專利名稱：使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞的方法、試劑盒及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及領域屬于生物醫學技術領域，具體而言，本發明涉及一種使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞及自體視網膜細胞的細胞培養方法和應用。
背景技術：
隨著醫學科學的進步、診療手段的不斷提高，感染性眼病和白內障等致盲性眼病已得到有效的診治，與此同時、視網膜變性疾病的發病率和致盲率卻有上升的趨勢，成為世界范圍內的主要致盲眼病之一，目前其治療不僅是眼科學也是神經科學研究的熱點和難點。雖然近十幾年來，國內外曾有學者采用視網膜移植、基因療法、藥物、細胞因子以及人工視覺等多方面對視網膜變性疾病的治療進行嘗試，并取得了很大進展，但至今尚未能在臨床上得到推廣應用，其原因是感光細胞再生和視功能重建的問題未能得到根本解決。直到最近，近年興起的干細胞研究為治療該類疾病提供了新思路。科學家不但已經利用胚胎干細胞成功恢復視網膜變性小鼠的視力，重建該動物模型的視網膜。而且采用由人胚胎干細胞分化的異體視網膜干細胞也已經成功恢復視網膜色素變性患者的視力；但是因為長期療效和安全性問題不能臨床推廣。因此如何快速獲得大量高純度并具高度分化潛能的自體視網膜干細胞是眼科學及生物學家面臨的重大挑戰。近年來，應用基因重組技術已經證明，體細胞可以被重新編碼而逆向分化，產生被稱為誘導性自體多能干細胞(iPS干細胞)，為自體干細胞的生產技術提供了新的途經。體細胞是干細胞順向分化產生的，具有某些具體功能的子代細胞。體細胞的染色體DNA和干細胞的染色體DNA在基因結構和基因的數量上并不存在差異。體細胞和干細胞之間的最主要的差別可能只是某些功能基因處于不同的活性表達狀態。功能基因表達的差異決定了細胞的具體功能和形態的差異。我們推測，干細胞向體細胞順向分化的程序啟動后，干細胞本身的干細胞特性決定基因的開關就被關閉，隨后，干細胞就分化形成了具有某種特定功能的體細胞；換句話說，在體細胞染色體DNA序列中仍然存在視網膜干細胞特性決定基因，例如Pax6、Rx、Mitf、ChxlO，這些基因只是處于關閉或靜止狀態。利用某些物質打開體細胞DNA序列中的視網膜干細胞特性決定基因Pax6、Rx、Mitf、ChxlO等開關，這些體細胞就可能重新逆向分化而形成新的視網膜干細胞，進而分化形成自體視網膜細胞。在本項發明中，從血液單個核細胞等人的體細胞逆向分化，數周內即可產生百億數量級別的第一代自體視網膜干細胞，不僅為多種眼科疾病的治療提供了一種新的獨特的多能干細胞，而且對視網膜組織器官工程和自體視網膜干細胞生產的產業化發展提供了良好基礎
發明內容
本發明所要解決的技術問題是研發一種新的人的體細胞逆向分化調控技術，在不改變人的體細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在體外重新激活體細胞DNA序列中的視網膜干細胞特性決定基因開關，使這些體細胞重新逆向分化而形成新的視網膜干細胞和自體視網膜細胞。為了解決上述技術問題，本發明的一個目的是提供使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的方法。本發明的另一個目的是提供采用該自體視網膜干細胞產生自體視網膜細胞的方法。本發明的又一個目的是提供通過上述方法獲得的自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞，以及其在制備治療多種疾病的藥物中的應用。本發明的再一個目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多種細胞培養液以及該培養液的應用。此外，本發明還提供相應的用于制備自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞的試劑盒。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一方面，本發明提供一種使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的方法， 所述方法包括將人的體細胞在細胞培養液Dl中培養72小時，所述細胞培養液Dl為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物Ι-lOOmg/ml、Υ-276325-30 μ Μ、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 l-100ng/ml、二甲亞砜 (DMSO) 5-30 μ M ;然后換用細胞培養液D2培養9_15天，所述細胞培養液D2為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-lOOmg/ml、水蛭提取物l-100mg/ml、Y-27632 5-30 μ Μ、白細胞介素3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5-30ng/ml、Dkk-15_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ml ;再換用細胞培養液 D3 繼續培養 10-20 天，所述細胞培養液D3為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物I-IOOmg/ ml、水蛭提取物 l-100mg/ml、Y-27632 5_30μΜ、Β27 2% (ν/ν)、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5_30ng/ml、Dkk-15_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 5_30ng/ml、血管內皮生長因子5_30ng/ml、生長因子2 5-30ng/ml從而獲得植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。優選地，在5% C02和37°C條件下進行細胞培養。在上述方法中，所述人的體細胞包括但不限于人的周圍血液細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞。優選地，在將人的體細胞以細胞培養液Dl培養之前，先以
