專利名稱：用于檢測恙蟲病東方體的引物對和使用所述引物對的檢測方法
技術領域：
本發明涉及用于診斷恙蟲病東方體(Orientia tsutsugamushi)的引物對和使用所述引物對的診斷恙蟲病東方體的方法，更具體而言，本發明涉及能夠對恙蟲病東方體(弓丨發恙蟲病(scrub typhus)的原因)的16s核糖體RNA基因的堿基序列進行擴增的引物對和使用所述引物對通過對恙蟲病東方體進行檢測的恙蟲病檢測方法。
背景技術：
恙蟲病為一種急性熱病(febrile disease)，該病通過感染了恙蟲病東方體的恙螨進行傳播，并由于系統性血管炎而顯示出特征性的臨床癥狀。嚙齒動物為主要宿主,幼螨(恙螨)為宿主和媒介。自恙蟲病1951年首次在韓國報道以來，這種主要的秋季熱病已蔓延至全國各地，特別是在九月至十一月期間。尤其是，已發生了如此之多的病例，以至于秋季中30%的患者都被診斷為恙蟲病。恙螨叮咬后的1-2周內將產生如下癥狀:例如發熱、發冷、頭疼、肌肉疼痛和紅斑性丘疹。對產生的特征焦痂的檢測將有助于該疾病的早期診斷。通常，這一疾病的發展并不嚴重，并且抗生素對該疾病很有效。然而，如果發生延誤診斷，則可產生如下形式的并發癥:肺炎、急性腎衰竭、腦膜炎、腦炎、上胃腸道出血、多器官功能障礙、或者甚至更糟的心肌梗死或中風。這些并發癥可能是致命的，因此快速而準確的診斷是改善患者預后所必不可少的。到目前為止，用于診斷恙蟲病的方法包括如下方法:例如，通過培養以確認恙蟲病東方體的方法、通過 對患者血清中的抗恙蟲病東方體的抗體進行檢測的方法、以及通過PCR(聚合酶鏈式反應)擴增對從患者血液中分離的恙蟲病東方體的DNA進行檢查的方法。在這些方法中，通過對恙蟲病東方體進行培養的診斷方法需要至少幾周來培養恙蟲病東方體，這表明這一方法實際上不適合用于診斷患者的目的。所以，最常見的診斷方法為間接熒光抗體技術和免疫酶技術，其均為血清學檢測方法。然而，上述方法仍具有如下缺點:由與其它病原微生物的交叉反應所造成的假陽性；從疾病癥狀開始后直至形成抗體需要幾天，導致該疾病早期測試的低靈敏度；以及需要額外的跟蹤測試來對診斷進行確認。介紹了恙蟲病的另一診斷方法，該方法是通過PCR對來自患者血液的恙蟲病東方體特異性DNA進行檢測、以在恙蟲病的早期階段對其進行快速診斷的方法。PCR的實例包括:常規PCR ;或巢式PCR，巢式PCR通過對常規PCR進行改進而得到，并顯示出高于常規PCR100倍的靈敏度；或實時PCR，在實時PCR的過程中，可在2小時內快速確認結果。在恙蟲病的常規PCR診斷中，已嘗試了使用各種靶蛋白基因(如47kDa、56kDa和groEL等)的PCR，相比常規PCR，更優選巢式PCR或實時PCR。因為當使用47kDa或56kDa基因作為靶標來進行常規PCR時，靈敏度低至至多10%。然而，巢式PCR具有如下缺點:由于將PCR進行了兩次來增加靈敏度，因而確實需要比其它PCR更長的測試時間。同時，實時PCR具有如下缺點:由于需要非常昂貴的測試設備，在大多數醫療機構普遍使用方面存在局限。因此，迫切需要開發一種新的診斷方法，所述診斷方法相當簡單而且低成本，并呈現高靈敏度和特異性。
發明內容
技術問題本發明人試圖開發新的方法來對來自患者血液樣品的恙蟲病東方體進行方便易行的檢測。結果，本發明人通過確認了如下內容而完成了本發明:通過對恙蟲病東方體的16s核糖體RNA基因序列的一部分進行特異性擴增，甚至用現有的常規PCR，也能夠實現高度準確的診斷。因此，本發明提供了恙蟲病東方體的檢測方法，該方法通過使用常規PCR對恙蟲病東方體的16s核糖體RNA基因進行擴增。本發明的新方法克服了在常規PCR中靈敏度在10%以內的問題，同時還克服了在巢式PCR中進行兩次或更多次PCR而導致需要更多工作量和時間以及高的污染潛在可能性的問題，并克服了在實時PCR中需要昂貴設備的問題。