專利名稱：一種快速提取血液總核糖核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速提取血液總核糖核酸的方法，屬于核酸純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
外周血在人和動(dòng)物體內(nèi)免疫反應(yīng)及代謝中發(fā)揮著重要作用，作為一種特殊的組織由于其易獲得性，在基礎(chǔ)和臨床研究中具有很重要的地位。外周血可作為造血系統(tǒng)疾病研究中的分子標(biāo)志以及用于體外診斷系統(tǒng)的開發(fā)，還可用于血液系統(tǒng)外眾多系統(tǒng)疾病的分子監(jiān)測(cè)。其中，有效提取外周血核糖核酸(以下簡(jiǎn)稱RNA)過(guò)程中最重要的一步。但由于血液本身的易凝固性，以及血液內(nèi)多種細(xì)胞的復(fù)雜性，以及其不像實(shí)體組織那樣可以凍存后再提取RNA，使得血液高質(zhì)量的RNA的提取非常艱難，尤其應(yīng)用基因芯片對(duì)之進(jìn)行全基因表達(dá)譜掃描時(shí)，對(duì)RNA的質(zhì)量和數(shù)量要求就更為嚴(yán)格。從血液中提取RNA面臨的最大難題之一是RNA非常不穩(wěn)定研究表明在采血后的短短幾個(gè)小時(shí)內(nèi)RNA即迅速且顯著降解，另外部分RNA在采血后受到誘導(dǎo)，表達(dá)增加。這種 RNA降解和基因的體外誘導(dǎo)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致在分析體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄本豐度時(shí)出錯(cuò)，甚至低豐度的信息丟失。而傳統(tǒng)的離心柱法提取血液RNA需要先從全血中分離出白細(xì)胞，并且需要過(guò)濾步驟后才能開始和吸附柱結(jié)合。在與吸附柱結(jié)合前的步驟繁瑣，并且需要40分鐘以上。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種快速提取血液總核糖核酸的方法，采用一種新的快速紅細(xì)胞裂解液使紅細(xì)胞膜裂解和血漿分散，并且通過(guò)十六烷基三甲基硫酸銨成分能立刻和 RNA形成復(fù)合體沉淀，以保證核糖核酸的完整性，并使提取過(guò)程高效、快速。本發(fā)明提出的快速提取血液總核糖核酸的方法，包括以下步驟(1)向100 400微升全血中加入快速紅細(xì)胞裂解液，加入的體積比為全血紅細(xì)胞裂解液=1 5，顛倒混勻8 10次，得到混合物；(2)對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為7300轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為3分鐘，取出離心分離的沉淀物；(3)在上述沉淀物中加入240微升懸浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混勻，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，550C下放置10分鐘，顛倒混勻，得到溶液；(4)在上述溶液中加入240微升無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入硅膜吸附柱中，進(jìn)行吸附離心，離心吸附的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心吸附時(shí)間為1分鐘，倒去廢液；(5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第一次去蛋白離心， 去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入活性單位為0. 375Kunitz的脫氧核糖核酸酶溶液80微升，室溫下放置15分鐘后，再加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第二次去蛋白離心，去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；
(7)向步驟(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室溫下靜置2分鐘，進(jìn)行脫鹽離心，脫鹽離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，脫鹽離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；重復(fù)該步驟一次； (8)對(duì)步驟(7)的硅膜吸附柱進(jìn)行干燥離心，干燥離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 干燥離心時(shí)間為2分鐘，將吸附柱置于室溫下2 5分鐘，去除吸附材料中的漂洗液；(9)在步驟(8)的硅膜吸附柱中加入30 50微升無(wú)核糖核酸酶的水，室溫下放置 2分鐘后，進(jìn)行洗脫離心，洗脫離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，洗脫離心時(shí)間為2分鐘，得到核糖核酸溶液。上述方法中，所述的快速紅細(xì)胞裂解液的各組分的質(zhì)量為氯化銨60 100克碳酸氫鉀15 20克乙二胺四乙酸四鈉6 8克十六烷基三甲基硫酸銨5 10克將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，用氫氧化鈉溶液調(diào)混合液的 PH值至7. 2 7. 4，并使混合液體積為1000毫升。上述方法中，所述的懸浮液的配方為酒石酸鈉11. 5 17. 