專利名稱：密碼子優化的豬cd40l基因及表達其編碼蛋白的重組桿狀病毒的制備方法
技術領域：
本發明涉及密碼子優化的豬CD40L基因及表達其編碼蛋白的重組桿狀病毒的制備方法，屬于基因工程領域。
背景技術：
豬⑶40L分子是腫瘤壞死因子受體⑶40分子的配體，主要表達于活化的⑶4+T淋巴細胞表面。天然的CD40L分子以兩種形式存在，即為可溶型和跨膜型，當前研究較深入的為跨膜型CD40L。豬⑶40L分子為一個II型跨膜糖蛋白，全長cDNA編碼261個氨基酸殘基(AA)，其中氨基未端22個AA組成CD40L分子的胞漿段，緊接的23個AA構成跨膜段，羧基端的216 個AA組成CD40L的胞外段。豬CD40L cDNA的編碼蛋白約^kDa。豬CD40L與其受體CD40分子在機體免疫應答中起到至關重要的作用，對調節體液免疫和細胞免疫反應具有樞紐作用。CD40L與CD40相結合參與B淋巴細胞的發育分化以及免疫球蛋白的類型轉換；促進T淋巴細胞的激發和定向活化；參與抗原遞呈細胞的分化和功能調節。諸多資料表明，CD40L可作為一種新型的免疫增強劑調節動物機體免疫應答，因此建立一種豬的CD40L表達體系，為進一步實驗研究奠定基礎。大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，培養操作簡單，轉化轉導效率高，生長繁殖快周期短，抗污染能力強，成本低廉，可以快速大規模生產目的蛋白等優點，表達的外緣蛋白能夠占到細菌總蛋白的30%。因此大腸桿菌表達系統在基因表達技術中占有重要的地位，是分子生物學研究和生物技術產業化發展進程中的重要工具。編碼氨基酸的密碼子具有簡并性，而每種生物對同義密碼子的選擇都有自己的偏好性。目的基因的表達受到多方面因素的影響，如遺傳密碼的偏嗜性、目的蛋白的結構，表達系統選擇的表達條件等，其中根據表達宿主的密碼子偏好性對目的基因進行優化，能夠大大提高表達宿主的表達效率，從而提高目的蛋白的表達量。
發明內容
本發明的目的是提供密碼子優化的豬CD40L基因，符合昆蟲細胞密碼子偏嗜性， 適合在桿狀病毒系統中進行表達。同時，還提供表達該基因編碼蛋白的重組桿狀病毒的制備方法。本分明提供一種密碼子優化的豬⑶40L基因，包括SEQ ID N0:3所示的序列。所述密碼子優化的豬CD40L基因，其序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4或SEQ ID N0:5所示。本發明提供表達上述基因編碼的豬CD40L蛋白的重組桿狀病毒的制備方法(1)將所述基因與質粒pFast Dual相連，構建重組質粒；
(2)將所述重組質粒轉化入DHlOBac，通過藍白斑篩選獲得卡那霉素、四環素、慶大霉素抗性的重組DHlOBac ；(3)將所述重組DHlOBac轉染Sf_9細胞獲得重組桿狀病毒。所述重組桿狀病毒表達的豬⑶40L蛋白經SDS-PAGE電泳，圖譜上出現分子量約為 ^kD的蛋白；Western-blot試驗顯示在^kD左右出現能夠與兔抗豬CD40L多克隆抗體結合的特異性條帶。本發明提供密碼子優化的豬CD40L基因，符合昆蟲細胞密碼子偏嗜性，適合在桿狀病毒系統中進行表達，表達出的豬CD40L分子生物活性高，能夠增強機體的免疫應答能力。
圖1是RT-PCR產物的電泳圖其中，I-RT-PCR產物，2-分子量2000bp的標準Marker圖2是載體pMD-P⑶40L的酶切鑒定電泳圖其中，1-分子量2000bp的標準Marker，2_PMD_P⑶40L重組載體的酶切產物；圖3是載體pET-P⑶40L的酶切鑒定電泳圖其中，1-分子量2000bp的標準Marker，2-pET_PCD40L的酶切產物；圖4是表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖其中，1-蛋白標準Marker，2 5_誘導時間分別為3、4、5、他時表達蛋白，6_誘導菌超聲后上清，7-誘導菌超聲后沉淀，8-純化的重組蛋白；圖5是不同濃度IPTG誘導后，表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖其中，1-蛋白標準Marker，2 