專利名稱：一種含兩種有效成分的紅花的篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物科學技術領域，具體涉及一種含兩種有效成分羥基紅花黃色素A 和4- {11，-羥基-11，-巰基-11，- {1，- [2，- (N — 0)-異喹啉基]} 苯甲酸的紅花的篩選方法。
背景技術：
紅花Carthmus tinctorius L.為菊科植物紅花的干燥管狀花，臨床應用廣泛。主要化學成分有黃酮類、吲哚類、木脂素類、烷基二醇類等。其中羥基紅花黃色素 A(Hydroxysafflor yellow A，簡稱HSYA)是紅花的重要活性成分，具有抗心肌缺血、腦缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等多種藥理作用，對心腦血管疾病有很好的防治作用，具有很好的應用前景(吳偉，李金榮，樸永哲，董寧寧，金鳴.羥基紅花黃色素A緩解大鼠心肌線粒體損傷的作用研究.中國藥學雜志，2006,41(16) :1225-1227 ；金鳴，高子淳，王繼峰.羥基紅花黃色素A抑制PAF誘發的家兔血小板活化的研究.北京中醫藥大學學報，2004，27 (5) 32;金嗚，李金榮，吳偉.羥基紅花黃色素A抗氧化作用的研究.中草藥，2004，35 (6) :665; 施峰，劉焱文，紅花的化學成分及藥理研究進展，時珍國醫國藥。2006，17 (9) :1666-1667)。 4-{11，-羥基-11，-巰基-11，-{1，-[2，-(N —0)-異喹啉基]}-1-苯甲酸(簡稱 IQBA) 是本發明人從中藥紅花中研究獲得的又一個具有腦缺血保護作用的化合物(Ge Zhang, Mei-Li Guo, Run-Ping Li, Ying Li, Han-Ming Zhang, Zhong-Wu Su.A NOVEL COMPOUND FROM FlosCarthami AND ITS BI0ACTIVITY. Chemistry of Natural Compounds. 2009,45 339-341)。因此，紅花中HSYA和IQBA含量的高低，直接影響紅花品質的優劣。對紅花品質相關功能基因進行研究，對提高紅花的產量和質量具有重要意義。前期研究工作，本發明人應用cDNA-AFLP技術結合BSA法對含與不含羥基紅花黃色素A的紅花進行差異表達分析，發明了一種篩選含羥基紅花黃色素A的紅花品種的方法已獲得中國專利(中國專利ZL 200810037322. 8，發明創造名稱一種含羥基紅花黃色素A 的紅花的篩選方法)。在此基礎上，為了更有效地篩選含有效成分種類多的紅花，本發明人繼續進行研究，發明了另一種篩選含兩種有效成分HSYA和IQBA的紅花的新方法。
發明內容
本發明目的是提供一種含兩種有效成分HSYA和IQBA的紅花的篩選方法。本發明應用cDNA-AFLP技術結合BSA法對含與不含HSYA和IQBA的紅花進行差異表達分析，在紅花中找到與HSYA和IQBA緊密連鎖的3條基因，該基因具有如SEQ ID N0. 1-3 所示的核苷酸序列。具體方法如下本發明以含HSYA和IQBA的紅花品系No. 16為母本，不含HSYA和IQBA的紅花 No. 25為父本進行雜交，獲得Fl代種子，Fl代種子進行自交加代獲得的F2種子，繼續種植， 從單粒F2種子獲得F2代群體共計215個單株。然后進行以下步驟1.根據F2代群體的HSYA和IQBA的含量有無，取等量含HSYA和IQBA的F2代個體的花冠混成有池，另取不含HSYA和IQBA的F2代個體的花冠混成無池；2.提取紅花總RNA，反轉錄成雙鏈cDNA ；3.通過cDNA-AFLP對含有HSYA和IQBA與不含HSYA和IQBA的紅花的差異表達分析，在Msel-AG/I^stl-AT的引物組合中獲得TDF_2、TDF_3兩條片段，在Msel-AC/I^stl-AT 引物組合中獲得TDF-9' —條片段；4.對3條片段進行回收，克隆和測序。TDF-2具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；TDF-3具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；TDF-9'具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。本發明提供了一種含HSYA和IQBA的紅花的篩選方法，該方法是用cDNA序列分析方法鑒定紅花基因中含有如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的兩個核苷酸序列，或SEQ ID No. 3所示的一個核苷酸序列。