25克鹽酸胍573 764克乙基苯基聚乙二醇(NP40) 5 10毫升將上述各組分量取后混合，加去離子水，并使混合液體積為1000毫升本發(fā)明提出的快速提取血液總核糖核酸的方法，其優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明方法使用了一種新的快速紅細(xì)胞裂解液，因此使血液總核糖核酸的提取過(guò)程具有高效、快速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn)，可以直接從全血中分離純化總核糖核酸，無(wú)需先進(jìn)行白細(xì)胞的分離，例如本發(fā)明方法的實(shí)施例2中從100微升小鼠全血中提取總核糖核酸只需25 分鐘。2、使用本發(fā)明方法純化的總核糖核酸完整性好，純度高，可用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real Time RT-PCR)、芯片分析、核糖核酸印記雜交(Northern blot)、點(diǎn)雜交(Dot blot)、體外翻譯、核糖核酸酶保護(hù)分析和分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。
圖1是本發(fā)明方法的實(shí)施例1，從400微升人全血中提取總核糖核酸的電泳檢測(cè)圖。其中，泳道1 脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(Markerlll)。泳道2 使用本發(fā)明方法純化的總核糖核酸。圖2是本發(fā)明方法的實(shí)施例2，從100微升小鼠全血中提取總核糖核酸的電泳檢測(cè)圖。其中，泳道1 脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(Markerlll)。泳道2 使用本發(fā)明方法純化的總核糖核酸。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提出的快速提取血液總核糖核酸的方法，包括以下步驟(1)向100 400微升全血中加入快速紅細(xì)胞裂解液，加入的體積比為全血紅細(xì)胞裂解液=1 5，顛倒混勻8 10次，得到混合物；(2)對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為7300轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為3分鐘，取出離心分離的沉淀物；(3)在上述沉淀物中加入240微升懸浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混勻，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，550C下放置10分鐘，顛倒混勻，得到溶液；(4)在上述溶液中加入240微升無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入硅膜吸附柱中，進(jìn)行吸附離心，離心吸附的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心吸附時(shí)間為1分鐘，倒去廢液；(5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第一次去蛋白離心， 去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入活性單位為0. 375Kunitz的脫氧核糖核酸酶溶液80微升，室溫下放置15分鐘后，再加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第二次去蛋白離心，去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；(7)向步驟(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室溫下靜置2分鐘，進(jìn)行脫鹽離心，脫鹽離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，脫鹽離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；重復(fù)該步驟一次；(8)對(duì)步驟(7)的硅膜吸附柱進(jìn)行干燥離心，干燥離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 干燥離心時(shí)間為2分鐘，將吸附柱置于室溫下2 5分鐘，去除吸附材料中的漂洗液；(9)在步驟(8)的硅膜吸附柱中加入30 50微升無(wú)核糖核酸酶的水，室溫下放置 2分鐘后，進(jìn)行洗脫離心，洗脫離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，洗脫離心時(shí)間為2分鐘，得到核糖核酸溶液。上述方法中，所述的快速紅細(xì)胞裂解液的各組分的質(zhì)量為氯化銨60 100克碳酸氫鉀15 20克乙二胺四乙酸四鈉6 8克十六烷基三甲基硫酸銨 5 10克將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，用氫氧化鈉溶液調(diào)混合液的 PH值至7. 2 7. 4，并使混合液體積為1000毫升。上述方法中，所述的懸浮液的配方為酒石酸鈉11. 5 17. 25克鹽酸胍573 764克乙基苯基聚乙二醇(NP40) 5 10毫升將上述各組分量取后混合，加去離子水，并使混合液體積為1000毫升。以下介紹本發(fā)明方法的實(shí)施例。實(shí)施例1 從人的全血中提取總RNA。
(1)向400微升人全血中加入快速紅細(xì)胞裂解液，加入的體積比為全血紅細(xì)胞裂解液=1 5，顛倒混勻8 10次，得到混合物。其中的紅細(xì)胞裂解液，其制備方法是將氯化銨65克、碳酸氫鉀18克、乙二胺四乙酸四鈉6. 5g和十六烷基三甲基硫酸銨9克混合， 加去離子水，得到混合液，用氫氧化鈉溶液調(diào)混合液的PH值至7. 3，并使混合液體積為1000毫升。
