專利名稱：Tt1基因在提高棉花抗逆性中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及TTl基因在提高棉花抗逆性中的用途。
背景技術：
棉花(Gossypium spp,植物界被子植物門雙子葉植物綱錦葵目錦葵科棉屬)是重要的經濟作物，在國民經濟中占有很重要的地位，是天然纖維的重要來源之一，也是優質蛋白和食用油的潛在資源。20世紀90年代以來，隨著溫室效應的不斷加劇，各類自然災害頻繁發生，災害程度逐漸提升、受災范圍日益擴大，每年給國家造成幾十億甚至上百億元的經濟損失。為應對這一嚴峻形勢，遺傳育種學家已通過各種途徑創造了多種突變材料，使得棉花種質資源庫不斷拓展，為棉花品種選育及性狀改良提供了重要的遺傳信息。同時，隨著基因工程技術的不斷發展，利用生物技術來創新棉花種質資源和培育新品種是一條非常有效的途徑，極大地推動了棉花遺傳育種的發展。與水稻等其他禾本科作物相比，棉花的轉基因研究起步較晚，但進展很快。隨著國際轉基因技術的不斷發展和轉基因生物安全性方面的相關法律法規的不斷完善，轉基因作物的大面積推廣和種植勢不可擋。到2009年，全球轉基因作物的種植面積達到了 I. 3億 hm2，全球有25個國家種植，面積是1996年的79倍。棉花也不例外，全球棉花種植面積中轉基因棉占總種植面積的1/2。轉基因棉花的廣泛種植，在遏制各類自然災害、降低勞動強度、減少環境污染、促進農田微觀和宏觀環境改善等方面顯示出重要的作用。我國自20世紀80年代末開始進行轉基因棉花的研究，已成為繼美國之后第二個自主研制轉基因棉花的國家。為我國主要農作物之一，棉花在基因工程方面的研究進展迅速，在抗蟲、抗除草劑、抗病、改善棉花纖維品質及其生態影響方面均取得了一系列重要研究成果。但由于受到技術發展的限制，優異功能基因資源比較有限，迄今已克隆的與棉花相關的基因與元件不計其數，然而具有應用價值的基因卻很少，當前主要是抗蟲類(Bar)和抗除草劑類(Bt、EPSPs)，其它如抗旱、耐鹽、抗黃萎病等基因的開發仍然存在許多不足，甚至無法從實驗室走向大田。在我國16億畝耕地中，鹽堿地有I億多畝，中低產田約10億畝。其中大部分中低產田也是由于干旱和鹽堿所致，此外還有3億畝鹽堿荒地有待開發利用；灌溉地區次生鹽潰化田地還在逐年增加。淡水資源匱乏是我國北方棉花生產的主要限制因素，更是鹽堿荒地開發利用的限制因素。干旱、鹽堿和低溫等逆境脅迫環境因素已經成為棉花生長的主要限制性因子，嚴重影響棉花的產量和種植面積。這些問題是我國棉花生產躍上新臺階，并成為生產強國必須面對和急需解決的重大命題。隨著人們對植物抗逆分子機制的深入了解，已分離出了許多與抗逆相關的功能蛋白基因和一些控制信號轉導途徑的調控基因，然而具有應用價值的基因卻很少。在轉基因研究過程中，還經常會遇到基因沉默現象，轉基因的遺傳穩定性等問題還需要做進一步的研究。由于植物的抗逆性狀是受數量性狀基因控制的，至今無法尋求到的適合多基因共轉化的轉基因體系，而同時提高植物多種抗逆性的單基因資源又極其匱乏，目前還未能獲得較為理想的綜合抗逆材料。因此加強基因組學和功能基因組學研究，加強抗鹽、旱、高、低溫等非生物逆境的轉基因棉花研究，有針對性的挖掘更多高效、低毒的功能基因用于轉基因棉的改良，培育耐鹽、耐早棉花品種，以拓寬棉花的種植區域和環境適應性，對確保我國棉花生產的長期穩定發展具有重要的戰略意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是針對棉花轉基因育種中缺乏可加強植株抗鹽、旱、高低溫等非生物逆境的基因資源，提供一種多效抗逆基因TTl在棉花抗逆改造中的應用方法，為提高棉花抵御非生物逆境的轉基因技術領域提供一種新的有效選擇。本發明解決該技術問題的技術方案是提供了 TTl基因在提高棉花抗逆性中的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(I):如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或者其簡并序列；或(2):在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。即也能提高棉花對鹽、旱、高低溫等非生物逆境的抗逆性。進一步的，上述(2)為在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加I個或幾個(10個以內)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發明同時提供了 TTl基因編碼的多肽在提高棉花抗逆性中的用途。上述用途中的TTl基因具有如下核苷酸序列(I):如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或其簡并序列；或(2):在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且能與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。進一步的，上述(2)為在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加I個或幾個(10個以內)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發明還提供了一種培育抗逆棉花的方法。該方法包括以下步驟(I):將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2):將步驟(I)中的重組載體轉入植物細胞中；(3):經篩選獲得轉化細胞,然后將轉化細胞培育成抗逆的棉花植株或其后代,所述后代包括棉花種子及棉花組織。上述方法中的TTl基因具有如下核苷酸序列(I):如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或其簡并序列；或⑵在⑴限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且能與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。進一步的，上述⑵為在⑴限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加I個或幾個(10個以內)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示，該基因來源于十字花科(Brassicaceae,也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassica napus)。上述的提高棉花的抗逆性可以為耐熱性、耐寒性、耐旱性或耐鹽性中的至少一種， 甚至可以起到減少棉花產量降低的穩產增產作用。