6-IPTG 誘導濃度分別為 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OmM ；圖6是SCD40L基因的PCR產物電泳圖其中，1、2-PCR產物，3-分子量2000bp的標準Marker圖7表示重組穿梭載體的鑒定電泳圖其中，1-陰性對照，2-分子量為15000的DNA標準Marker，3-Bac_PCD40L重組載體基因，4-Bac-LhCD40L重組載體基因，5-Bac_MI^sCD40L重組載體基因；圖8表示重組桿狀病毒PCR鑒定電泳圖其中，I-DNA標準Marker, 2-Bac_PCD40L 重組桿狀病毒，3-Bac-LZsCD40L 重組重組桿狀病毒，4-BaC-MI^Sra40L重組桿狀病毒，5-空載體重組桿狀病毒；圖9重組桿狀病毒表達蛋白SDS-PAGE電泳圖 其中，1-蛋白質標準Marker，2_PCD40L重組桿狀病毒表達蛋白，3-Us⑶40L重組重組桿狀病毒表達蛋白，4-MLZsCD40L重組桿狀病毒表達蛋白，5-為空載體重組桿狀病毒表達蛋白；圖10表示重組桿狀病毒表達蛋白WesternBlot鑒定其中，1-為蛋白質標準預染Marker，2_MI^Sra40L重組桿狀病毒表達蛋白， 3-Lhra40L重組桿狀病毒表達蛋白，4-p⑶40L重組桿狀病毒表達蛋白。
具體實施例方式實施例1豬CD40L目的基因的克隆與密碼子優化(1)豬⑶40L目的基因的克隆本發明構建的豬⑶40L表達體系，以NCBI核酸數據庫收錄、編號為AB040443的 ⑶40L為引物設計的模板進行引物設計P1、P2 Pl:actagtgcaccgccgcctggataaP2 :aagcttttacagcttcagcaggccgaagc分離獲得健康豬外周血淋巴細胞，以含有白介素2(IL_2)、體積濃度為10%小牛血清的RPMI1640培養液培養3d后，以終濃度10ug/ml的ConA刺激培養IOh后提取總RNA。 通過RT-PCR方法擴增豬CD40L基因以P2為引物，以總RNA為模板，經反轉錄反應獲得cDNA。反轉錄過程如下，將下列試劑加入無RNA酶的離心管中總RNA模板4 μ L、dNTPs (2. 5mM) 1 μ L、P2弓丨物1 μ L、 H2O 7111^，將上述離心管651加熱5min后迅速置冰盒上冷卻2min，低轉速離心后加入 5 X buffer 4 μ L、RNA 酶抑制劑 QOIU/μ 1) 1 μ L、0. IM DDT 1 μ L、M-MLV 反轉錄酶 1 μ L，使總體積為20 μ L。將上述組分混合后，于37°C溫浴50min后，72°C放置15min滅活M-MLV反轉錄酶，立即置冰上冷卻，至此就獲得了 cDNA，置于_20°C保存備用。豬⑶40L基因的獲得PCR擴增反應體系如下cDNA(反轉錄反應的產物)5yL、 MgCl2(25mM)3y L,dNTPs(2. 5mM) 4 μ LUO XEx PCR buffer 5μ L.Ex Taq酶O. 5 μ L、P11 μ L、 Ρ21 μ L，用ddH2030. 5 μ L補加至總體積50 μ L。將上述反應體系混勻后進行PCR擴增，反應的參數為94°C預變性5min ;PCR循環為-MV lmin，51°C退火lmin，72°C lmin，共；35個循環；72°C延伸lOmin。全部反應結束后，取5μ L PCR產物，用1. O %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增結果，如圖1所示，豬⑶40L基因大小約為786bp。使用TaKaRa公司的連接試劑盒將純化的PCR產物與pMD18T載體連接，具體操作依照試劑盒說明書，反應體系如下純化的PCR產物4. 5 μ L、pMD18-T載體0. 5 μ L、 solution I 5. 0 μ L，總體積為10.0 μ L。