(2)對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為7300轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為10分鐘，取出離心分離的沉淀物。(3)在上述沉淀物中加入240微升懸浮液10毫升將上述各組分量取后混合，力口去離子水，并使混合液體積為1000毫升)，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混勻，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，55°C下放置10分鐘，顛倒混勻，得到溶液。其中的懸浮液，其制備方法是將酒石酸鈉12克、鹽酸胍573克和乙基苯基聚乙二醇 (NP40) 10毫升混合，加去離子水，并使混合液體積為1000毫升。(4)在上述溶液中加入240微升無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入硅膜吸附柱中，進(jìn)行吸附離心，離心吸附的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心吸附時(shí)間為1分鐘，倒去廢液。(5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第一次去蛋白離心， 去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液。(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入活性單位為0. 375Kunitz的脫氧核糖核酸酶溶液80微升，室溫下放置15分鐘后，再加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第二次去蛋白離心，去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液。(7)向步驟(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室溫下靜置2分鐘，進(jìn)行脫鹽離心，脫鹽離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，脫鹽離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；重復(fù)該步驟一次。(8)對(duì)步驟(7)的硅膜吸附柱進(jìn)行干燥離心，干燥離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 干燥離心時(shí)間為2分鐘，將吸附柱置于室溫下2 5分鐘，去除吸附材料中的漂洗液；(9)在步驟(8)的硅膜吸附柱中加入30 50微升無(wú)核糖核酸酶的水，室溫下放置 2分鐘后，進(jìn)行洗脫離心，洗脫離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，洗脫離心時(shí)間為2分鐘，得到核糖核酸溶液。圖1所示是實(shí)施例1中從400微升人全血中提取總核糖核酸的電泳檢測(cè)圖，圖中泳道1 脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(MarkerIII)，泳道2 使用本發(fā)明方法純化的總核糖核酸。實(shí)施例2 從小鼠的全血中提取總RNA。(1)向100微升小鼠全血中加入快速紅細(xì)胞裂解液，加入的體積比為全血紅細(xì)胞裂解液=1 5，顛倒混勻8 10次，得到混合物。其中的紅細(xì)胞裂解液，其制備方法是 將氯化銨65克、碳酸氫鉀18克、乙二胺四乙酸四鈉6. 5g和十六烷基三甲基硫酸銨9克混合，加去離子水，得到混合液，用氫氧化鈉溶液調(diào)混合液的PH值至7. 3，并使混合液體積為 1000毫升。(2)對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為7300轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為3分鐘，取出離心分離的沉淀物；(3)在上述沉淀物中加入240微升懸浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混勻，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，55°C下放置10分鐘，顛倒混勻， 得到溶液。其中懸浮液的制備方法是酒石酸鈉12克、鹽酸胍573克和乙基苯基聚乙二醇 (NP40) 10毫升混合，加去離子水，并使混合液體積為1000毫升。(4)在上述溶液中加入240微升無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入硅膜吸附柱中，進(jìn)行吸附離心，離心吸附的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心吸附時(shí)間為1分鐘，倒去廢液。(5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第一次去蛋白離心， 去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液。(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入活性單位為0. 375Kunitz的脫氧核糖核酸酶溶液80微升，室溫下放置15分鐘后，再加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第二次去蛋白離心，去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液。(7)向步驟(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室溫下靜置2分鐘，進(jìn)行脫鹽離心，脫鹽離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，脫鹽離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；重復(fù)該步驟一次。