2-5X IO6的密度，在5% C02和37°C條件下培養24-48小時。優選地，先將細胞在細胞培養液Dl中培養72小時，所述細胞培養液Dl為 DMEM、并含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 (IL3) 10ng/ml、白細胞介素6 (IL6) 10ng/ml、神經生長因子10ng/ml、二甲亞砜 (DMSO) 10 μ M ;然后換用細胞培養液D2繼續培養9_15天，所述細胞培養液D2為含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素 3(IL3) (IL3)10ng/ml、白細胞介素 6(IL6)10ng/ml、神經生長因子 10ng/ml、Dkk_l IOng/ ml、Lefty-A10ng/ml的DMEM ;再換用細胞培養液D3繼續在5 % CO2和37°C條件下培養 10-20天，所述細胞培養液D3為含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ, Β272% (ν/ν)、白細胞介素 3 (IL3) 10ng/ml、白細胞介素6 (IL6) 10ng/ml、神經生長因子 10ng/ml、Dkk_l 10ng/ml、Lefty-A10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)10ng/ml、血管內皮生長因子10ng/ml、生長因子2 10ng/ml的DMEM，從而獲得植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。另一方面，本發明提供二種產生自體視網膜細胞的方法，所述方法包括采用細胞培養液D4培養上述得到的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞，培養15-20天形成視桿細胞、視錐細胞和色素上皮細胞，所述細胞培養液D4為DMEM、并含有B272 % (v/v)、Y-27632 5-30 μ Μ、神經生長因子l-100ng/ml、B型轉化生長因子 (TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml、 血管內皮生長因子-1100ng/ml、Dkk-1 l-100ng/ml、Lefty-A l-100ng/ml、RA l-100ng/ml、 牛磺酸(taurine) 5-30 μ M、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ M ;優選地，在5% CO2和37 °C條件下進行細胞培養；優選地，在得到的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞在細胞培養液D4中培養9-15天形成視桿細胞、視錐細胞和色素上皮細胞，所述細胞培養液D4為含有Y-27632 10 μ M、神經生長因子10ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 10ng/ml、胰島素 10ng/ml、血管內皮生長因子 10ng/ml、Dkk_110ng/ml、Lefty-A 10ng/ml> RA 5ng/ml、牛橫酸(taurine) 10 μ Μ、二甲亞諷(DMSO) 10 μ M 的 DMEM。采用細胞培養液D5培養上述得到的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞，培養 15-20天形成視神經節細胞，所述細胞培養液D5為DMEM、并含有B272 % (v/v)、Y-27632 5-30 μ Μ、神經生長因子l-100ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素l-100ng/ml、血管內皮生長因子I-IOOng/ ml、Dkk-1 l-100ng/ml、Lefty-Al-lOOng/ml、RA l-100ng/ml、牛橫酸(taurine) 5-30 μ Μ、 Heparin 1-100 μ g/ml、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ M ;優選地，在5% CO2和37 °C條件下進行細胞培養；優選地，在得到的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞在細胞培養液D5中培養 9-15天形成視神經節細胞，所述細胞培養液D5為DMEM、并含有B27 2% (v/v)、Y-27632 ΙΟμΜ、神經生長因子10ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 10ng/ml、胰島素10ng/ml、血管內皮生長因子10ng/ml、Dkk-1 IOng/ ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛橫酸(taurine) 10 μ M、Heparin 2yg/ml、二甲亞諷 (DMSO)10 μ Mo另一方面，本發明提供由上述方法制備的自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞。本發明還提供所述自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞的應用，優選地，本發明提供所述自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞在制備用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為視網膜、神經組織系統等細胞、組織和器官的病理損害、創傷壞死和各種退行性變性；進一步優選地，所述疾病為眼科疾病、視網膜變性疾病、視神經疾病；更優選地，所述疾病為老年黃斑變性、視網膜色素變性、視神經受損萎縮。