專利名稱：一種寡糖Globotriose的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種寡糖的制備方法，特別涉及一種利用α-半乳糖苷酶合成寡糖 Globotriose的方法，屬于寡糖合成技術領域。
背景技術：
紅細胞血型抗原pk((ib3Cer)是一種廣泛存在于人體細胞表面的重要糖脂，由 Globotriose糖基配體和神經酰胺構成。一些腸道致病菌如志賀氏菌等可以合成志賀毒素， 并通過毒素與Globotriose特異性結合來識別(A3Cer,入侵人體細胞。一旦毒素進入細胞內循環，將引發一系列臨床綜合癥狀，包括溶血尿毒癥綜合征，多器官功能衰竭等，嚴重則導致死亡。如果能阻止毒素和(^b3Cer糖基配體的結合，則可以阻止志賀菌入侵細胞。研究發現，單個Globotriose分子對志賀毒素中和能力較弱，而Globotriose聚合分子對志賀毒素表現出了高度的親和力，可以在毒素進入細胞前中和毒素，使得志賀菌無法與細胞表面 Gb3Cer的糖基配體接合，無法入侵細胞，從而有效防治該類病菌。Globotriose聚合分子已經在基礎研究和臨床治療中得到廣泛應用，其獲得一般需要單個Globotriose分子作為前體物質。Globotriose 是一種中性三糖，化學結構為 Gal α (1 — 4)Gal β (1 — 4)Glc，目前的合成方法主要有三種化學合成、糖基轉移酶合成和工程微生物代謝生產。化學合成方法需要反復的添加保護基團和脫保護基團，合成步驟繁瑣，得率也較低，而且(^al-α -糖苷鍵的形成難以控制，該方法難以大規模應用。糖基轉移酶可以催化一步轉糖基反應特異性合成Globotriose，但它需要昂貴的UDP活化的糖苷作為底物，成本很高。工程微生物代謝生產是利用基因工程對細胞的糖合成和糖代謝途徑進行改造，利用這種重組細胞來合成相應的糖苷化合物。通過將合成UDP糖苷的一系列酶和fell α 1，4糖基轉移酶重組至細胞， 使重組細胞可以利用低成本底物如乳清酸、果糖和乳糖等合成Globotriose，但細胞內多個酶的連續反應不容易控制，而且合成的產物Globotriose在轉運出細胞方面的困難也難以解決，這些限制了它的大規模應用。由于現有的合成方法均存在局限性，使得Globotriose 的商品價格一直非常昂貴，迫切需要尋找新的經濟有效的合成方法。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種寡糖Globotriose的制備方法。發明概述本發明的技術要點是利用α -半乳糖苷酶以對硝基苯_α -D-半乳糖苷為糖基供體，以乳糖為受體，一步轉糖基反應合成寡糖Globotriose。發明詳述術語解釋活力單位⑶取酶液30μ 1，加2mM對硝基苯-α-半乳糖苷溶液150μ 1(ρΗ 5.5、 50mM醋酸緩沖液配制)，37°C反應lOmin，加入1. 05ml,0. 2M、pH 10. 5硼酸緩沖液終止反應，測0D400。以每分鐘水解對硝基苯-α -D-半乳糖苷底物釋放1 μ M硝基苯酚的酶量為1個酶活單位⑶。一種寡糖Globotriose的制備方法，步驟如下(1)分別用磷酸緩沖液配制濃度為0. IM的對硝基苯-a -D-半乳糖苷溶液、濃度為 0. IM 0. 5Μ的乳糖溶液和濃度為5 20U/ml的α -半乳糖苷酶溶液；(2)將步驟(1)制得的對硝基苯-a-D-半乳糖苷溶液、乳糖溶液和α -半乳糖苷酶溶液按體積比1 1 8的比例混合，37°C水浴中反應1 5小時，100°C煮沸，得 Globotriose 反應液 I ；(3)將步驟(2)制得的Globotriose反應液I用等體積的乙酸乙酯萃取1 2次， 收集下層水溶液，在35°C 45°C的條件下旋轉蒸發30分鐘去除乙酸乙酯，得去除對硝基苯酚的Globotriose反應液II ；(4)將步驟(3)制得的Globotriose反應液II按照6 8%質量體積比的接種量加入酵母菌細胞，在觀 30°C、150 180轉/分培養M 36小時，離心，取上清，得去除對硝基苯酚、半乳糖和乳糖的Globotriose反應液III ；(5)將步驟(4)制得的Globotriose反應液III按每毫升反應液1_2毫克的用量加入活性炭，室溫攪拌1小時，0. 4 μ m的濾膜過濾，去上清，然后加入與Globotriose反應液 III等體積的3% (質量百分比)乙醇重懸，室溫攪拌1小時，0.4μπι的濾膜過濾，去上清， 再按反應液III 二分之一體積加入20% (質量百分比)乙醇重懸，室溫攪拌1小時，0.4μπι 的濾膜過濾，收集上清，冷凍干燥，即得寡糖Globotriose產品。所述步驟(1)中的α-半乳糖苷酶溶液由具有α (1 — 4)糖苷鍵合成活性的 α-半乳糖苷酶配制。上述α -半乳糖苷酶選用專利ZL200510044898. 