專利名稱：一種甲型h1亞型流感病毒雙抗體夾心elisa試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物病毒學與動物傳染病學檢測技術領域。具體地說，本發明涉及一種甲型Hl亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒及其在豬群中甲型Hl亞型流感病毒抗原檢測的應用。
背景技術：
1975年,Kohler G和Milstein C在Nature雜志上發表了細胞融合法建立雜交瘤技術，創建了具有劃時代意義的雜交瘤單克隆抗體技術。經克隆后產生結構和各種特性完 全相同的高純度抗體，稱為單克隆抗體(Monoclonal Antibody, McAb),簡稱單抗。單克隆抗體技術的發現和使用，對現代生命科學研究的發展起到了巨大的推動作用，已經成為生物技術領域的一個重要方面。迄今，該技術的應用已經廣泛應用于基礎研究、疾病診斷、治療、預防等方面。2009年6月世界衛生組織宣布對甲型(HlNl)流感的警戒級別升至6級，意味著甲型(HlNl)流感的世界性大流行已形成。最近一次流感的世界性大流行起源于墨西哥，一開始被稱為豬流感(Swine flu)，后根據病毒的分析，改稱為豬源性流感病毒感染(swineorigin influenza virus infection,簡稱 S-0IV infection),最后為了與人的季節性流感A(HlNl)區別，改稱新流感A(HlNl)，在我國則稱為甲型HlNl流感。甲型HlNl流感對人及動物的健康造成巨大的影響，而且對經濟造成了巨大的損失。1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚丙乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunosrbentAssay,簡稱ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反應板作為固相免疫吸附載體，使ELISA方法得以推廣應用，使得用于抗原定位的酶標記抗體技術發展成為液體標本中微量物質的測定方法，并逐漸成為抗原抗體檢測中最為常用的一種方法。它將酶標記物同抗原抗體復合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合，既保持了酶催化反應的敏感性，又保持了抗原抗體反應的特異性，因而極大的提高了靈敏度。同時它又是一種非均相免疫分析方法，即在反應的每一步都有洗滌過程，從而除去了未反應物和干擾物質。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測迅速和非放射性以及可以批量測定等諸多優點，使得ELISA方法得到了越來越廣泛的應用。(焦奎等.酶聯免疫分析技術及應用[M].北京化學工業出版社，2004，84 141;李文敏.酶聯免疫吸附反應的技術進展及應用[J].湖北職業技術學院學報，2003，4 (6) 65 69)酶標記抗體技術是ELISA檢測方法的關鍵技術，本發明中所用的酶標記抗體是本實驗室自行生產抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素單克隆抗體，經過辣根過氧化物酶(簡稱HRP)標記，具有很高的酶活性，產量高及成本低。
發明內容
本發的的主要目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種甲型Hl亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，以解決豬群中甲型Hl亞型流感病毒抗原的檢測。本發明的第一個目的是得到一種特異性強的可用于組裝ELISA試劑盒的核心試劑的抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體。本發明的第二個目的是建立一種甲型Hl亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA檢測方法
本發明的第三個目的是組裝一種甲型Hl亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒。本發明的第四個目的是利用該試劑盒在豬群甲型Hl亞型流感病毒抗原檢測中的應用。本發明是這樣實現的申請人:所在的華中農業大學農業微生物國家重點實驗室病毒室從豬群中分離得到的一株甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株，該毒株于2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO:V201105。申請人:制備了一種特異性強的單克隆抗體，它是抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株5F7，于2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCNO C201106o申請人:利用所述的單克隆抗體制備成雙抗體夾心ELISA核心試劑，組裝了一種用于快速檢測適用于豬群的甲型Hl亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA試劑盒。