開孔4的中空柱體1，柱體內從下至上依次填充有玻璃纖維層2和DE 52纖維素層
33。3、根據2所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，所述纖維素柱的DE 52 纖維素層包括緩沖液和經過緩沖液充分浸泡的DE 52纖維素。4、根據1所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，步驟A預處理具體為將含有瘧原蟲子孢子的按蚊勻漿液經離心機中100rpm/3-4g離心30秒，700_800rpm/25g離心5分鐘，在2000-2500rpm/700g離心20分鐘后，再以1:1-3置于199或DMEM培養基中， 內含有體積濃度為35%牛白蛋白液，用細胞計數器對瘧原蟲子孢子進行計數，使瘧原蟲子孢子濃度為1 X IO5個/ml，即為獲得的子孢子勻漿液。5、根據1所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，步驟B預處理具體為 將步驟A所得子孢子勻漿液置于冰上，孵育至少30分鐘，然后置于室溫，與緩沖液以體積比 1 1的比例混合，得子孢子勻漿稀釋液，將所述子孢子勻漿稀釋液在重力作用下過纖維素柱，流速為5-7mL/分鐘，收集洗脫液5，所述洗脫液中含有瘧原蟲子孢子。本發明的有益效果在于建立一種純化分離雌性按蚊體內瘧原蟲子孢子的技術； 該技術的子孢子分離率達70 80%;并保持瘧原蟲子孢子感染活力和抗原性，可用于實驗性研究。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖1為纖維素柱的結構示意圖2純化的約氏瘧原蟲的唾液腺子孢子染色圖，吉氏染色100X ； 圖3相差顯微鏡觀察純化的約氏瘧原蟲的唾液腺子孢子，60X。
具體實施例方式
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例1蚊胸部瘧原蟲子孢子純化、分離方法一、收獲約氏瘧原蟲子孢子
1)斯氏按蚊(Anophelesstephensi Hor株)在羽化后3 5d的雌性成蚊，叮吸感染約氏瘧原蟲的小鼠血；
2)約氏瘧原蟲感染小鼠要求經子孢子感染后，紅內期轉種四代內(y0- y4)，紅內期配子體密度為2-3/每個視野內(40X )；或蟲體密度為15-20% ；
3)吸血感染后置于，相對濕度70% 80%的恒溫室內繼續飼養。在7d-8d時， 檢查蚊胃的卵囊；在14d - 16d時，檢查蚊的唾液腺。計算該批蚊的瘧原蟲感染率達60 70%、感染度為蚊胃的卵囊數達20 30個左右；
4)在感染后14 15d時，取腺感染60 70%以上的雌性斯氏按蚊將120 150只感染約氏瘧原蟲的斯氏按蚊全蚊；或剪去蚊頭、腹部以及足和翅，僅留按蚊的胸部，將120 150左右蚊胸部，加3 4mL的199培養基或DMEM培養基，在玻璃勻漿器內勻漿。以上操作應在冰上進行。勻漿液經100rpm/3g (100rpm/3-4g均可實現)，離心30秒，沉淀蚊的大顆粒脆片，然后上清液經700rpm/25g (700-800rpm/25g均可實現)離心5min，沉淀蚊組織，細胞計數器初步檢測上清液中子孢子的數量為1 一 5X105個/mL;再經2000rpm/700g (2000-2500rpm/700g均可實現)離心20min，離心后以1:1 一 3，置于199或DMEM培養基內含35%牛白蛋白(Bovine albumin)中，供實驗用。二、DEAE纖維素柱純化、分離瘧原蟲子孢子
所述纖維素柱包括底部開孔的中空柱體，柱體內從下至上依次填充有玻璃纖維層和DE 52纖維素層。進一步，所述纖維素柱的DE 52纖維素層包括緩沖液和經過緩沖液充分浸泡的DE 52纖維素，詳見圖1。所述纖維素柱長度和直徑柱長為80mm，管長為95mm ； 直徑為16mm。(一)DEAE纖維素的預制備DE 52預溶脹，貯存于IOXbuffer (內含葡萄糖或 NaCl), 4°C。纖維素柱小片狀的玻璃毛置于IOml注射器的底部。將DE 52纖維素注入(注入 30mm，沉淀后為20mm)，靜置。(二)試劑的制備
1. IXbuffer :HC1調pH至8. 2。不同體積Buffer的配方如下表
權利要求
1.基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，其特征在于，具體包括以下步驟A、預處理將含有瘧原蟲子孢子的按蚊勻漿，對勻漿液離心，去除蚊組織碎片，收集上清液，獲得含子孢子勻漿液，并用細胞計數器進行瘧原蟲子孢子計數；B、纖維素柱純化分離瘧原蟲子孢子將步驟A所得子孢子勻漿液與緩沖液以體積比1:1-3的比例混合，獲得子孢子勻漿稀釋液，將所述子孢子勻漿稀釋液在重力作用下過纖維素柱，流速為5-7 mL/min，收集洗脫液，所述洗脫液中含有瘧原蟲子孢子。
2.根據權利要求1所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，其特征在于步驟 B所述纖維素柱包括底部開孔(4)的中空柱體(1)，柱體內從下至上依次填充有玻璃纖維層 (2)和DE 52纖維素層(3)。
3.根據權利要求2所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，其特征在于所述纖維素柱的DE 52纖維素層包括緩沖液和經過緩沖液充分浸泡的DE 52纖維素。
4.根據權利要求1所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，其特征在于，步驟 A預處理具體為將含有瘧原蟲子孢子的按蚊勻漿液經離心機離心，100rpm/3-4g離心30 秒，700-800rpm/25g離心5分鐘，在2000-2500rpm/700g離心20分鐘后，再以1:1-3置于 199或DMEM培養基中，內含有體積濃度為35%牛白蛋白液，用細胞計數器對瘧原蟲子孢子進行計數，使瘧原蟲子孢子濃度為1 X IO5個/ml，即為獲得的子孢子勻漿液。
5.根據權利要求1所述的基于纖維素柱的瘧原蟲子孢子分離方法，其特征在于，將步驟A所得子孢子勻漿液置于冰上，孵育至少30分鐘，然后置于室溫，與緩沖液以體積比 1:1-3的比例混合，獲得子孢子勻漿稀釋液，將所述子孢子勻漿稀釋液在重力作用下過纖維素柱進行純化分離，在柱長80mm和直徑16mm的纖維素柱，流速為5_7ml/分鐘，收集前段的洗脫液約30ml，所述洗脫液中含有純化分離的瘧原蟲子孢子。
全文摘要
本發明涉及寄生蟲學研究領域，特別設計瘧原蟲子孢子的分離技術，具體為將含有瘧原蟲子孢子的按蚊勻漿,對勻漿液離心，收集上清液，獲得含子孢子勻漿液，并用細胞計數器進行瘧原蟲子孢子計數；將所得子孢子勻漿液與緩沖液以體積比1:1-3的比例混合，獲得子孢子勻漿稀釋液，將所述子孢子勻漿稀釋液在重力作用下過纖維素柱，流速為5-7mL/min，收集洗脫液，所述洗脫液中含有瘧原蟲子孢子；建立一種純化分離雌性按蚊體內瘧原蟲子孢子的技術；該技術的子孢子分離率達70～80%；并保持瘧原蟲子孢子感染活力和抗原性，可用于瘧原蟲的實驗性研究。
文檔編號C12N3/00GK102181395SQ20111004665
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月28日 優先權日2011年2月28日
發明者張建煒, 張錫林 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學