瞬時離心混勻，置于16°C連接過夜(連接作用時間為1 左右)；連接產物直接用于轉化大腸桿菌Dffia感受態細胞。挑取轉化單菌落接種 LB培養液，37°C搖蕩培養過夜。按《分子克隆實驗指南》上的堿裂解法提取上述轉化后的大腸桿菌Dffia中的質粒，用限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切，酶切反應體系為30ul，具體組分如下重組質粒 5yL、dd H2O 20 μ L、10XK Buffer 3 μ L、BamH I 1 μ L、Hind III 1 μ L，總體系為 30 μ L。瞬時離心混勻后37°C酶切反應4h，取10 μ L酶切產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的重組質粒命名為PMD-CD40L。鑒定正確的陽性菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測得的基因序列如SEQ ID Ν0:1所示，此序列即為豬CD40L基因序列。(2)豬CD40L基因的優化密碼子優化的豬CD40L基因根據大腸桿菌和昆蟲細胞密碼子使用偏好性，使用 Mac Vector 7. 2軟件分析豬⑶40L基因(SEQ ID NO :1)，找出其使用密碼子偏好與大腸桿菌及昆蟲細胞密碼子使用偏好不同的密碼子位點。在不改變氨基酸序列的前提下，選擇大腸桿菌和昆蟲細胞使用頻率均較高的密碼子。利用TakaRa MutanBEST Kit進行多次定點突變操作，操作步驟依照試劑盒說明書進行，得到密碼子優化后的豬CD40L基因命名為PCD40L。將POT40L基因與pMD18-T載體連接，轉入大腸桿菌Dffia中，酶切結果如圖2所示，DNA序列大小約為786bp，測得的序列如SEQ ID NO 2所示，獲得的載體質粒命名為 pMD-pCD40L。實施例1中所用到的試劑分別購自ExTaq DNA聚合酶、dNIPs、T4DNA連接酶、DNA Marker、DNA純化試劑盒、限制性核酸內切酶BamH I和Hind III購自大連寶生物公司；淋巴細胞分離液、飽和平衡酚(PH8. 0)，購自上海生物工程有限公司；酵母提取物、蛋白胨購自 OXOID公司；RPMI1640培養液購自普飛生物公司；Trizol試劑購自hvitrigen公司；其余試劑均為進口或國產分析純。實施例2兔抗豬CD40L多克隆抗體的制備(一)豬⑶40L目的基因原核表達1. pET-PCD40L表達載體的構建以質粒小量提取試劑盒分別提取PMD-P⑶40L載體質粒、pET32a表達載體質粒， 用限制性內切酶BamH I，Hind III對PMD-P⑶40L質粒和空的pET3h(+)載體分別進行雙酶切，酶切反應體系為30ul，具體組分如下質粒5yL、ddH20 20 μ LUOXK Buffer 3 μ L、 BamH I 1 μ L, Hind IIIlyL0酶切后進行瓊脂糖電泳分離目的基因片段。膠回收試劑盒分別回收PCD40L目的片段、pET32a質粒片段，DNA T4連接酶連接反應，構建pET_PCD40L重組載體。連接產物轉入宿主菌大腸桿菌BL21 取連接產物IOul轉化感受態BL21100ul，輕輕混勻內容物，冰浴30min ；42°C熱休克90s ；立刻冰浴3min，加入800ul無抗生素的LB培養液37°C振蕩45min，用無菌玻璃涂布器均勻涂布菌液于整個含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37°C倒置培養10-14h。2. pET-PCD40L重組表達載體的鑒定純化挑取步驟1培養后的白色單菌落接種于^ilLB液體培養液中，37°C振蕩14h。質粒小量提取試劑盒提取質粒PET-PCD40L，進行雙酶切鑒定(酶切體系同上)并進行瓊脂糖電泳。電泳圖如圖3所示，證明pET-P⑶40L表達載體構建成功。獲得的菌命名為⑶40L/ BL21。3.