3所述基因序列或GenBank登錄號為AF406640的基因序列按照專利ZL200510044898. 3所述方法制得。所述步驟(1)中的磷酸緩沖液濃度為0. 05Μ 0. 5Μ，ρΗ值為5. 5 8. 0 ；優選的， 所述步驟(1)中的磷酸緩沖液是濃度為0. 05Μ的磷酸鈉緩沖液，PH值為8. 0。所述步驟(1) 中的乳糖溶液濃度為0. 5Μ。所述步驟O)中100°C煮沸后，還包括12000轉/分離心10分鐘的離心步驟。所述步驟中的酵母菌細胞通過如下方法制得采用YPD培養基培養乳酸克魯維酵母細胞，該菌株在美國標準菌種收藏所編號為ATCC N0. 8563，在培養30 40小時，12000轉/分離心3 10分鐘，即得。上述YPD培養基組分如下，均為重量百分數2%葡萄糖，2%蛋白胨，酵母粉， PH自然。本發明提供了一種經濟有效的利用糖苷酶合成Globotriose的方法，所采用的 α -半乳糖苷酶催化合成Globotriose的反應避免了化學合成中基團保護和脫保護，條件溫和，工藝簡單，易于操作，更重要的是該酶所用到的底物便宜，來源廣泛，容易獲取，大大降低了酶法合成Globotriose的生產成本，適合于Globotriose的大規模合成，具有潛在的應用前景。
圖1為本發明采用的糖苷酶法合成Globotriose的反應示意圖；其中，1、乳糖；2、對硝基苯-α -D-半乳糖苷；3、α -半乳糖苷酶；4、對硝基苯酚； 5、Globotriose0圖2為α -半乳糖苷酶以乳糖為受體合成產物的質譜圖。圖3為α -半乳糖苷酶以乳糖為受體合成產物的GC圖譜。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。實施例中所述乳酸克魯維酵母購自美國標準菌種收藏所，菌種編號為ATCC NO. 8563。實施例1一種寡糖Globotriose的制備方法，步驟如下1. α-半乳糖苷酶的制備按專利ZL200510044898. 3所述方法制備α -半乳糖苷酶。2. α -半乳糖苷酶催化合成寡糖Globotriose測定上述α -半乳糖苷酶酶液以對硝基苯-α _D_半乳糖苷為底物的酶活，用 pH8. 0、50mM磷酸鈉緩沖液將其稀釋到10U/ml。用pH8. 0、50mM磷酸鈉緩沖液配制0. IM的對硝基苯-α -D-半乳糖苷溶液和0. 5Μ的乳糖溶液。取10U/ml的酶液5ml，0. IM的對硝基苯- a -D-半乳糖苷溶液5ml, 0. 5M的乳糖40ml，在37°C反應3小時后，100°C煮沸10分鐘， 終止反應，得Globotriose反應液I。3.寡糖 Globotriose 的純化用鹽酸將獲得的50mlGlObOtriOSe反應液I調至pH5. 5，然后轉移至250ml的分液漏斗，加入50ml的乙酸乙酯，萃取后收取下層水溶液，在35°C下旋轉蒸發30分鐘，用NaOH 調整反應液至PH7. 0，然后加入IOOml水將反應液的總糖含量稀釋到6 % (質量百分比)，得 Globotriose 反應液 II。將乳酸克魯維酵母接種至900ml的YPD培養基培養30h，12000轉/分離心3 分鐘獲得6g酵母細胞。將6g酵母細胞加入到上述150naGlObOtriOSe反應液II中，在37°C 處理觀小時，12000轉/分離心10分鐘去掉酵母細胞，收取上清，得Globotriose反應液III。在酵母處理后的150naGlObOtriOSe反應液III中加入200毫克的活性炭顆粒，室溫攪拌處理1個小時，用0. 4μπι的濾膜過濾，除去上清。然后向活性炭顆粒中加入150ml 的3%乙醇，室溫低速攪拌處理1個小時，用0. 4μπι的濾膜過濾，除去上清。然后向活性炭顆粒中加入75ml的20%乙醇，室溫低速攪拌處理1個小時，用0. 4 μ m的濾膜過濾，收集上清。冷凍干燥成白色粉末，即得寡糖Globotriose產品。4.寡糖Globotriose的結構鑒定和含量分析取上述白色粉末用水稀釋成質量體積百分比為的溶液，并取Globotriose 的標準品配制成的水溶液，薄層層析板點樣，在展層劑(正丁醇無水乙醇水= 5:3:2)中展開，霧噴顯色劑(20%硫酸溶液+0.5%的3，5-二羥基甲苯)，于120°C烘烤 5分鐘，糖斑點顯色后，目標產物的遷移率和Globotriose標準品遷移率一致。