因此，本發明的方法在成本-工作量的效益方面是出色的方法，所述方法還提供了可與上述PCR相比擬的診斷準確度。技術方案為了實現上述目的，本發明人設計了恙蟲病東方體的檢測方法，以對恙蟲病東方體的16s核糖體RNA基因序列進行擴增和鑒定。這一方法可通過制備能特異性擴增恙蟲病東方體的16s核糖體RNA的引物而實現。以從感染有恙蟲病東方體Boryoung菌株(該菌株在韓國非常常見)的患者的血液樣品中擴增的16s核糖體RNA基因的堿基序列為基礎來設計制備所述引物。因此，本發明的目的是提供用于診斷恙蟲病的方法和用于檢測恙蟲病東方體的方法，其特征在于，所述方法包括在疑似患有恙蟲病的患者的血液樣品中使用16s核糖體RNA的引物擴增靶蛋白基因的步驟。本發明的另一目的是提供用于對恙蟲病東方體進行檢測的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒包含所述引物。本發明的上述以及其它目的、特征和優點將在以下對優選實施方式和權利要求的描述中變得顯而易見。有益效果 本發明涉及用于診斷恙蟲病的方法，更具體而言，本發明涉及能夠擴增恙蟲病東方體(引起恙蟲病的原因)的16s核糖體RNA基因的堿基序列的引物和使用所述引物對恙蟲病東方體進行診斷和檢測的方法。與通過擴增47kDa、56kDa和groEL基因進行分析的傳統方法相比，本發明的診斷方法具有出色且高的診斷準確度。同時，當將本發明的引物用于常規PCR時，獲得了相對提高的診斷準確度。另外，本發明的方法不僅在診斷準確度方面優于巢式PCR或實時PCR，而
且還簡單便宜。
圖1 為利用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線來闡釋對如下檢測方法的診斷效率進行比較的圖:使用由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2表示的序列(來源于本發明的16s核糖體RNA)組成的引物對的恙蟲病東方體檢測方法；以及比較例1-6中的傳統檢測方法。
具體實施例方式本發明涉及恙蟲病的診斷方法。更準確而言，本發明涉及使用PCR引物對恙蟲病東方體(引起恙蟲病的原因)的16s核糖體RNA基因的堿基序列進行擴增的恙蟲病東方體檢測方法。本發明還提供了用于擴增恙蟲病東方體(引起恙蟲病的原因)的16s核糖體RNA基因的喊基序列的PCR引物。本發明還提供了用于對恙蟲病東方體進行檢測的PCR試劑盒，所述PCR試劑盒包含所述引物。下文對本發明進行詳細描述。本發明的特征在于制備PCR引物對來對恙蟲病東方體的16s核糖體RNA基因進行擴增，以及對使用所述引物擴增的16s核糖體RNA基因進行檢測。基于從感染有恙蟲病東方體Boryoung菌株(該菌株在韓國非常常見)的患者的血液樣品中擴增的16s核糖體RNA基因的堿基序列來設計本發明的引物。所述引物還可對其它模式菌株(如Gilliam、Karp、Kato)和各種其它菌株進行檢測。本發明的特征 還在于通過使用所述引物擴增靶蛋白基因，所述靶蛋白基因為來自恙蟲病疑似病例的血液樣品中的16s核糖體RNA基因。PCR為聚合酶鏈式反應的簡稱。PCR包括所有PCR:最常見的常規PCR、雙重PCR和巢式PCR (連續運行兩次PCR)、以及高成本的實時PCR (在實時PCR過程中，可實時確認結果)，最優選包括常規PCR。本文中用于檢測的PCR試劑盒可包括用于PCR的材料，例如參與聚合的酶、dNTP、緩沖液、礦物油、標準標記物、染色劑溴酚藍或二甲苯FF以及用于擴增恙蟲病東方體的16s核糖體RNA基因的PCR引物對。實施例如下實施例中所示的本發明實踐的以及目前優選的實施方式僅用作說明。