豬⑶40L分子的誘導表達將新鮮CD40L/BL21菌液接種于LB培養液(含氨芐青霉素lOOug/ml)，搖菌至OD 值約0. 6，加入終濃度為Im mol的IPTG誘導，于誘導后2、3、4、5、Mi分別取出Iml菌液檢測目的蛋白表達水平。結果如圖4所示，在誘導后他表達量最高。將新鮮⑶40L/BL21菌液接種于LB培養液搖菌至OD值約0. 6，分別加入終濃度為 0. lmM、0. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、l. OmM的IPTG，誘導后Mi收獲菌液檢測目的蛋白表達水平。結果如圖5所示，不同IPTG誘導濃度表達量相差不大，故選用0. ImM的IPTG誘導。將新鮮⑶40L/BL21菌液接種于500ml的LB培養液，菌體濃度達OD值0. 6后，以終濃度為0. ImM的IPTG誘導表達Mi收獲菌液。12，OOOrpm低溫離心收獲菌體，以Binding buffer重懸，反復凍融3次后超聲破碎。高速離心，收獲上清液及沉淀，分別取少量做 SDS-PAGE，結果細胞超聲裂解后的上清液中無目的蛋白，而沉淀即包涵體中有目的蛋白存在，見圖4。將沉淀洗滌三次后溶于8M尿素中。經鎳柱親和層析純化得到目的蛋白，見圖 4。
( 二 )免疫獲得兔抗豬CD40L多克隆抗體選擇體重為2. 5-3. Okg的家兔兩只，采用本實施例中步驟(一)純化獲得的目的蛋白為免疫原，每次按200mg純化的目的蛋白/只，免疫家兔。免疫前耳靜脈采血取陰性血清。基礎免疫無菌注射器吸入4mL (含400mg目的蛋白)免疫原及等量體積(細1)的完全弗氏佐劑于IOml離心管中，抽吸處理使之形成粘稠乳劑。4°C過夜乳化液不分層即符合免疫要求。家兔足墊部皮下免疫。4周后200mg免疫原/只(目的蛋白與不完全弗氏佐劑的體積比為1 1)乳化液進行加強免疫，6周后同等劑量再次免疫。最后一次免疫兩周后心臟采血，制備兔抗豬CD40L血清(即陽性血清)，其中含有兔抗豬CD40L多克隆抗體。通過間接ELISA方法證明家兔產生高水平兔抗豬⑶40L多克隆抗體，抗體水平達到1 10000 以上，見表1所示。表1間接ELISA法檢測兔免疫血清抗體效價結果
權利要求
1.一種密碼子優化的豬⑶40L基因，其特征在于包括SEQ ID NO :3所示的序列。
2.根據權利要求1所述密碼子優化的豬CD40L基因，其特征在于其序列如SEQID NO 2所示。
3.根據權利要求1所述密碼子優化的豬CD40L基因，其特征在于其序列如SEQID NO 4所示。
4.根據權利要求1所述密碼子優化的豬CD40L基因，其特征在于其序列如SEQID NO 5所示。
5.一種表達權利要求2或3或4所述基因編碼的豬CD40L蛋白的重組桿狀病毒的制備方法(1)將所述基因與質粒pFastDual相連，構建重組質粒；(2)將所述重組質粒轉化入DHlOBac，通過藍白斑篩選獲得卡那霉素、四環素、慶大霉素抗性的重組DHlOBac ；(3)將所述重組DHlOBac轉染sf_9細胞獲得重組桿狀病毒。
6.根據權利要求5所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于所述重組桿狀病毒表達的豬CD40L蛋白經SDS-PAGE電泳，圖譜上出現分子量約為^kD的蛋白jS^festern-blot 試驗，顯示在^kD左右出現能夠與兔抗豬CD40L多克隆抗體結合的特異性條帶。
全文摘要
本發明涉及密碼子優化的豬CD40L基因，該基因符合昆蟲細胞密碼子偏嗜性，適合在桿狀病毒系統中進行表達，表達出的豬CD40L分子生物活性高，能夠增強機體的免疫應答能力。本發明還提供所述基因編碼的豬CD40L蛋白的重組桿狀病毒的制備方法。
文檔編號C12N15/12GK102154306SQ20111002928
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月27日 優先權日2011年1月27日
發明者侯繼波, 薛剛, 鄭其升 申請人:國家獸用生物制品工程技術研究中心