本發明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內的樣品稀釋液、洗滌液、底物A液、底物B液、終止液，陽性對照樣品和陰性對照樣品組成。更詳細的技術方案如下所述。抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體的制備，它包括下列步驟I)以從豬群中分離得到的一株保藏編號為CCTCC NO V201105的甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML-F9為抗原，經過擴增、滅活和純化，對5_8周齡BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)進行免疫。2)細胞融合，取經加強免疫后的BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)的脾臟，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛生部武漢生物制品所)融合。3)利用血凝抑制法(HI)(肖金暉等.RT-PCR法與血凝抑制法鑒定流感病毒的比較[J].中國熱帶醫學，2005，5 :401 402)，篩選出分泌抗甲型Hl亞型亞型流感病毒血凝素(HA)抗體的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(但漢并等.H5亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及鑒定[J].動物醫學進展，2006，27 (8) :67 69)進行克隆、篩選。經過3 5次克隆純化，最終篩選出分泌抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白抗體的單克隆雜交瘤細胞株(保藏編號為CCTCC NO C201106)。4)腹水的制備，取雌5-6周齡BABL/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐劑O. 5ml/只，5天后腹腔注射I X IO6個雜交瘤細胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制(HI)法檢測腹水效價，_70°C保存。5)將保藏編號為CCTCC NO C201106單克隆抗體進行純化和標記。
上述抗體(保藏編號為CCTCC NO C201106)經過純化和標記后可用于制備檢測甲型Hl亞型流感病毒的雙抗體夾心ELISA試劑盒。與現有技術相比本發明具有如下顯著優點I、本發明的試劑盒能直接對甲型Hl亞型流感病毒進行檢測，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短，檢測樣品范圍寬(雞胚尿囊液、內臟組織勻漿液)的特點。2、本發明的試劑盒適用于對甲型Hl亞型豬流感病毒進行檢測，對經典Hl亞型豬流感病毒不反應，具有特異性。3、本發明的試劑盒適用于對甲型Hl亞型流感病毒進行檢測，而對其它亞型的流感病毒，如經典Hl亞型、H3亞型、H5亞型、H9亞型的流感病毒，則不反應，具有很好的特異性。4、本發明將所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡單易行，不需由專業人員操作。本發明的試劑盒穩定性好、保存期長，在4°C條件下放置半年不會影響其敏感性。5、本發明一次能同時處理多個樣本，非常適合甲型Hl亞型豬流感病毒的臨床大規模檢測。并能夠滿足試驗要求，也可作為科研使用。6、目前市場上還沒有檢測甲型Hl亞型豬流感病毒抗原(北美流感)的試劑盒。也無區分甲型Hl亞型豬流感病毒(北美流感)和經典Hl亞型流感病毒的鑒別診斷試劑盒。
圖I :是本發明總體技術路線圖。圖2 :是SP2/0細胞染色體計數。圖3 :5F7雜交瘤細胞染色體計數。圖4 :抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白單克隆抗體間接免疫熒光檢測圖。其中圖4A :為抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素(HA)蛋白單克隆抗體間接免疫熒光檢測圖；圖4B為陰性對照
具體實施例方式實施例I制備實施例一、甲型Hl亞型流感病毒的分離I、分離過程用滅菌的咽拭子采集病豬咽喉樣本，置于滅菌磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS，配方Na2CO3 I. 59g, NaHCO3 2. 93g，用ddH20定容至1000ml)中，隨后將咽拭子樣本液O. 2ml接種9日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司)，置35°C下孵育72h，收貨尿囊液做血凝定性試驗，血凝試驗為陽性的樣本，再經過RT-PCR試驗定型。2、鑒定依據=RT-PCR檢測為陽性的樣本，擴增HA，送上海生工生物工程有限公司測序，對所得DNA序列與網上公布的序列(http://blast, ncbi. nlm. nih. rov/)進行比對，以確定病毒亞型。 3、甲型Hl亞型流感病毒株的病毒學特征經過的HA-DNA序列比對，得出與北美流感HA-DNA核酸同源達99. 2 %，氨基酸同源達99. O %，因此確實了我們獲得的流感病毒為甲型Hl亞型流感病毒。
