專利名稱：羊外周血淋巴細(xì)胞的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的分離方法，具體涉及羊外周血淋巴細(xì)胞的分離方法。
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞是產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫，T、B淋巴細(xì)胞是機(jī)體特異性免疫應(yīng)答必不可少的免疫活性細(xì)胞，對兩者功能及活化機(jī)制等方面的研究一直是免疫學(xué)研究的熱點，而制備高活性和高純度的T、B淋巴細(xì)胞是進(jìn)行這些研究的先決條件。密度梯度離心分離不同體積大小、不同質(zhì)量的細(xì)胞，使得不同類型的細(xì)胞得以分離和純化，通過體外擴(kuò)增、工程操作后應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)基因、疾病診斷、功能基因組學(xué)研究和細(xì)胞治療等領(lǐng)域。淋巴細(xì)胞分離液就是基于密度梯度離心原理設(shè)計的淋巴細(xì)胞分離試劑，利用淋巴細(xì)胞分離液能夠獲得高純度的淋巴細(xì)胞。但是不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，這極大地限制了淋巴細(xì)胞分離液的通用性。根據(jù)文獻(xiàn)報道，針對羊的淋巴細(xì)胞分離液和其淋巴細(xì)胞分離方法尚未建立起來。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠獲得高存活率的羊外周血淋巴細(xì)胞分離方法。此外，此方法能夠得到良好的分離效果，利于淋巴細(xì)胞的收集。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種羊淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于包括如下步驟a.準(zhǔn)備有抗凝劑的注射器，從羊頸靜脈中采取靜脈血；b.用等體積的Hank’ s液稀釋外周血，后混勻；c.將人淋巴細(xì)胞分離液以0. 6-1. OmL/管的量分別置于容器中；d.吸取稀釋血液l_3mL，沿容器壁緩緩的疊加到界面上，將容器放入離心機(jī)；e.使容器在離心力作用下，其內(nèi)部的溶液形成不同層次的區(qū)帶，使得容器中由下至上分別為紅細(xì)胞層、分離液層、淋巴細(xì)胞層、血漿層；f.吸取淋巴細(xì)胞層。在本發(fā)明的一個實施方式中，上述c步驟還包括將試管放入離心機(jī)中進(jìn)行離心。在本發(fā)明的一個實施方式中，采血方式為靜脈采血。在本發(fā)明的一個實施方式中，吸出淋巴細(xì)胞層的方式為使用移液器吸取。在本發(fā)明的一個實施方式中，上述離心機(jī)轉(zhuǎn)速為2000-3000rpm.在本發(fā)明的一個實施方式中，上述離心機(jī)的離心時間為25-30min.在本發(fā)明的一個實施方式中，還包括用Hank’ s液洗淋巴細(xì)胞層2_3次。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的羊為綿羊，進(jìn)一步優(yōu)選為卡拉庫爾羊。
圖1羊淋巴細(xì)胞的分離效果照片；
圖2羊淋巴細(xì)胞吉姆薩瑞氏染色照片(10X100)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1綿羊外周血淋巴細(xì)胞的分離準(zhǔn)備有抗凝劑的注射器，從卡拉庫爾羊頸靜脈中采取外周血，每次實驗均采1Oml 卡拉庫爾羊血液，添加1ml (3% 5% )枸櫞酸鈉溶液抗凝劑。用等體積的Hank’ s液稀釋混勻，取人淋巴細(xì)胞分離液以0. SmL/管的量分別置于容器中，再用移液槍吸取稀釋血液2mL，沿容器壁緩緩地疊加到界面上，注意不要破壞分離液界面，將試管放入離心機(jī)；離心機(jī)轉(zhuǎn)速為2000-3000rpm，離心時間為25-30min，使容器在離心力作用下，其內(nèi)部的溶液形成不同層次的區(qū)帶，使得容器中由下至上分別為紅細(xì)胞層、 分離液層、淋巴細(xì)胞層、血漿層(參見說明書附圖1)；吸取淋巴細(xì)胞層后，用Hank’ s液洗 2-3次后得到較純的淋巴細(xì)胞。實施例2淋巴細(xì)胞的檢測將分離培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞取少量按常規(guī)方法進(jìn)行染色，觀察其純度。取一滴細(xì)胞懸液滴在計數(shù)板上，加0. 2%臺盼藍(lán)溶液一滴充分混勻，3-5min內(nèi)在顯微鏡照相。細(xì)胞活力檢測，死的細(xì)胞可被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，計數(shù)200個淋巴細(xì)胞， 計算出活細(xì)胞的百分率，按公式活細(xì)胞百分率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)X 100%。計數(shù)后得到的淋巴細(xì)胞團(tuán)在無菌的RPMI1640培養(yǎng)液中按照1. OX 107個/mL的密度進(jìn)行重懸，于37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中以4h、6h、》i、iai的不同時間段培養(yǎng)，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計算出活細(xì)胞百分率分別為93. 1%,92. 4%,91. 5%和90. 6%。由此可見，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠分離出較純的淋巴細(xì)胞，且保證了淋巴細(xì)胞的成活率，極大地提高了綿羊淋巴細(xì)胞分離實驗的效率。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種羊淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于包括如下步驟a.準(zhǔn)備有抗凝劑的注射器，從羊頸靜脈中采取外周血；b.用等體積的Hank’s液稀釋外周血，后混勻；c.將人淋巴細(xì)胞分離液以0.6-1. OmL/管的量分別置于容器中；d.吸取稀釋血液l_3mL，沿管壁緩緩的疊加到界面上，將容器放入離心機(jī)；e.使容器在離心力作用下，其內(nèi)部的溶液形成不同層次的區(qū)帶，使得容器中由下至上分別為紅細(xì)胞層、分離液層、淋巴細(xì)胞層、血漿層；f.吸取淋巴細(xì)胞層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于所述采血為靜脈采血。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于所述吸取淋巴細(xì)胞層的方式為使用移液器吸取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于所述的步驟d 中離心機(jī)轉(zhuǎn)速為2000-3000rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于所述的步驟d 中離心時間為25-30min.
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于還包括用 Hank’ s液洗淋巴細(xì)胞層2-3次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項所述羊淋巴細(xì)胞分離方法，其中所述的羊為綿羊，進(jìn)一步優(yōu)選為卡拉庫爾羊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊淋巴細(xì)胞分離的方法，其特征在于包括如下步驟a.準(zhǔn)備有抗凝劑的注射器，從羊頸靜脈中采取外周血；b.用等體積的Hank’s液稀釋外周血，后混勻；c.將人淋巴細(xì)胞分離液以0.6-1.0mL/管的量分別置于容器中；d.吸取稀釋血液1-3mL，沿管壁緩緩的疊加到界面上，將容器放入離心機(jī)；e.使容器在離心力作用下，其內(nèi)部的溶液形成不同層次的區(qū)帶，使得容器中由下至上分別為紅細(xì)胞層、分離液層、淋巴細(xì)胞層、血漿層；f.吸取淋巴細(xì)胞層。本發(fā)明的方法能夠得到良好的分離效果，利于淋巴細(xì)胞的收集，同時，分離出來的淋巴細(xì)胞具有較高的存活率。
文檔編號C12N5/0783GK102154204SQ20111002572
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者劉書東, 左文斌, 李劍, 李蓮瑞, 潘輝, 賀艷艷 申請人:塔里木大學(xué)