又一方面，本發明提供用于使人的體細胞逆向分化的細胞培養液，其中所述培養液選自細胞培養液Dl、D2、D3、D4和D5，所述培養液Dl為DMEM，并含有枸杞子提取物 l-100mg/ml、菊花提取物 1-lOOmg/ml、y-27632 5-30 μ Μ、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ ml、白細胞介素 6(IL6)5-30ng/ml、神經生長因子 l-100ng/ml、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ M ；所述培養液D2為DMEM，并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-100mg/ml、水蛭提取物l-100mg/ml、Y-27632 5-30 μ Μ、白細胞介素3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5_30ng/ml、Dkk-1 5_30ng/ml、Lefty-A5_30ng/ml ;所述細胞培養液D3為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-100mg/ml、水蛭提取物 l-100mg/ml、Y-27632 5-30 μ Μ, Β272% (ν/ν)、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5_30ng/ml、Dkk-1 5_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 5-30ng/ml、血管內皮生長因子5_30ng/ml、生長因子 25-30ng/ml ;所述細胞培養液 D4 為 DMEM、并含有 B272 % (v/v)、Y-27632 5-30 μ Μ、 神經生長因子l-100ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml、血管內皮生長因子 1-lOOng/ml、Dkk-I l-100ng/ml、Lefty-A l-100ng/ml、RA l-100ng/ml、牛橫酸(taurine) 5-30 μ M、二甲亞諷 (DMSO) 5-30 μ M ;所述細胞培養液 D5 為 DMEM、并含有 Β272% (ν/ν)、Υ-27632 5-30 μ Μ、神經生長因子l-100ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素 1-lOOng/ml、血管內皮生長因子 l-100ng/ml、Dkk_lI-IOOng/ ml、Lefty-Al-lOOng/ml、RA l-100ng/ml、牛橫酸(taurine) 5-30 μ M、Heparin 1-100 μ g/ ml、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ Μ。此外，本發明提供上述細胞培養液D1、D2和D3在培養人的體細胞使之逆向分化產生自體視網膜干細胞中的應用。本發明還提供細胞培養液D1、D2、D3、D4和D5在培養人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞，進而分化產生自體視網膜細胞中的應用。再一方面，本發明提供用于制備自體視網膜干細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括上述細胞培養液D1、D2和D3 ;優選地,所述試劑盒進一步包括人的體細胞；所述體細胞包括但不限于周圍血液細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞。本發明還提供用于制備自體視網膜細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括上述細胞培養液Dl、D2、D3、D4和D5 ;優選地，所述試劑盒進一步包括人的體細胞；所述體細胞包括但不限于周圍血液細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞。本發明還提供所述試劑盒在制備自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞以及制備用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為視網膜、神經組織系統等細胞、組織和器官的病理損害、創傷壞死和各種退行性變性；進一步優選地，所述疾病為眼科疾病、視網膜變性疾病、視神經疾病；更優選地，所述疾病為老年黃斑變性、視網膜色素變性、糖尿病視網膜變性、視神經受損萎縮。以下是本發明的詳細描述為完成本發明涉及到以下技術問題(I)選用什么樣的人的體細胞作為逆向分化生產人自體視網膜干細胞的原料細胞；(2)怎樣處理和培養各種原料細胞；(3)怎樣使原料細胞逆向分化生產植物和蛋白誘導性人自體視網膜干細胞；
(4)怎樣檢測生產的植物和蛋白誘導性人自體視網膜干細胞；(5)怎樣從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生自體視網膜細胞；(6)怎樣檢測生產的自體視網膜細胞。因此，本發明的發明目的可以通過下述方法得以實現選用的人的原料體細胞包括但不限于人的臍帶血細胞、胎盤細胞、可商購獲得的非永生化和永生化的人的各種體細胞株、常規血庫保存的血液和白細胞懸液、新鮮分離制備的人的皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞，可以是周圍血液細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、脂肪細胞。選用的原料體細胞的培養包括以2-5 X IO6的密度，用相應的細胞培養液在5% C02和37 °C條件下培養24-48小時；使原料細胞逆向分化生產人自體視網膜干細胞包括用相應的原料體細胞用相應的細胞培養液在5% CO2和37 °C條件下培養24-48小時后，換用細胞培養液Dl (DMEM、 枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、Υ-27632 ΙΟμΜ、白介素_310ng/ml、白介素_610ng/ml、神經生長因子10ng/ml、DMSO 10 μ Μ)繼續在5% CO2和37°C條件下培養72 小時，然后換用細胞培養液D2(DMEM、枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、Y-2763210 μ M、白介素 3 10ng/ml、白介素 6 10ng/ml、神經生長因子 IOng/ ml、Dkk-110ng/ml、Lefty-A 10ng/ml)繼續在 5% C02 和 37°C條件下培養 9-15 天；再換用細胞培養液D3(DMEM、枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、 Υ-27632 10μΜ、Β272% (v/v)、白介素 3 10ng/ml、白介素 610ng/ml、神經生長因子 IOng/ ml、Dkk_l 10ng/ml、Lefty_A 10ng/ml、b 生長因子 10ng/ml、血管內皮生長因子 10ng/ml、生長因子2 10ng/ml)繼續在5% CO2和37°C條件下培養10-20天，形成植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。