4、專利程序的保藏將鑒定后得到的得甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML_F9送交位于湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO V201105o二、甲型Hl亞型流感病毒(保藏編號為CCTCC NO V201105)的擴增、滅活及純化I、將保藏編號為CCTCC NO V201105的甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML-F9進行擴增；(I)嚴格篩選9 10日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司)
每批送過來的雞胚要經過嚴格篩選。外檢共4項白殼、大小、破損及臟胚，內檢共9項去除沙殼、偏氣室、游氣室、倒置胚、無精蛋、終止胚、弱胚、污染胚、裂縫胚。(2)接種病毒(A-Influ/JML_F9)于雞胚尿囊腔選用9 10日齡無特定病原體(Specific pathogen Free, SPF)雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司)，畫出氣室和胚位，在氣室接近胚位處涂抹碘酊和酒精進行消毒，用鋼錐穿一小孔，隨后將Iml注射器針頭沿此小孔插入(避開血管)，接種甲型Hl亞型流感病毒(A-Influ/JML-F9)。最后用石蠟封口，并置35°C下孵育72h。每天檢查雞胚生長情況，每12h翻卵并檢卵一次。24h內死亡的雞胚，認為是非特異死亡并棄去，72h收取雞胚，4 °C下放置過夜。(3)含甲型Hl亞型流感病毒(A-Influ/JML-F9)尿囊液的收獲用75%濃度的酒精消毒雞胚氣室端，用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，在絨毛尿囊膜無大血管處穿破。用無菌移液管吸取雞胚尿囊液置于相應的收集管中。將雞胚收獲液3000r/min離心5min去除血液和細胞。然后進行紅細胞凝集實驗，確定雞胚尿囊液血凝效價。2、甲型Hl亞型流感病毒A-Inf lu/JML-F9的滅活將含病毒A-Influ/JML_F9尿囊液凍融3次后，按終濃度O. 8%的甲醛緩慢加入甲醛溶液，充分混合均勻，37°C滅活24小時，每隔6小時振搖I次。每個病毒滅活容器應立即取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗。滅活容器的甲型Hl亞型流感病毒的尿囊液經檢定合格。8000r/min,離心lOmin。棄去沉淀,上清備用。3、甲型Hl亞型流感病毒A-Inf lu/JML-F9濃縮及純化(I)將甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML-F9進行濃縮，方法是將甲型Hl亞型流感病毒雞胚尿囊液于27000r/min，離心2h，棄去上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，充分混勻備用。 (2)甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML-F9純化在超速離心管中依次加入60%、45%、30%、20%濃度蔗糖溶液形成密度梯度。將重懸好的病毒A-Influ/JML_F9樣品平鋪于最上層，于32000r/min,離心lh。離心后取出45%、30%之間層面樣品，用PBS重懸30%、45%之間層面樣品取出樣品，320001'/11^11，離心lh，取沉淀(即得所述的病毒A-Influ/JML-F9)進行蛋白質含量測定。以此作為免疫原。實施例2抗甲型Hl亞型流感血凝素蛋白單克隆抗體的制備I、以滅活及純化的甲型Hl亞型流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株(保藏在湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0V201105)為抗原，加弗氏佐劑乳化(首免選用弗氏完全佐劑，二、三免選用弗氏不完全佐劑)免疫5-8周齡BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)。首免劑量為20ug/只，每只小鼠頸背部皮下多點注射。二周后用相同劑量加強免疫一次，二周后再加強免疫一次，劑量為40ug/只，二周后斷尾采集少量小鼠血，收集血清，用血凝抑制法檢測小鼠抗體效價。待小鼠抗體達到試驗要求，再經腹腔注射滅活及純化的甲型Hl亞型流感病毒A-Inf lu/JML-F9，注射劑量為40ug/只免疫一次。