(8)對(duì)步驟(7)的硅膜吸附柱進(jìn)行干燥離心，干燥離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 干燥離心時(shí)間為2分鐘，將吸附柱置于室溫下2 5分鐘，去除吸附材料中的漂洗液；(9)在步驟(8)的硅膜吸附柱中加入30 50微升無(wú)核糖核酸酶的水，室溫下放置 2分鐘后，進(jìn)行洗脫離心，洗脫離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，洗脫離心時(shí)間為2分鐘，得到核糖核酸溶液。圖2所示是實(shí)施例2中從100微升小鼠全血中提取總核糖核酸的電泳檢測(cè)圖，其中泳道1 脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(MarkerIII)，泳道2 使用本發(fā)明方法純化的總核糖核酸。本發(fā)明方法的上述實(shí)施例中，所用的裂解液、硅膜吸附柱、脫氧核糖核酸酶溶液、 去蛋白液、漂洗液和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker III)等均由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種快速提取血液總核糖核酸的方法，其特征在于該方法包括以下各步驟(1)向100 400微升全血中加入快速紅細(xì)胞裂解液，加入的體積比為全血紅細(xì)胞裂解液=1 5，顛倒混勻8 10次，得到混合物；(2)對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為7300轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為3 分鐘，取出離心分離的沉淀物；(3)在上述沉淀物中加入MO微升懸浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液， 混勻，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，55°C下放置10分鐘，顛倒混勻，得到溶液；(4)在上述溶液中加入240微升無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入硅膜吸附柱中，進(jìn)行吸附離心， 離心吸附的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心吸附時(shí)間為1分鐘，倒去廢液；(5)向步驟的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第一次去蛋白離心，去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入活性單位為0.375Kunitz的脫氧核糖核酸酶溶液 80微升，室溫下放置15分鐘后，再加入350微升去蛋白液，進(jìn)行第二次去蛋白離心，去蛋白離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，去蛋白離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；(7)向步驟(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室溫下靜置2分鐘，進(jìn)行脫鹽離心，脫鹽離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，脫鹽離心時(shí)間為15秒，倒去廢液；重復(fù)該步驟一次；(8)對(duì)步驟(7)的硅膜吸附柱進(jìn)行干燥離心，干燥離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，干燥離心時(shí)間為2分鐘，將吸附柱置于室溫下2 5分鐘，去除吸附材料中的漂洗液；(9)在步驟(8)的硅膜吸附柱中加入30 50微升無(wú)核糖核酸酶的水，室溫下放置2分鐘后，進(jìn)行洗脫離心，洗脫離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，洗脫離心時(shí)間為2分鐘，得到核糖核酸溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的快速紅細(xì)胞裂解液的各組分的質(zhì)量為氯化銨60 100克碳酸氫鉀 15 20克乙二胺四乙酸四鈉6 8克十六烷基三甲基硫酸銨 5 10克將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，用氫氧化鈉溶液調(diào)混合液的PH 值至7. 2 7. 4，并使混合液體積為1000毫升。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的懸浮液的配方為酒石酸鈉11. 5 17. 25克鹽酸胍573 764克乙基苯基聚乙二醇 5 10毫升將上述各組分量取后混合，加去離子水，并使混合液體積為1000毫升。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速提取血液總核糖核酸的方法，屬于核酸純化領(lǐng)域。首先向全血中加入快速紅細(xì)胞裂解液，對(duì)混合物進(jìn)行離心分離，取出離心分離的沉淀物，在其中加入懸浮液，再依次加入裂解液和蛋白酶K溶液，混勻后加入無(wú)水乙醇，再混勻后轉(zhuǎn)入硅膜吸附柱中，進(jìn)行吸附離心，加入去蛋白液和脫氧核糖核酸酶溶液，進(jìn)行兩次去蛋白離心，加入漂洗液進(jìn)行脫鹽離心，最后干燥離心后，加入無(wú)核糖核酸酶的水洗脫離心，得到核糖核酸溶液。本發(fā)明方法具有高效、快速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn)，純化的RNA可用于芯片分析、體外翻譯和分子克隆等等多種下游實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102154264SQ20111002755
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者俞萍, 孫克非, 李曉晨, 韓典霖 申請(qǐng)人:天根生化科技(北京)有限公司