在本發明中，“在SEQ ID NO. I中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. I所編碼的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. I同源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. I所述的序列。另外，“在SEQ ID NO. I 中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的含義還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. I核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO. I中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。在本發明中的相同功能是指提高棉花對非生物逆境的抗逆性。該術語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO. I相同功能的蛋白的SEQ ID NO. I 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為I 90個，較佳地I 60個，更佳地I 20個，最佳地I 10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為 10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。本發明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領域已知的各種載體，尤其是真核表達載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發明用上述重組載體轉化宿主植物細胞，篩選獲得轉化細胞。然后將轉化細胞培育成抗逆的棉花植株或其后代，所述后代包括棉花種子及棉花組織。本發明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。TTl基因為一種“一因多效”的基因，與植物的抗熱性、抗旱性、抗寒性、抗鹽性等抗逆性相關，通過轉基因方法將其轉入植物體內，可以提高植物的多種抗逆性，可培育出具有綜合抗逆性的植物新品系。本發明的有益效果在于本發明提供了 TTl基因在提高棉花抗逆性中的用途。TTl基因可用于制備高抗逆性的棉花轉化體，進一步培養抗逆、優質的轉基因棉花新品種。本發明的實施例中也通過實驗證明了轉入TTl的棉花對鹽、干旱、低溫、高溫均有較高的綜合抗逆性，同時也降低了外界逆境對棉花產量的影響，具有一定的穩產增產效果。
本發明培育出抗逆棉花的方法也簡便而有效，利用本發明中的轉化體系能使得 TTl基因的各項抗逆性都得到良好的發揮，具有好的應用前景，能夠拓寬棉花的種植區域和環境適應性，對確保我國棉花生產的長期穩定發展具有重要的戰略意義。
具體實施例方式下面通過實施例進一步說明而不限定本發明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如 Sambrook, Russell 的分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。下述實施例中， 所用農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用LBA4404菌株；大腸桿菌(E. coli)采用 DH5 α菌株,菌株均購自于Qiagen公司。載體ρΒΙ 121、pCAMBIA1301購自于Clontech公司。 TA克隆試劑盒pUCm-T Vector Kit, Taq Polymerase,限制性內切酶,連接酶,DNA回收純化試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司。其余化學實際均為市售分析純。下述實施例中， “SEQ ID NO :1”單獨出現時，本領域技術人員可理解其為“SEQ ID NO :1所示核苷酸序列” 的簡稱。實施例一TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6 (genebank gi :89279377)基因為誘館蛋白，根據酵母雙雜交方法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據這段篩選到的序列，通過5’RACE (見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發明所述的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示。根據SEQ ID NO. I所示核苷酸序列設計引物上游引物(SEQID NO. 3) :5，-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG_3，，下游引物(SEQID NO. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。 然后經PCR從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。對PCR產物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產物純化資料)，經測序驗證，得到SEQ ID NO. I的基因序列。實施例二 ■ 轉TTl基因棉花的制備I、目的基因過量表達重組質粒構建根據SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設計引物，上游引物(SEQID NO. 5) :5’ -CGC GGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3’，下游引物(SEQID NO. 6) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。經PCR，從油菜cDNA中擴增完整的SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列，對PCR產物純化(見Qiagen公司所公開的資料)，進行TA克隆，BamH I與Sac I酶切鑒定陽性重組克隆。陽性克隆用BamHl與Sacl酶切，膠回收，與載體pBI121連接(連接位點BamHl與 Sacl)，獲含SEQ ID NO : I的過量表達重組質粒。將含SEQ ID NO : I的過量表達重組質粒轉入農桿菌LBA4404中。2、棉花的遺傳轉化2-1、農桿菌菌液的制備挑取含SEQ ID NO 1的過量表達重組質粒的農桿菌，接種于含20mg/L鏈霉素，