三天后，即可取免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛生部武漢生物制品所)按實驗室常規方法進行融合2、細胞融合，取經過強化免疫的BALB/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%濃度酒精中浸泡IOmin消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細胞(購自衛生部武漢生物制品所)按IX IO7個SP2/0與IO8個免疫細胞(個數比I : 10)的比例于50ml離心管中混勻，1500r/min，離心lOmin。棄去上清，管壁用滅菌的濾紙吸干，輕震管底，使細胞沉淀略有松動。將裝有細胞混合物的離心管放置于37°C恒溫水浴中。然后在Imin內慢慢滴入預溫至37°C的50%聚乙二醇(PEG)O. 8ml (購自sigma公司)，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，繼續攪拌lmin。然后慢慢加入預溫至37°C的1640(購自sigma公司)細胞培養液40ml。融合具體步驟如下第一分鐘逐滴滴入50%聚乙二醇(PEG)O. 8ml，靜置O. 5min ;第二分鐘加1640細胞培養液lml，靜置O. 5min (重復一次)；第四分鐘加I. 5ml，靜置O. 5min (重復一次)；第六分鐘加5ml，靜置O. 5min (重復一次);第八分鐘加10ml，靜置O. 5min (重復一次);每次加時需緩慢加入，并不斷輕輕地攪拌。靜置lmin, 1000r/min離心IOmin,棄上清,于37°C環境中放置8min。用HAT培養基(購自Sigma公司)懸浮，同時也用HAT培養基懸浮制備好的飼養脾細胞并與融合后的細胞混合，根據需要補加適量的HAT培養基，分種于96孔培養板中，約200 μ I/孔。一次融合可接種4 8塊96孔板。根據需要也可少種，一般按SP2/0的細胞數計算，每孔接種量約含IO4左右個SP2/0細胞。于37°C，5% C02培養箱中培養。融合后第二天開始觀察96孔板內細胞有無污染，于第4天用HT培養基換HAT培養基100 μ I。待融合細胞集落長至培養孔1/4，培養基略變黃時，進行抗體效價檢測。采用滅活的的甲型Hl亞型流感病毒(A-Influ/JML-F9)作為篩選抗原，利用血凝抑制法(肖金暉等.RT-PCR法與血凝抑制法鑒定流感病毒的比較[J].中國熱帶醫學，2005，5 :401 402)篩選出分泌抗甲型Hl亞型亞型流感病毒血凝素(HA)抗體的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(但漢并等.H5亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及鑒定[J].動物醫學進展，2006，27 (8) :67 69)進行克隆、篩選。經過3 5次克隆純化，最終篩選出分泌抗甲型Hl亞型亞型流感病毒血凝素(HA)抗體的單克隆雜交瘤細胞株5F7，于2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCNO C201106o3、腹水的制備，選用5-6周齡雌BABL/c小鼠(購自湖北省實驗動物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐劑O. 5ml/只，5天后腹腔注射IX IO6個雜交瘤細胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法(HI)檢測腹水效價，_70°C保存。4、腹水抗體的純化辛酸-硫酸銨法具體步驟如下(I)將上述步驟3制備的腹水1000r/min離心IOmin,用0. 45 μ m濾膜過濾,濾液邊攪拌邊加入用4倍體積60mmol/L醋酸緩沖液(pH = 4. 5)；(2)邊攪拌邊逐滴加入正辛酸至終濃度為33μ 1/ml，室溫條件下攪拌30min，8000r/min離心30min,棄沉淀收集上清；(3)將步驟⑵的上清液經濾紙過濾一次，濾液pH調制7. 4 ；(4)向步驟(3)所得的濾液邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液(硫酸銨體積/總體積< 45% )，待濾液程白色渾濁液時，繼續攪拌30min，然后于4°C靜置5h。再于4°C條件12000r/min 下離心 30min ；(5)棄上清,沉淀用 IOmmol pH = 9. OTris-HCl 重懸；在 100 倍體積的 IOmmol pH=9. O的Tris-HCl中，于4°C條件下磁力攪拌透析,透析透析36h,期間3次(12h/次)更換新鮮Tris-HCl液。透析結束，取上清，用SDS-PAGE電泳的方法鑒定抗體的純度，用紫外分光光度計測定抗體濃度，分裝、凍存。上述純化抗體試驗中所用試劑按照以下配方配制醋酸緩沖液(60mmol/L)=C2H3NaO2 2. 463g，用 ddH20 定容至 500ml (pH = 4· 5)。飽和硫酸銨溶液每100ml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加熱至80°C溶解，趁熱濾紙過濾，降至室溫既有結晶析出，所得帶有結晶濾液即為飽和硫酸銨溶液。