根據本發明的一個實施方案，所獲得的人自體視網膜干細胞可以通過以下方法進行檢測利用視網膜祖細胞和視神經祖細胞的特異細胞表型(Rx、ChxlO和Pax6)、色素上皮祖細胞的特異細胞表型(Mitf)、光感受器前體細胞的特異細胞表型(Crx、Nrl)等作為檢測指標，在換用細胞培養液D3繼續培養后的第3、第6、第9和第12天，分別采用RT-PCR、 細胞免疫熒光技術，觀測各種視網膜干細胞的生成速度、生成率、生成數量和純度(采用 Pax6、Rx、ChxlO、Mitif等作為檢測指標及其檢測，參考Meyer JS等人的“Modeling early retinaldevelopment with human embryonic and induced pluripotent stem cells’TNAS 2009 ; 106,16543-4. Osakada F 等人的“In vitro differentiation ofretinal cells from human pluripotent stem cells by small-moleculeinduction，，Journal of Cell Science. 2009，122，3169-3179)。根據本發明的另一個實施方案，從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生視桿細胞、視錐細胞和色素上皮細胞包括經細胞培養液D3培養形成的植物和蛋白誘導性視網膜干細胞，應用細胞培養液D4(DMEM、B27 2% (v/v)、Y-27632 10 μ Μ、神經生長因子 10ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 10ng/ml、 胰島素 10ng/ml、血管內皮生長因子 10ng/ml、Dkk-1 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ ml、牛磺酸(taurine) 10 μ M、二甲亞砜(DMSO) 10 μ Μ)繼續培養15-20天形成自體視網膜視桿細胞、視錐細胞和色素上皮細胞。
根據本發明的另一個實施方案，從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生節細胞包括經細胞培養液D3培養形成的植物和蛋白誘導性視網膜干細胞，應用細胞培養液D5 (DMEM、B27 2% (v/v)、Y-27632 10 μ Μ、神經生長因子10ng/ml、B型轉化生長因子 (TGF-β ) 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 10ng/ml、胰島素10ng/ml、血管內皮生長因子 10ng/ml、Dkk-llOng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛橫酸(taurine) 10 μ Μ、 Heparin 2 μ g/ml、二甲亞砜(DMSO)IOyM)繼續培養15-20天形成自體視網膜節細胞。根據本發明的又一個實施方案，生產的各種類型的自體視網膜細胞可以通過以下方法進行檢測采用細胞免疫熒光技術和反轉錄PCR技術檢測視網膜細胞，如視桿細胞(Rhodopsin、Recoverin)、視維細胞(Blue opsin、Red/grennopsin)、節細胞(MAth5、 Brn3b)、色素上皮細胞(RPE_65、CRALBP)特異蛋白的表達(參考Meyer JS等人的“Modeling early retinal development with humanembryonic and induced pluripotent stem cells，，PNAS 2009 ; 106,16543-4. Osakada F 等人的“Stepwise differentiation of pluripotent stem cells intoretinal cells，，Nat Protocoll 2009 ；4(6) :811-24)。根據本發明獲得的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞，可以作為器官再生再造和修復的優良的種子細胞，對視神經萎縮、損傷、老年黃斑變性、視神經外傷、視網膜病變、 脈絡膜裂傷、糖尿病性視網膜病變、視網膜挫傷、視網膜脫離等眼睛疾病具有再生再造和修復的潛能，有良好的治療應用前景；此外植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞還可應用于視網膜體外組織工程，生產自體視網膜干細胞和視網膜細胞。植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞和視網膜細胞生產工藝流程可以被嚴格地、 多次地、系統地進行流式細胞技術檢測和免疫細胞化學技術檢測，因此，作為自體種子細胞和自體再生修復細胞，本發明還具有將自體視網膜干細胞和視網膜細胞大規模產業化的可能性。與現有技術相比，本發明至少具有以下幾個優點一、本發明不同于已有的利用基因重組技術誘導體細胞逆向分化產生干細胞(iP 干細胞)，提供了一種生產自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞的新型技術方法，利用植物提取物和蛋白配方技術誘導體細胞逆向分化產生的干細胞(Plants and Proteins induced pluripotent stem cell, PPiPS干細胞)，使得細胞結果接近于自然干細胞,安全性高。具體而言，本發明通過采用人的常規的體細胞，在不改變體細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應用經過篩選優化設計的植物提取物和蛋白配方使體細胞重新逆向分化而形成自體視網膜干細胞，并進而分化成為自體視網膜細胞。技術獨創新穎， 為解決眼科類疾病治療領域目前所存在的困難提供了新的思路和途徑，并解決了人自體視網膜干細胞和視網膜細胞來源困難的問題。二、本發明的方法可以直接采用分離自患者的體細胞，使該體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞，應用此自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞避免了采用異體視網膜干細胞或異體視網膜細胞移植帶來的免疫排斥，為臨床應用提供了顯著的便利條件。三、采用本發明的方法制備的自體視網膜干細胞和視網膜細胞具有正常2倍體的染色體核型。