取上述的水溶液進行質譜分析，目標產物的分子離子峰(m/ζΚΜ-ΗΓ為 503. 4 (如圖2所示)，判斷產物分子量為504，為三糖分子。取1毫克獲得的白色粉末，進行甲基化衍生，然后通過紅外光譜檢測甲基化程度。完全甲基化的樣品用濃鹽酸進行酸解，之后進行乙酰化。乙酰化完全的樣品進行氣質 (GC-MS)分析，判斷產物糖苷鍵型和含量。GC-MS中GC分析結果見圖3，GC中保留時間為 12. 1 分鐘的質譜碎片峰，與文獻報道的三糖非還原端1，4連接的半乳糖峰一致，據此判斷主要產物為Globotriose。根據GC圖譜的峰面積積分結果，Globotriose含量為51. 3%0上述質譜分析所用儀器為API 4000質譜儀，Applied Biosystems MDS kiex(加拿大)；氣質分析所用儀器為安捷倫氣質聯用儀Agilent 5975C (美國)。實施例2如實施例1所述寡糖Globotriose的制備方法，不同之處在于1)利用GenBank登錄號為AF406640的基因，按照專利ZL200510044898. 3所述方法制得α-半乳糖苷酶。2)所述的磷酸緩沖液均含有5% (質量百分比)的甘油。
權利要求
1.一種寡糖Globotriose的制備方法，步驟如下(1)分別用磷酸緩沖液配制濃度為0.IM的對硝基苯-a -D-半乳糖苷溶液、濃度為 0. IM 0. 5Μ的乳糖溶液和濃度為5 20U/ml的α -半乳糖苷酶溶液；(2)將步驟(1)制得的對硝基苯-a-D-半乳糖苷溶液、乳糖溶液和α-半乳糖苷酶溶液按體積比1 1 8的比例混合，37°C水浴中反應1 5小時，100°C煮沸，得Globotriose 反應液I ；(3)將步驟(2)制得的Globotriose反應液I用等體積的乙酸乙酯萃取1 2次，收集下層的水溶液，在35°C 45°C的條件下旋轉蒸發30分鐘去除乙酸乙酯，得Globotriose 反應液II ；(4)將步驟(3)制得的Globotriose反應液II按照6 8%質量體積比的接種量加入酵母菌細胞，在觀 30°C、150 180轉/分培養M 36小時，離心，取上清，得 Globotriose 反應液 III ；(5)將步驟(4)制得的Globotriose反應液III按每毫升1 2毫克的用量加入活性炭，室溫攪拌1小時，0. 4μπι的濾膜過濾，去上清，然后加入與Globotriose反應液III等體積的3% (質量百分比)乙醇重懸，室溫攪拌1小時，0.4μπι的濾膜過濾，去上清，再按 Globotriose反應液III的二分之一體積加入20% (質量百分比)乙醇重懸，室溫攪拌1 小時，0. 4μ m的濾膜過濾，收集上清，冷凍干燥，即得寡糖Globotriose產品。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的α-半乳糖苷酶溶液由具有α (1 — 4)糖苷鍵合成活性的α -半乳糖苷酶配制。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，α-半乳糖苷酶通過專利 ZL200510044898. 3所述基因序列或GenBank登錄號為AF406640的基因序列按照專利 ZL200510044898. 3所述方法制得。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的磷酸緩沖液濃度為 0. 05Μ 0. 5Μ, ρΗ 值為 5. 5 8. O。
5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的磷酸緩沖液是濃度為 0. 05Μ的磷酸鈉緩沖液，ρΗ值為8. O。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的乳糖溶液濃度為 0. 5Μ。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟O)中100°C煮沸后，還包括 12000轉/分離心10分鐘的離心步驟。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中的酵母菌細胞通過如下方法制得采用YPD培養基培養乳酸克魯維酵母細胞，該菌株在美國標準菌種收藏所編號為=ATCC NO. 8563，在培養30 40小時，12000轉/分離心3 10分鐘，即得。
9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，上述YPD培養基組分如下，均為重量百分數2%葡萄糖，2%蛋白胨，酵母粉，ρΗ自然。
全文摘要
本發明涉及一種寡糖的制備方法，特別涉及一種利用α-半乳糖苷酶合成寡糖Globotriose的方法，屬于寡糖合成技術領域。本發明利用α-半乳糖苷酶以對硝基苯-α-D-半乳糖苷為糖基供體，以乳糖為受體，一步轉糖基反應合成寡糖Globotriose。該方法所需要的底物價格便宜，易于獲得，且反應條件溫和，操作簡便，大大降低了Globotriose的生產成本，適合于Globotriose的大規模合成，具有潛在的應用前景。
文檔編號C12P19/14GK102154411SQ201110002979
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者盧麗麗, 張麗麗, 肖敏, 范樹泉 申請人:山東大學