650mg/L卡那霉素，40mg/L利福平的LB液體培養基中，28°C搖菌過夜后收集菌體，重懸于含 100mg/L乙酰丁香酮的MS液體培養基中至0D600 = O. 6 1，28°C搖菌I 2h。2-2、外植體的制備棉花種子用95%濃硫酸浸泡脫去表面短絨，清水沖洗掉表面硫酸后于陰涼處晾干。將得到的種子先用75%乙醇浸泡消毒30s，倒去乙醇并用無菌水沖洗I 2次，用O. I % 升汞浸泡15min，然后用無菌水洗滌5 6次。將消毒后種子放入墊有雙層濾紙并被濕潤過的無菌瓶中，于28°C 30°C條件下培養。培養2 3d后下胚軸長到I 2cm左右時，將萌發種子插入MS固體培養基中，繼續培養。約5 7d后待小苗長至8 12cm時可用于莖尖轉化。2-3、基因轉化及抗性植株的獲得將長至8 12cm的無菌小苗，用鑷子剝去一片子葉，刀片輕輕劃傷頂端分生組織后，將蘸有農桿菌的脫脂棉放到小苗莖尖處，浸染20min后將多余的菌液吸去。置于共培養基上，于22°C下培養；3d后，用含有300mg/L頭孢霉素(Cef)的大量滅菌水沖洗莖尖，用滅菌濾紙吸去多余水分后置于恢復培養基上，在28°C 30°C光照條件下培養7d ;后轉移到篩選培養基上，在相同條件下培養20 25d，然后每20d繼代I次，將篩選后成活的莖尖或不定芽轉移到根誘導培養基上，在相同條件下培養，20d后繼代I次，轉移到含有吲哚丁酸 (IBA)的根誘導培養基上進行根誘導，約20d后出現不定根。培養基配方如下MSB 培養基MS+B5 有機；共培養基MSB+3 %葡萄糖+0. lmg/L 6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0. lmg/L α -萘乙酸 (NAA) +40mg/L 乙酸丁香酮(AS) +0. 2% Phytogel, pH 5. O ；篩選培養基MSB+3% 葡萄糖 +0. lmg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+400mg/L 頭抱霉素 (Cef) +0. 2% Phytogel, pH 5. 8 ；恢復培養基MSB+3%葡萄糖+0.lmg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+400mg/L Cef+0. 2% Phytogel, pH 5. 8 ；根誘導培養基1/2MS+2%葡萄糖+0.4mg/L IBA+400mg/L Cef+0. 2% Phytogel, pH5. 8o3、轉基因植株的PCR檢測待土壤中再生植株長大后，各取葉片少量用CTAB法抽提總DNA，以提取的DNA做模板，分別進行PCR檢測上游引物(SEQID NO. 7) :5’ -ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3’ ；下游引物(SEQID NO. 8) :5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。然后1.0%瓊脂糖電泳檢測，檢測結果有目標條帶出現則代表目的基因已轉入棉花。所檢測出目的條帶的大小和預期SEQ ID NO :1大小一致，約為860bp。制得SEQ ID NO I核苷酸序列過量表達棉花植株備用。實施例三轉TTl基因棉花的耐熱性測定I、棉花幼苗的培育將蛭石高溫滅菌，加入滅菌自來水，充分拌勻，含水量約20 %，置于底部帶有孔洞的發芽盒內，鋪平壓實后，取轉TTl基因型棉花和非轉基因型棉花健壯、均勻、一致的種子均勻鋪種。每個株系做2次重復，每個重復50粒種子。置于25-28°C、光暗=12h 12h、 相對濕度約65%的培養箱內，7d后調查出苗數并進行高溫處理。2、棉花苗期高溫脅迫處理將棉花幼苗置入溫度為46°C、光暗=12h 12h、相對濕度約100%的恒溫培養箱中進行高溫脅迫處理4h，之后置于28°C、光暗=12h 12h、相對濕度約65%的培養箱內進行恢復生長，恢復6d與13d后統計幼苗成活率。3、結果統計棉花苗期經過高溫脅迫處理后恢復生長，隨著恢復生長的天數增加，其活苗率也隨之降低，恢復6d與13d后統計幼苗成活率如表I :表I恢復6d與13d后統計幼苗成活率
權利要求
1.TTl基因在提高棉花抗逆性中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(I):如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或者其簡并序列；或(2):在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.根據權利要求I或2所述的用途，其特征在于所述抗逆性為耐熱性、耐寒性、耐旱性或耐鹽性中的至少一種。
4.TTl基因編碼的多肽在提高棉花抗逆性中的用途。
5.根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(I):如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或者其簡并序列；或(2):在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。
6.根據權利要求4或5所述的用途，其特征在于所述抗逆性為耐熱性、耐寒性、耐旱性或耐鹽性中的至少一種。
7.培育抗逆棉花的方法，其特征在于包括以下步驟(1):將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2):將步驟(I)中的重組載體轉入棉花細胞中；(3):經篩選獲得轉化細胞，然后將轉化細胞培育成抗逆的棉花植株或其后代，所述后代包括棉花種子及棉花組織。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(I):如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或者其簡并序列；或(2):在(I)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. I的序列編碼功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及TT1基因在提高棉花抗逆性中的用途。本發明要解決的技術問題是為提高棉花抗逆性的轉基因技術領域提供一種新的有效選擇。本發明解決技術問題的技術方案是提供了TT1基因在提高棉花抗逆性中的用途，經實驗證明轉入了TT1基因并過表達的棉花，其抗逆性如耐熱性、耐寒性、耐旱性、耐鹽性都有了明顯的提高，同時也降低了外界逆境對棉花產量的影響，具有一定的穩產增產效果。本發明培育出抗逆、高產棉花的方法也簡便而有效，為本領域提供了新的有效選擇。
文檔編號C12N15/82GK102604961SQ20111002265
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月20日 優先權日2011年1月20日
發明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司