在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射IXlO8個植物和蛋白誘導性視網膜干細胞或I X IO8個人自然胚胎干細胞，觀察接種部位有否腫瘤形成，連續觀察90天后， 發現采用本發明的植物和蛋白誘導性視網膜干細胞的試驗組10只裸鼠無一例產生腫瘤， 人自然胚胎干細胞試驗組10只裸鼠全部產生腫瘤，因此本發明的植物和蛋白誘導性視網膜干細胞和視網膜細胞具有較高的安全性。本發明還是一種在任何年齡的人個體中均可以生產自體視網膜干細胞和視網膜細胞的新技術方法，可以廣泛應用于不同年齡階層中患有相關疾病的受眾群體。四、已證明采用本發明的方法可以使200ml人周圍血液在3_4周內產生幾百億數量級別的第I代自體視網膜干細胞和視網膜細胞，生產速度快，產量達到1-1. 5X IO11 ;利用自體視網膜干細胞和視網膜細胞的特異表型作為檢測指標，植物和蛋白誘導性人自體視網膜干細胞和視網膜細胞的生產工藝流程可以被嚴格地、多次地、系統地進行流式細胞技術和免疫細胞化學技術檢測，因此，作為自體種子細胞和再生修復細胞，在再生醫學、自體組織器官工程和自體視網膜干細胞生產的產業化領域，植物和蛋白誘導性人自體干細胞可能具有良好的潛在應用前景，并具有大規模工業化和產業化生產自體視網膜干細胞和視網膜細胞的可能性。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施例，其中圖I中，I-A為原料細胞，1-B、C為視網膜干細胞；圖2-A為使用反轉錄PCR檢查顯示為植物和蛋白誘導性視網膜干細胞具有的Rx、 Pax6、Mitf、ChxlO、Six3、Six6、Sox2、Lhx2的特異mRNA ;圖2_B使用免疫熒光化學檢查顯示植物和蛋白誘導性視網膜干細胞具有Pax6、Rx、Mitf和ChxlO特異表型；圖3為使用免疫熒光化學檢查顯示植物和蛋白誘導性視錐細胞具有Blueopsin、 Red/grenn opsin 特異表型；圖4為使用免疫熒光化學檢查顯示植物和蛋白誘導性視桿細胞具有Rhodopsin、 Recoverin特異表型；圖5為使用反轉錄PCR檢查顯示為植物和蛋白誘導性視錐、視桿細胞、節細胞具有的 Blue opsin、Red/grenn opsin、Rhodopsin、Recoverin 和 MAth5 的特異 mRNA ；圖6為使用免疫熒光化學檢查顯示植物和蛋白誘導性色素上皮細胞具有的 RPE-65、CRALBP 特異表型；圖7為使用免疫熒光化學檢查顯示植物和蛋白誘導性節細胞具有的MAth5、Brn3b 特異表型。
具體實施例方式通過下面的詳述，將對本發明的操作方法及特點和優點作進一步說明，當然，應該指出的是盡管本文描述以下幾種案例，人們也可以根據本發明的基礎，提出各種變化和個性的形式也是可能的。使用的培養液為細胞培養液Dl :DMEM(購自GICO公司)、含枸杞子提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、菊花提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、Y-27632 (購自Sigma公司)10 μ M、白細胞介素3 (IL3) (購自R&D公司)10ng/ml、白細胞介素6(IL6)(購自R&D公司)10ng/ml、神經生長因子(購自 R&D 公司)10ng/ml、二甲亞諷(DMSO)(購自 Sigma 公司)10 μ M ;細胞培養液D2 :DMEM(購自GICO公司)、含枸杞子提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、菊花提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、水蛭提取物(購自鄭州蒸諾生物科技有限公司)50mg/ml、 Y-27632(購自Sigma公司)10 μ Μ、白細胞介素3 (IL3)(購自R&D公司)10ng/ml、白細胞介素6 (IL6)(購自R&D公司)10ng/ml、神經生長因子(購自R&D公司)10ng/ml、Dkk_l (購自 Sigma 公司)10ng/ml、Lefty-A (購自 Sigma 公司)10ng/ml ；細胞培養液D3 =DMEM(購自GI CO公司)、含枸杞子提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州荔諾生物科技有限公司)50mg/ml、菊花提取物(購自河南天然植物原料廠、鄭州蒸諾生物科技有限公司)50mg/ml、水蛭提取物(購自鄭州蒸諾生物科技有限公司)50mg/ ml、Y-27632 (購自 Sigma 公司)10 μ M、B27(購自 Sigma 公司)2% (v/v)、白細胞介素 3 (IL3) (購自R&D公司)10ng/ml、白細胞介素6(IL6)(購自R&D公司)10ng/ml、神經生長因子(購自 R&D 公司)10ng/ml、Dkk_l (購自 Sigma 公司)10ng/ml、Lefty_A(購自 Sigma 公司)IOng/ ml、堿性成纖維細胞生長因子(購自R&D公司)(bFGF)10ng/ml、血管內皮生長因子(購自 R&D公司)10ng/ml、生長因子(購自R&D公司)210ng/ml ；細胞培養液D4:DMEM(購自GICO公司)、含B27(購自Sigma公司)2% (v/v)、 Y-27632(購自Sigma公司)10μΜ、神經生長因子(購自R&D公司)10ng/ml、B型轉化生長因子(購自R&D公司)(TGF-i3)10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(購自R&D公司)(bFGF) 10ng/ml、胰島素(購自R&D公司)10ng/ml、血管內皮生長因子(購自R&D公司)10ng/ml、Dkk_l (購自 Sigma公司)10ng/ml、Lefty_A(購自 Sigma公司)10ng/ml、RA(購自Sigma公司)5ng/ml、牛橫酸(taurine)(購自Sigma公司)10 μ Μ、二甲亞諷(DMSO)(購自 Sigma 公司)10 μ M ;細胞培養液D5:DMEM(購自GICO公司)、含Β27(購自Sigma公司)2% (ν/ν)、 Υ-27632(購自Sigma公司)ΙΟμΜ、神經生長因子(購自R&D公司)10ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β )(購自R&D公司)10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(購自R&D公司)10ng/ml、胰島素(購自R&D公司)10ng/ml、血管內皮生長因子(購自R&D公司)IOng/ ml、Dkk-I (購自 Sigma 公司)10ng/ml、Lefty-A(購自 Sigma 公司)10ng/ml、RA(購自 Sigma 公司)5ng/ml、牛橫酸(taurine)(購自 Sigma 公司)10 μ M、Heparin (購自 Sigma 公司)2 μ g/ml、二甲亞砜(DMSO)(購自 Sigma 公司)10 μ M0實施例I :采用周圍靜脈血/臍帶血作為原料細胞，牛產棺物和蛋白誘導件視網膜干細胞周圍靜脈血和臍帶血(科研工作人員捐贈、北京望京醫院、北京五洲女子醫院等) 無菌采集。