上述序列分析方法包括RT-PCR方法、Northerning Bloting法以及cDNA末端快速擴增(RACE)法等。上述方法包括以下步驟A、根據 TDF-2(SEQ ID No. 1)，TDF-3 (SEQ ID No. 2), TDF-9' (SEQID No. 3)序列設計并合成RT-PCR引物，TDF-2 引物S2 5，-GATTACGTGATTGCAAACGAACAAC-3，A2 5' -GTTGTTCGTTTGCA ATCACGTAATC-3‘TDF-3 引物S3 5，-GGCCTATTTGCCCTCCCTGCATTCG-3，A3 5' -CGAATGCAGGGAGGGCAAATAGGCC-3‘TDF-9 ‘引物A9 :5，-CAGAAACTCTAAAAAATGTTTGCAA-3，S9 :5， -TTGCAAACATTTTTTAGAGTTTCTG-3，S27 :5， -TTGGAGGATAAAGAGGAGGATCAGG-3，B、提取紅花的總RNA ；C、以紅花總RNA為模板，翻轉錄成第一鏈cDNA ；D、以第一鏈cDNA為模板加入合成的引物，進行PCR擴增；E、瓊脂糖電泳，紫外顯色；F、測序。在含HSYA和IQBA的紅花中得到與SEQ ID NO. 1-3相同序列基因，而在不含HSYA 和IQBA的紅花中未得到，證明cDNA-AFLP實驗的可靠性。按照上述篩選含HSYA和IQBA的紅花的方法，在含HSYA和IQBA的紅花品種和不含HSYA和IQBA的紅花品種共18個不同紅花品種之間應用此方法，均發現在含有HSYA和 IQBA的紅花中有與TDF-2，TDF-3，TDF-9'相同基因片段，而在不含HSYA和IQBA的紅花中不存在。本發明為篩選含HSYA和IQBA的紅花品種，進而為實現紅花高品質性狀的定向調
控奠定基礎。
圖1 紅花cDNA-AFLP差異表達的銀染結果。
4
其中箭頭分別代表TDF-2，TDF-3 ；7-24 含HSYA和IQBA的F2代單株；1-6 不含 HSYA和IQBA的F2代單株圖2 紅花cDNA-AFLP差異表達的銀染結果。其中箭頭代表TDF-9' ；1-12 不含HSYA和IQBA的F2代單株；13-M 含HSYA和 IQBA的F2代單株圖3 :cDNA-AFLP差異表達片段在RT-PCR的驗證結果。其中1-7 含HSYA和IQBA的F2代單株；8-14 不含HSYA和IQBA的F2代單株。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細描述。實施例1 本發明TDF_2，3，9'片段的分離1.應用高效液相色譜方法、薄層色譜法及紫外分光光度法測定F2代群體的HSYA 和IQBA的含量，檢測其有無。2.根據測定結果各取含與不含HSYA和IQBA的紅花花冠，提取總RNA，并轉化成雙鏈 cDNA。3.構建含與不含HSYA和IQBA的近等基因池，取含HSYA和IQBA單株的cDNA各 1 μ g，共10株混成有池；另取不含HSYA和IQBA的cDNA單株各1 μ g共10株混成無池。
4. cDNA-AFLP差異表達分析(1)限制性酶切與接頭連接采用I3StI和MseI兩種限制性內切酶對cDNA雙酶切， 酶切時間37°C 6h ；然后用T4DNA連接酶將I^stI和MseI接頭與酶切片段連接，16°C 12h。(2)片段的預擴增本研究用連接產物做模板，采用預擴增引物組合Pck/M^G' -G ACTGCGTACATGCAG-3 ‘ /5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAA-3 ‘)。對連接產物稀釋 10 倍。在 Biometra PTC-200 型 PCR 儀上按以下程序擴增:94°C 3min,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，30 個循環； 72°C 5min ；4°C保溫。預擴增產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上檢測，-20°C保存備用。(3)選擇性擴增采用選擇性擴增引物組合P+nn/M+nn(5 ‘ -GACTGCGTACATGCAGNN-3 ‘/5' -GATGAGTCCTGAGTAANN-3 ‘ (N 代表 ACGT，N 代表 ACGT 任意一種，P1-P16 共 16 條引物，M1-M16共16條引物))，對預擴產物稀釋150倍。選擴反應體系根據Bachem等體系作略微調整。擴增程序94°C 3min，94°C 30s,65°C 30s每循環降低0. 7°C，72°C Imin 12個循環，94°C 30s，退火溫度56°C 30s。72°C Imin 30個循環，72°C IOmin ；4°C保溫。