然而，可以理解的是，本領域技術人員在基于這一公開的考慮上可進行修改和改進，所述修改和改進在本發明的精神和保護范圍之內。實施例1:引物制備基于從感染有恙蟲Boryoung菌株(該菌株在韓國非常常見)的患者的血液樣品中擴增的16s核糖體RNA基因的堿基序列來設計引物對，然而，還可對其它模式菌株(如Gilliam、Karp> Kato)和各種其它菌株進行檢測。更具體而言，將所述引物對制備為用于GenBank登錄號banki11356164HM352765:恙蟲病東方體Boryoung基因型的正向引物(403-428位)和反向引物(577-601位)，其分別由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2表示。還制備了用于其它區域的正向引物和反向引物，所述引物分別由SEQ.1D.N0.3-SEQ.1D.N0.36表示(參見表I)。[表I]
權利要求
1.一種用于對恙蟲病進行診斷的引物對，所述引物對由選自于由如下序列所組成的組中的兩種序列組成: 由SEQ.1D.N0.1-SEQ.1D.N0.36表示的寡核苷酸序列；以及 與上述序列具有至少90%同源性的、至少為18mer的序列。
2.根據權利要求1所述的用于對恙蟲病進行診斷的引物對，所述引物對由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2所示的序列組成。
3.一種使用權利要求1所述的引物對的恙蟲病診斷方法。
4.根據權利要求3所述的恙蟲病診斷方法，其中，所述引物對由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2所示的序列組成。
5.根據權利要求3或4所述的恙蟲病診斷方法，所述方法包括用聚合酶鏈式反應(PCR)對恙蟲病東方體進行檢測。
6.根據權利要求3或4所述的恙蟲病診斷方法，其中，所述對恙蟲病東方體進行檢測包括下列步驟: 對恙蟲病東方體 的16s rRNA基因的序列或所述序列的一部分進行擴增；以及 對其進行鑒定。
7.根據權利要求5所述的診斷方法，其中，所述聚合酶鏈式反應(PCR)為常規PCR。
8.一種用于對恙蟲病東方體進行檢測的PCR試劑盒，所述試劑盒通過擴增16s rRNA基因的序列或所述序列的一部分對恙蟲病東方體進行檢測，所述試劑盒包含權利要求1或2所述的引物對。
9.一種用于對恙蟲病東方體進行檢測的PCR試劑盒，所述試劑盒通過擴增16s rRNA基因的序列或所述序列的一部分對恙蟲病東方體進行檢測。
10.一種用于對恙蟲病東方體進行檢測的PCR試劑盒，所述試劑盒通過擴增16srRNA基因的序列或所述序列的一部分對恙蟲病東方體進行檢測，所述試劑盒包含由SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2所示的序列組成的引物對。
全文摘要
本發明涉及恙蟲病的診斷方法，更具體而言，本發明涉及通過對恙蟲病東方體(引起恙蟲病的原因)進行檢測的診斷方法，所述方法包括如下步驟基于恙蟲病東方體的16s核糖體RNA基因序列制備引物對；然后使用所制備的引物對對恙蟲病東方體進行檢測。本發明的診斷方法不僅顯示出高于其它傳統方法(對47kDa、56kDa和groEL進行擴增和分析的方法)的診斷準確度，而且還非常簡單方便，這表明所述方法在成本效益方面很出色。
文檔編號C12Q1/68GK103080312SQ201080068717
公開日2013年5月1日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年6月24日
發明者金東民 申請人:朝鮮大學校產學協力團