采集周圍靜脈血/臍帶血前應征得供血本人或直系親屬的同意，并記錄供血本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫院所有相關的病毒檢查結果。周圍靜脈血/臍帶血常規抗凝，4°C保存。在24小時之內送至干細胞制作生產中心。在中心需要再做相應的病毒檢測后，進入中心電腦登記程序，在記錄相應的條形碼編號后，血液標本進入無菌干細胞生產車間。
在干細胞生產室，血液標示應用Ficoll標準分離技術(《現代免疫學》第十二章第 288頁)分離單個核細胞后，進行單個核細胞計數。應用DMEM培養液以2_5xl06的密度，在 5% C02和37°C條件下培養24-48小時；換用細胞培養液Dl繼續在5% C02和37°C條件下培養72小時，然后換用細胞培養液D2繼續在5% C02和37°C條件下培養9_15天；再換用細胞培養液D3繼續在5% C02和37°C條件下培養10-20天，形成植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。檢測生產的人自體視網膜干細胞的方法利用視網膜祖細胞和視神經祖細胞的特異細胞表型(Rx、ChxlO和Pax6)、色素上皮祖細胞的特異細胞表型(Mitf)、光感受器前體細胞的特異細胞表型(Crx、Nrl)等作為檢測指標，在換用細胞培養液D3繼續培養后的第6、 第9、第12和第15天，分別采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術和RT-PCR技術檢測，觀測各種視網膜干細胞的生成速度、生成率、生成數量和純度。實施例2采用周圍靜脈血· /臍帶血■作為原料細胞，生產植物和蛋白i秀導性視網膜
MM周圍靜脈血和臍帶血(科研工作人員捐贈、北京望京醫院、北京五洲女子醫院等) 無菌采集。采集周圍靜脈血/臍帶血前應征得供血本人或直系親屬的同意，并記錄供血本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫院所有相關的病毒檢查結果。周圍靜脈血/臍帶血常規抗凝，4°C保存。在24小時之內送至干細胞制作生產中心。在中心需要再做相應的病毒檢測后，進入中心電腦登記程序，在記錄相應的條形碼編號后，血液標本進入無菌干細胞生產車間。在干細胞生產室，血液標示應用Ficoll標準分離技術(《現代免疫學》第十二章第 288頁)分離單個核細胞后，進行單個核細胞計數。應用DMEM培養液以2_5xl06的密度，在 5% C02和37°C條件下培養24-48小時；換用細胞培養液Dl繼續在5% C02和37°C條件下培養72小時，然后換用細胞培養液D2繼續在5% C02和37°C條件下培養9_15天；再換用細胞培養液D3繼續在5% C02和37°C條件下培養10-20天，形成植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生視網膜細胞的方法I)從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生視桿細胞、視錐細胞和色素上皮細胞經細胞培養液D3培養形成的植物和蛋白誘導性視網膜干細胞，應用D4細胞培養液繼續培養15-20天形成自體視網膜視桿細胞、視錐細胞和色素上皮細胞。2)從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生節細胞經細胞培養液D3培養形成的植物和蛋白誘導性視網膜干細胞，應用D5細胞培養液繼續培養15-20天形成自體視網膜節細胞。檢測生產的各種類型的自體視網膜細胞的方法采用細胞免疫熒光技術和RT-PCR技術檢測視網膜細胞，如視桿細胞(Rhodopsin、 Recoverin)、視維細胞(Blue opsin、Red/green opsin)、節細胞(MAth5、Brn3b、Thy-1)、色素上皮細胞(RPE-65、CRALBP、PEDF、GFAP、Six3、Six6、Lhx2)特異蛋白的表達。實施例3本實施例對實施例I中制備的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞進行裸鼠移植的安全性研究，具體如下。在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射I X IO8個植物和蛋白誘導性的視網膜干細胞或IXIO8個人自然胚胎干細胞(北京望京醫院)，觀察接種部位有否腫瘤形成。連續觀察90天。結果顯示，植物和蛋白誘導性視網膜干細胞試驗組10只裸鼠無一例產生腫瘤，具有較高的安全性；而人自然胚胎干細胞試驗組10只裸鼠全部產生腫瘤。
權利要求
1.一種使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的方法，其中，所述方法包括將人的體細胞在細胞培養液Dl中培養72小時，所述細胞培養液Dl為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物1-lOOmg/ml、Y-27632 5-30 μ Μ、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 Ι-lOOng/ml、二甲亞砜 (DMSO) 5-30 μ M ;然后換用細胞培養液D2培養9_15天，所述細胞培養液D2為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-lOOmg/ml、水蛭提取物l-100mg/ml、Y-27632 5-30 μ Μ、白細胞介素3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5-30ng/ml、Dkk-15_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ml ;再換用細胞培養液 D3 繼續培養 10-20 天，D3培養液為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-lOOmg/ml、水蛭提取物 l-100mg/ml,Y-276325-30 μ Μ,Β272% (ν/ν)、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5-30ng/ml、Dkk-15_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ml、喊性成纖維細胞生長因子(bFGF) 5-30ng/ml、血管內皮生長因子5_30ng/ml、生長因子5_30ng/ml 從而獲得植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞；優選地，在5% CO2和37°C條件下進行細胞培養。