用25%氨水調pH值至7. 2，備用。5、辣根過氧化物酶(HRP)標記單克隆抗體(保藏編號為CCTCC NO C201106)(I)取5. Omg的辣根過氧化物酶(HRP) 5. Omg溶于5ml ddH20,溶液呈棕紅色；隨后滴加NaIO4溶液^0mmOl/L)0. 5ml，使溶液呈草綠色，4°C條件放置30min ;滴加乙二醇溶液(160mmol/L)0. 5ml，終止氧化反應，室溫下避光條件放置30min，溶液呈棕黃色；(2)取本發明制備的單克隆抗體(保藏編號為CCTCC NO C201106) 5ml (lmg/ml)與上述步驟(I)所處理好的液體混合，IOmmol pH = 9. 5碳酸鹽緩沖液,4°C條件下磁力攪拌透析過夜。(3)向完成透析液體中加新鮮配制的濃度為5mg/ml的NaBH4溶液O. 2ml,于4°C下放置2h ;然后等體積加入飽和硫酸銨溶液，于4°C下靜置30min，7000r/min離心lOmin，棄去上清。PB 溶液(20mmol/L pH = 7. 4,) 3ml 重懸,在 1000 倍體積的 PB (20mmol/L pH =7.4)中，4°C條件下磁力攪拌透析，透析36h，期間3次(12h/次)換液。(4)標記抗體(保藏編號為CCTCC NO C201106)完成透析后，加PB(20mmol/L pH=7. 4)、甘油(終濃度30%)定容至5ml，于-20°C保存。標記抗體試驗中所用試劑按以下配方配制NaI04 溶液(60mmol/L) =NaIO4 I. 283g，用 ddH20 定容至 IOOml ；乙二醇溶液(160mmol/L):乙二醇13. 4 μ 1，用 ddH20 稀釋至 I. 5ml ；碳酸鹽緩沖液IOmmol pH = 9. 5 =Na2CO3 I. 59g，NaHCO3 2. 93g，用 ddH20 定容至IOOOml (pH = 9. 5)；NaBH4 溶液(5mg/ml) :NaBH40. 05g,用 ddH20 定容至 10ml,現配現用；飽和硫酸銨溶液每IOOml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加熱至80°C溶解，趁熱濾紙過濾，降至室溫既有結晶析出，所得帶有結晶濾液即為飽和硫酸銨溶液。用25%氨水調pH值至7. 2，備用。PB 溶液(20mmol/L pH = 7. 4) =Na2HPO4 · 12H20 3. 58g, NaH2PO4 I. 56g,用 ddH20 定容至 1000ml, pH = 7. 4。實施例3抗甲型Hl亞型流感血凝素蛋白單克隆抗體(保藏編號為CCTCC NOC201106)的鑒定1、HI效價的鑒定采用本發明分離得到的甲型Hl亞型流感病毒(保藏編號為CCTCCNO V201105)作為抗原用血凝抑制法測定雜交瘤細胞培養上清及小鼠腹水的效價。結果見表I。表I :利用血凝抑制法(HI)測定雜交瘤細胞培養上清及小鼠腹水的效價
權利要求
1.一種抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號為CCTCCNO V201105的甲型HlNl流感病毒A-Influ/JML_F9制備的雜交瘤細胞株所分泌的，所述的雜交瘤細胞株5F7保藏號為CCTCC NO :C201106。
2.一株抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素的單克隆抗體的雜交瘤細胞株5F7，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO :C201106。
3.包含權利要求I所述的單克隆抗體的甲型Hl亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒。
4.一種適用于豬的甲型Hl亞型流感病毒抗原檢測的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒由下列部分構成保藏號為CCTCC NO C201106的單克隆抗體包被的酶標板，辣根過氧化物酶標記的保藏號為CCTCC NO C201106的單克隆抗體作為酶標二抗，樣品處理A液、樣品處理B液、陽性對照樣品、陰性對照樣品、底物A液、底物B液、終止液和10倍洗滌液； 其中 所述的試劑組分及其配比如下(1)樣品處理A 液的配制稱取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g，H3BO3 16. 08g，NaCl 8. 5g，ddH20800mL,調pH至8. 4后用蒸餾水定容至IOOOmL ;在121°C高壓蒸汽下滅菌30分鐘后分裝，置4°C貯存；(2)樣品處理B 液的配制稱取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g，H3BO3 16. 08g，NaCl 8. 5g，ddH20800mL，調pH值為8. 4后用蒸餾水定容至IOOOmL ;在121°C高壓蒸汽下滅菌30分鐘后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40,混勻后分裝，置4°C貯存； (3)陽性對照的配制將含病毒尿囊液凍融3次后，按終濃度O.8%的甲醛緩慢加入甲醛溶液，充分混合均勻，37°C滅活24小時，每隔6小時振搖I次；加入O. 02% NaN3防腐，并作為陽性對照樣品分裝成O. 