擴增產物在 1. 5%瓊脂糖檢測，-20°C保存備用。(4) cDNA-AFLP擴增產物的電泳按30V/cm的電壓進行30min預電泳。擴增產物 溴酚蘭8 3混合，95°C變性8min，立即冰浴。去除在預電泳時擴散出來的尿素后加樣， 1800V電泳，恒壓。(5)銀染檢測固定膠將膠浸在固定液中振蕩20min至電泳染料顏色消失。用超純水洗膠三次，每次8min。染色30min。將膠浸入超純水中、取出浙水、立即放入盛有預冷顯色液顯色膠在搖床上搖動至出現模板帶或可見第一條帶。將膠轉至剩余的1升預冷的顯色液中，繼續顯色3-5min或至全部條帶顯現出來。加入1升固定/終止溶液，在搖床上反應2-aiiin，終止顯色反應。用超純水漂洗聚丙烯酰胺凝膠兩次，每次5min，室溫放置干膠， 如圖1、2所示。5.TDF-2，3，9'的分離克隆和測序引物Msel-AG/Pstl-AT篩選得到2條特異性片段TDF-2，TDF-3，引物Msel-AC/I^stl-AT篩選得到1條特異性片段TDF-9'，從PAGE 膠上回收多態性TDF片段，并以此片段為模板作PCR，瓊脂糖擴增產物采用Watson小量膠回收試劑盒進行回收，回收多態性片段連接至PMD-18T vector中，并轉化E. coli DH5 α。通過氨芐抗性篩選轉化子，挑選陽性克隆，將陽性克隆擴倍后送往htrogen公司測序，測得序列分別為262bp和165bp和452bp，如SEQ ID No. 1-3所示。SEQ ID No. 1 (TDF-2) 262bpgattacgtgattgcaaacgaacaactgaaacagatacgacaacacgcctctccttccggcaatgcctca cagaggttggctcatatatttgcccttggtctagaggcacgcttgtctggcactggttcgcagctttacgcatctcaaaaggccacgaag atctcatctactgagaaactgaaagcatatcaggcttatatgtcggcctgccctttcaagggcaatgagctttactttgctaacagaact atttatgaagcatSEQ ID No. 2 (TDF-3) 165bpggcctatttgccctccctgcattcgattgttgaaggggtctctgccggccaaactaggcggtatcccct gcacggcgcgccgtcacaggtgccaggggagggtagccacccaatgcgctttcacggtctcggcccagatactcaccacacggcgaaat taggtcgSEQ ID No. 3 (TDF-9 ‘ ) 452bpttgcaaacattttttagagtttctgtaaagcaccatcaaacacttagtgggggtatatattgtgaggtc atatgggtttctatagattttttttttatgttagcttgtttttttagacacaaattatccctttcccaaacagctctagattggggtccccactccaa acccgtcccattcccatgcctttgcaaacattttttagagtttctgtaaagcaccatcaaacacttagtgggggtatatattgtgaggtcatat gggtttctatagattttttttttatgttagcttgtttttttagacacaaattatccctttcccaaacagctctagattggggtccccactccaaaccc gtcccattcccatgcctacacaaattatccctttcccaaacagctctagattggggtccccactccaaacccgtcccattcccatgccttttt實施例2 :RT-PCR對TDF-2，3,9'基因表達驗證A、根據 TDF-2(SEQ ID No. 1)，TDF-3 (SEQ ID No. 2), TDF-9' (SEQID No. 3)序列設計并合成RT-PCR引物，TDF-2引物:S2:5，-GATTACGTGATTGCAAACGAACAAC--3，(SEQ ID No.4)
A2:5，-GTTGTTCGTTTGCAATCACGTAATC--3，(SEQ ID No.5)
TDF-3引物:S3:5，-GGCCTATTTGCCCTCCCTGCATTCG--3，(SEQ ID No.6)
A3:5，-CGAATGCAGGGAGGGCAAATAGGCC--3，(SEQ ID No.7)
TDF-9引物:A9:5，-CAGAAACTCTAAAAAATGTTTGCAA--3，(SEQ ID No.8)