2.如權利要求I所述的方法，其中，所述人的體細胞包括但不限于人的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞、血液等；優選地，在人的體細胞以細胞培養液Dl培養之前，先以2-5 X IO6的密度，在5% CO2和 37 °C條件下培養24-48小時；優選地，先將細胞在細胞培養液Dl中培養72小時，所述細胞培養液Dl為含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 (IL3) 10ng/ml、白細胞介素6(IL6)10ng/ml、神經生長因子10ng/ml、二甲亞砜(DMSO) 10 μ M的DMEM ;然后換用細胞培養液D2培養9-15天，所述細胞培養液D2為含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 (IL3) 10ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 10ng/ml、神經生長因子 10ng/ml、Dkk-I 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml ;再換用細胞培養液D3繼續在5% CO2和37°C條件下培養10-20天，所述細胞培養液D3為DMEM，并含有枸杞子提取物50mg/ml、菊花提取物50mg/ml的DMEM、水蛭提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ,Β272% (ν/ν)、白細胞介素3 (IL3) 10ng/ml、白細胞介素6 (IL6) 10ng/ml、神經生長因子 10ng/ml、Dkk-I 10ng/ml、Lefty-A10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 10ng/ml、 血管內皮生長因子10ng/ml、生長因子210ng/ml，從而獲得植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。
3.—種從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化自體視網膜視錐、視桿細胞和色素上皮細胞的方法，其中，所述方法包括將如權利要求I或2所述的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞采用培養液D4培養15-20天形成視錐細胞、視桿細胞和色素上皮細胞； 所述培養液 D4 為 DMEM、Β272% (ν/ν)、Υ-276325-30 μ Μ、神經生長因子 1-lOOng/ml、B 型轉化生長因子(TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml、血管內皮生長因子 1-lOOng/ml、Dkk-1 1-lOOng/ml、Lefty-A 1-lOOng/ml、RA l-100ng/ml、牛磺酸(taurine) 5-30 μ M、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ M ；優選地，所述細胞的擴增傳代在5% CO2和37°C條件下進行；優選地，將如權利要求2所述的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞在培養液D4中培養9-15天形成視錐細胞、視桿細胞和色素上皮細胞，所述細胞培養液D4為含有Y-27632 10 μ M、神經生長因子10ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 10ng/ml、胰島素 10ng/ml、血管內皮生長因子 10ng/ml、Dkk-I 10ng/ml、 Lefty-A 10ng/ml> RA 5ng/ml、牛橫酸(taurine) 10 μ M、二甲亞諷(DMSO) 10 μ M 的 DMEM。
4.一種從植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞分化產生節細胞的方法，其中，所述方法包括將如權利要求I或2所述的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞采用培養液D5， 培養15-20天形成節細胞；所述培養液D5為DMEM、B272% (v/v)、Y-27632 5-30 μ Μ、神經生長因子l-100ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF) 1-lOOng/ml、膜島素 l-100ng/ml、血管內皮生長因子 l-100ng/ml、Dkk-I I-IOOng/ ml、Lefty-Al-lOOng/ml、RA l-100ng/ml、牛橫酸(taurine) 5-30 μ M、Heparin 1-100 μ g/ ml、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ M ；優選地，所述細胞的擴增傳代在5% CO2和37°C條件下進行；優選地，將如權利要求2所述的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞在培養液D5中培養9-15天分化產生節細胞，培養液D5為DMEM、B272% (v/v)、Y-27632 10 μ Μ、神經生長因子10ng/ml、B型轉化生長因子(TGF-β ) 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) IOng/ ml、胰島素 10ng/ml、血管內皮生長因子 10ng/ml、Dkk-I 10ng/ml、Lefty-A 10ng/ml、RA 5ng/ml、牛橫酸(taurine) 10 μ M、Heparin 2yg/ml、二甲亞砜(DMSO) 10 μ Μ。