5mL/管，置4°C下保存； (4)陰性對照的配制收取SPF雞胚尿囊液，4°C，12000r/min離心30min后加入O.02%NaN3防腐。分裝成O. 5mL/管，置4°C下保存； (5)底物A液0.006% H2O2緩沖液；(6)底物B 液:取 Na2HP04*12H20 14. 2g，檸檬酸 10. 5g，用 ddH20 定容至 500m 配成 O. ImL磷酸鹽檸檬酸緩沖液，PH5. O ;按終濃度為20mg/L添加聯苯二胺； (7)終止液濃度為40%氫氟酸溶液625μ L，用ddH20定容至IOOmL ；(8)10 倍洗滌液NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 · 12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 lOOOmL，pH7. 4。
5.一種適用于豬的甲型Hl亞型流感病毒抗原檢測的雙抗體夾心ELISA方法，包括制備保藏號為CCTCC NO C201106的單克隆抗體包被的酶標板，辣根過氧化物酶標記的保藏號為CCTCC NO C201106的單克隆抗體，樣品處理A液、樣品處理B液、陽性對照樣本、陰性對照樣本、底物A液、底物B液、終止液和10倍洗滌液，其步驟包括 (1)以保藏號為CCTCCNO V201105的甲型HlNl流感病毒A-Inf lu/JML_F9，作為免疫原； (2)用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號為CCTCCNO C201106的單克隆抗體； (3)用步驟(2)所述的單克隆抗體包被酶標板作為一抗；(4)將待檢測樣品用樣品處理液進行處理得到待檢測物； (5)用辣根過氧化物酶標記的保藏號為CCTCCNO C201106的單克隆抗體作為二抗； (6)對步驟(4)所述的待檢測物進行檢測，于酶標儀上讀取630納米處的吸光光度值；其中各試劑的組分及配制如下10 倍洗滌液NaCl 80g, KCl 2g，Na2HPO4 · 12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 IOOOmL ；樣品處理 A 液稱取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800mL，調pH值為8. 4后用蒸餾水定容至IOOOmL ;在121 °C高壓蒸汽下滅菌后分裝，置4°C貯存，用于處理內臟組織； 樣品處理 B 液稱取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800mL，調pH值為8. 4后用蒸餾水定容至IOOOmL ;在121 °C高壓蒸汽下滅菌后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mLNP-40,混勻后分裝，置4°C貯存，用于處理喉頭拭子。
底物A液0. 006% H2O2緩沖液；底物 B 液-M Na2HPO4 · 12H20 14. 2g，檸檬酸 10. 5g，用 ddH20 定容至 500m 配成 O. ImL 磷酸鹽檸檬酸緩沖液，PH5. O,按終濃度為20mg/L添加聯苯二胺； 終止液濃度為40%氫氟酸溶液625 μ L，用ddH20定容至100mL。
6.權利要求I所述的甲型HlNl流感病毒A-Influ/JML-F9，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO :V201105。
7.權利要求I所述的單克隆抗體在制備甲型Hl亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒中的應用。
8.權利要求3或4所述的試劑盒在甲型Hl亞型流感病毒抗原體外檢測中的應用。
全文摘要
本發明屬于動物病毒學與動物傳染病學檢測技術領域。具體涉及一種甲型H1亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒及應用。本發明試劑盒包括抗甲型H1亞型流感病毒血凝素的保藏號為CCTCC C201106的單克隆抗體包被的酶標板，辣根過氧化物酶標記甲型H1亞型流感病毒血凝素單克隆抗體為二抗。公開了甲型H1亞型流感病毒的分離、擴增、滅活和純化方法及甲型H1亞型流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及純化方法。還公開了甲型H1亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法。
文檔編號C12N7/00GK102633878SQ20111003616
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月11日 優先權日2011年2月11日
發明者但漢并, 周洪波, 張安定, 王燦, 趙剛, 郭學波, 金梅林 申請人:華中農業大學