S9:5，-TTGCAAACATTTTTTAGAGTTTCTG--3，(SEQ ID No.9)B、提取河南無刺大紅袍紅花的總RNA ；C、以紅花總RNA為模板，翻轉錄成第一鏈cDNA ；D、以第一鏈cDNA為模板，加入合成的引物，進行PCR擴增；
E、瓊脂糖電泳，紫外顯色。F、測序。在含HSYA和IQBA的紅花中得到與SEQ ID No. 1-3相同序列基因，而在不含HSYA 和IQBA紅花中未得到，證明cDNA-AFLP實驗的可靠性，如圖3所示。實施例3 本篩選方法的應用1.分別提取各產地含與不含HSYA和IQBA的紅花總RNA，轉成雙鏈cDNA。2.應用Msel-AG/I^stl-AT或MseI-ACA3StI-AT引物組合，用實施1的方法對含有 HSYA和IQBA與不含HSYA和IQBA紅花進行cDNA-AFLP差異表達分析，在哈密紅花，吉木薩爾紅花，昌吉紅花，新鄉紅花，菏澤紅花，毫州紅花，簡陽紅花，開封紅花，鄭州紅花，成都紅花，微山紅花，酒泉紅花，昆明紅花獲得3條特異性片段，而若羌紅花，塔城紅花，烏魯木齊紅花、清徐紅花，海南紅花中未獲得。3.含有3條特異性片段的上述紅花品種經用高效液相方法測定，均含HSYA和 IQBA ；而不含上述3條片段的品種，均不含HSYA和IQBA。4.對3條片段進行回收，克隆和測序，均與TDF-2，TDF-3，TDF-9'序列相同。5.用實施2的方法進行RT-PCR驗證，發現在含有HSYA和IQBA的紅花品種如哈密紅花，吉木薩爾紅花，昌吉紅花，新鄉紅花，菏澤紅花，毫州紅花，簡陽紅花，開封紅花，鄭州紅花，成都紅花，微山紅花，酒泉紅花，昆明紅花中存在；而在不含HSYA和IQBA的紅花品種如若羌紅花，塔城紅花，烏魯木齊紅花、清徐紅花，海南紅花中不存在。
權利要求
1.一種含羥基紅花黃色素A和4-{11，_羥基-11，-巰基-11，-{1，-[2，-(N—0)-異喹啉基]}-1-苯甲酸的紅花的篩選方法，，其特征在于該方法是用CDNA序列分析方法鑒定紅花基因中含有如SEQ ID NO 1-3所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種含羥基紅花黃色素A和4-{11’-羥基-11’ -巰基-11’ -{1’ -[2’ -(N —0)-異喹啉基]}-1_苯甲酸的紅花的篩選方法，，其特征在于其中的cDNA序列分析方法是RT-PCR方法、Northerning Bloting法或cDNA末端快速擴增法。
3.根據權利要求1或2所述的一種含羥基紅花黃色素A和4-{11’-羥基-11’ -巰基-11’-{1’-[2’-(N—0)-異喹啉基]}-1_苯甲酸的紅花的篩選方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、設計并合成下述RT-PCR引物；SEQ ID No. 1 引物5’ -GATTACGTGATTGCAAACGAACAAC-3， 5’ -GTTGTTCGTTTGCAATCACGTAATC-3‘SEQ ID No. 2 引物5’ -GGCCTATTTGCCCTCCCTGCATTCG-3’ 5' -CGAATGCAGGGAGGGCAAATAGGCC-3‘SEQ ID No. 3 引物5，-CAGAAACTCTAAAAAATGTTTGCAA-3， 5， -TTGCAAACATTTTTTAGAGTTTCTG-3， 5' -TTGGAGGATAAAGAGGAGGATCAGG-3‘B、提取紅花的總RNA；C、以紅花總RNA為模板，翻轉錄成第一鏈cDNA；D、以第一鏈cDNA為模板加入合成的引物，進行PCR擴增；E、瓊脂糖電泳，紫外顯色；F、測序。
全文摘要
本發明涉及生物科學技術領域，由于紅花的兩種有效成分羥基紅花黃色素A(HSYA)和4-{11’-羥基-11’-巰基-11’-{1’-[2’-(N→O)-異喹啉基]}-1-苯甲酸(IQBA)含量的高低，直接影響紅花品質。本發明采用cDNA-AFLP對兩者的表達特性進行分析，分離與兩種有效成分HSYA和IQBA密切相關的差異表達基因，通過RT-PCR進一步驗證其特征基因型及cDNA-AFLP方法的正確性。本發明獲得的特異性DNA片段具有SEQ ID NO1-3所示的核苷酸序列。本發明將上述特異性DNA片段用于篩選含兩種有效成分HSYA和IQBA的紅花品種，進而為實現紅花高品質性狀的定向調控提供良好條件。
文檔編號C12Q1/68GK102154464SQ20111000352
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優先權日2011年1月10日
發明者李東巧, 楊娟, 郭美麗 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學