5.如權利要求1-2中任一項所述的方法制備的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞。
6.如權利要求3-4中任一項所述的方法制備的自體視錐細胞、視桿細胞、色素上皮細胞及視網膜節細胞。
7.如權利要求5所述的植物和蛋白誘導性自體視網膜干細胞在制備用于治療視網膜疾病的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為老年黃斑變性、視網膜色素變性、視神經損傷、萎縮。
8.如權利要求6所述的植物和蛋白誘導性自體視網膜細胞在制備用于治療視網膜疾病及視神經疾病的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為視網膜變性、視神經損傷、萎縮。
9.一種用于使人的體細胞逆向分化的培養液，其中，所述培養液選自細胞培養液D1、 D2、D3、D4和D5，所述細胞培養液Dl為DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-100mg/ml、Y-27632 5-30 μ Μ、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ ml、神經生長因子l-100ng/ml、二甲亞砜(DMSO) 5_30 μ M ;所述細胞培養液D2為DMEM、 并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-100mg/ml、水蛭提取物l-100mg/ml、 Υ-276325-30 μ Μ、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、神經生長因子 5-30ng/ml、Dkk-I 5_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ml ;所述細胞培養液 D3 為 DMEM、并含有枸杞子提取物l-100mg/ml、菊花提取物l-lOOmg/ml、水蛭提取物l-100mg/ml、Y-27632 5-30μΜ、Β27 2% (ν/ν)、白細胞介素 3 (IL3) 5_30ng/ml、白細胞介素 6 (IL6) 5_30ng/ml、 神經生長因子5_30ng/ml、Dkk-I 5_30ng/ml、Lefty-A 5_30ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)5-30ng/ml、血管內皮生長因子5-30ng/ml、生長因子2 5_30ng/ml ;所述細胞培養液 D4 為 DMEM、B27 2% (v/v), Y-27632 5-30 μ Μ、神經生長因子 l-100ng/ml、B 型轉化生長因子(TGF-0)l-lOOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素l-100ng/ml、血管內皮生長因子 l-100ng/ml、Dkk-I l-100ng/ml、Lefty-A l-100ng/ml、 RA l-100ng/ml、牛磺酸(taurine) 5-30 μ M、二甲亞砜(DMSO) 5-30 μ M ;所述細胞培養液 D5 為DMEM、Β27 2% (ν/ν)、Υ-27632 5-30 μ Μ、神經生長因子l-100ng/ml、B型轉化生長因子 (TGF-β ) l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml、 血管內皮生長因子 l-100ng/ml、Dkk-1 l-100ng/ml、Lefty-A l-100ng/ml、RAl-100ng/ml、 牛橫酸(taurine) 5-30 μ M、Heparin 1-100 μ g/ml、二甲亞諷(DMSO) 5-30 μ Μ。
10.如權利要求9所述的細胞培養液Dl、D2和D3在培養人的體細胞使之逆向分化產生自體視網膜干細胞中的應用。
11.如權利要求9所述的細胞培養液D1、D2、D3、D4和D5在培養人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞，進而分化產生視錐細胞、視桿細胞、色素上皮細胞、節細胞中的應用。
12.一種用于制備自體視網膜干細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括如權利要求9所述的細胞培養液Dl、D2和D3 ；優選地，所述試劑盒進一步包括人的體細胞；所述體細胞包括但不限于人的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞。
13.一種用于制備自體視網膜視錐細胞、視桿細胞、色素上皮細胞及節細胞的試劑盒， 其中，所述試劑盒包括如權利要求9所述的細胞培養液Dl、D2、D3、D4和D5 ；優選地，所述試劑盒進一步包括人的體細胞；所述體細胞包括但不限于人的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞。
14.如權利要求12或13所述的試劑盒在制備自體視網膜干細胞和用于治療視網膜及視神經疾病的藥物以及用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為視網膜變性、視神經損傷、萎縮；更優選地，所述疾病為老年黃斑變性、視網膜色素變性、糖尿病視網膜變性。
全文摘要
本發明提供了一種使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞和自體視網膜細胞的方法，所述方法包括采用含有不同植物提取物和蛋白成分的培養液分步驟培養人的體細胞，從而使所述體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞，及繼續產生多種自體視網膜細胞。本發明在2-3周內即可產生數百億的第1代自體視網膜干細胞。這種植物和蛋白誘導性人自體視網膜干細胞具有與人自然視網膜干細胞類似的細胞特異表型和多種細胞分化能力，該自體視網膜干細胞及自體視網膜細胞不僅對視網膜色素變性等疾病治療領域有良好的應用前景，而且在再生醫學、自體組織器官工程領域具有良好的潛在應用前景，并具有大規模工業化和產業化生產自體視網膜干細胞和視網膜細胞的可能性。
文檔編號C12N5/071GK102604886SQ20111002210
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月20日 優先權日2011年1月20日
發明者任海英, 廖煥昭, 李貴鈴, 林雄斌, 石海鵬 申請人:北京善爾創生生物科技有限公司