專利名稱：通過用自體血清培養自體角質形成細胞和成纖維細胞來生產用于生成皮膚的自體皮膚片 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于形成皮膚敷料或片的方法，所述皮膚敷料或片用于對患者中的皮膚損失進行覆蓋、使其治愈、結斑、減輕。特別地，本發明涉及用于在實驗室中實施的生產皮膚的方法。
背景技術：
目前，深度燒傷以及由不同創傷或疾病引起的其他皮膚組織損失造成皮膚損傷， 這些損傷需要對這些區域進行護理覆蓋。已經用直接獲自患者自身皮膚的皮膚移植物實施這種覆蓋。該方法盡管有效，但在獲得所述移植物的區域(大腿、背部、臀部)中產生顯著的瘢痕(照片I)。此外，該方法必須在實施了全麻或局麻的外科手術中進行，這產生了任何外科手術所固有的并發癥，例如嚴重的疼痛、感染、以及出血、新的手術、以及死亡(盡管百分率非常低)。此外，這還意味著較高的額外經濟花費，例如住院、為治愈而進行的會診、 治療供體區域的瘢痕、用于手術的特殊材料以及將患者轉移到更綜合的醫院，等。
皮膚撕脫傷造成對皮膚上皮組織的損傷，導致細胞損失，其在體內條件中被用成纖維細胞(其充當飼養層(alimentadora))產生的纖維基質替換。有多個報道涉及角質形成細胞培養物用于構建皮膚再生片，所有這樣的報道都述及供體所提供的或來自尸體的細胞(異體的)，這意味著對供體和受體兩者實施多項研究，培養在胎牛血清中，這使得該產品昂貴且在發展中國家中不可行，因此，角質形成細胞培養物在患者自身的血清(自體的) 中發育，在作為飼養層的同一患者的成纖維細胞(自體的)上，并且使用同一患者的角質形成細胞(自體的)，因此當覆蓋出血的區域時避免了免疫和排斥反應，因此提高了侵襲性過程中皮膚的生存力，并且通過該方法在非常短的時間內獲得了完全的上皮化(皮膚生長)， 結果良好且成本很低。
因此，用于覆蓋受影響區域的替代機制一直是世界范圍內的研究目標。在該范圍內，用于生成皮膚的方法尤為突出，其允許替換損失的皮膚并且避免整個前述創傷。到目前為止，已使用來自尸體的細胞開發了此類方法，但該方法有一些缺陷，因為使用來自尸體的細胞在很多情況中產生免疫反應，這可產生組織排斥和令人不太滿意的結果。此外，這些方法的成本是非常高的，因為使用來自尸體的皮膚意味著實施多種免疫相容性檢查等，以排除接觸傳染病(例如HIV和肝炎)的可能性。
發明簡述
自2008年起，一組外科醫生和整形外科醫生開始了這樣的任務尋找用于生成皮膚而又避免前述并發癥的方法。因此，他們決定研究這樣的方法由受影響者的非常小份 (3mm)的皮膚生成皮膚，因此確保了使用所培養組織的益處并且避免了不相容風險、高成本和額外疤痕的缺點。
我們由取自患者皮膚的細胞生成皮膚的方法的優點對于全世界的科學以及整形外科和醫學的未來具有非常重要的意義。其中，重要的是突出以下優點
1.該方法不生成除皮膚損傷以外的額外疤痕，因為從患者中盡可能少地且從不可見的位置取出皮膚。
2.不引起患者的創傷，因此不產生疼痛。
3.不具有免疫排斥問題，因為所使用的組織取自同一患者。
4.不需要將該方法作為手術實施。
5.該方法可由任何專業的護士和醫生來操作。
6.治療患者的醫院不必要求用于取皮膚的特殊材料(稱為取皮機(Dermatome)) 及其切割儀器，因為僅可使用一次，所以它們成本不利。這些產品對于本發明的皮膚培養方法來說不是必須的。
7.生產成本比來自尸體的皮膚便宜約80%，并且美學結果要好得多。
8.生產和經銷成本比在20X20cm面積上外科操作的成本低50%。
經過基本的培訓之后，該方法在世界上任何地方(包括發展中國家)都是可重復的，因為所有所使用的材料是任何實驗室中常用且基本的那些。
下文中給出的簡要比較分析將顯示鑒于本發明的多個實施方案的現有技術。所述分析的目標是突出本發明的優點，其賦予用于獲得請求保護之專利主題的必要特征。
有充足的文獻說明現有技術，其中很詳細地描述了所使用的方法并且以所引用的文獻為基礎，可與實現上述公開結論的本發明進行詳細的比較。下文中將給出所述參考文獻，其可供參考。
自很久以前就開發了用于細胞培養物的不同方法，所述細胞培養物用作出血皮膚區域的覆蓋物和/或皮膚代用品。本發明產品的新穎性在于使用同一患者的血清(自體的)由自體細胞產生，在僅三天內獲得皮膚的層。在另一種方法中，我們發現
1.人皮膚等同物
A.供體或尸體細胞培養物
該方法不同于本發明中所開發的方法，在于樣品由尸體或供體的皮膚部分提供， 并且通過低溫和防腐處理需要多種化學物質和化合物，儲存冷凍的皮膚部分用于以后在對其有需要的患者中應用。這需要對供體和患者的免疫研究以降低排斥風險。主要差異在于
權利要求
1.一種利用皮膚產生片或敷料的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟I-*第0天A-獲得自體皮膚和血液樣品；B-消化所述皮膚18小時；C-從患者的血液中獲得自體血清；II-*第1天D-將自體皮膚的兩層分離；E-將在消化之后獲得的獲自自體皮膚淺表層的角質形成細胞在自體血清中培養和復 制 72h ；F-培養和復制在消化之后所產生的獲自深層的自體成纖維細胞；III-*第 2 天G-更換自體角質形成細胞的培養基；IV-*第3天H-將成纖維細胞接種在膠原網上；I-將所培養的角質形成細胞在成纖維細胞和膠原網上接種24h ；V-*第4天J-獲得用于將其自身放置在對其有需要的個體上的最終產品例如皮膚片或敷料。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟I-A包括以下步驟.1.從患者獲得皮膚樣品，其具有2mm2至4mm2、優選3mm2的面積和0.30mm至0. 65mm的厚度，.2.從需要所述(自體的)皮膚的個體獲得量為約20 50cm3的血液樣品。
3.根據權利要求1或2之一所述的方法，其特征在于所述步驟I-B包括以下步驟.3.用約2cm3至10cm3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗所獲得的皮膚樣品；.4.在4°C下將所述自體皮膚樣品在0.25%胰蛋白酶溶液中放置18小時。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-C包括以下步驟.5.將所述自體血液樣品以1200rpm離心10分鐘，獲得10cm3至25cm3血漿；.6.在4°C下儲存所述血漿；.7.通過添加2cm3至5cm3DMEM_HG(Dulbecco改良的Eagle培養基-高葡萄糖)、2cm3 至5cm3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和0.5cm3至2cm3 10, 0001. U.青霉素、10mg硫酸鏈霉素以及 25/-lg兩性霉素B使所應用的胰蛋白酶失活。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-D包括以下步驟.8.隨后在鑷子的幫助下將自體皮膚(外植體)分離成兩層淺表的表皮和包含膠原纖 維的深層真皮；.9.用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)分別清洗所述外植物(兩個皮膚層)多次(3至10次)。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-E包括以下步驟.10.將皮膚的淺表部分收集在無菌管中；.11.將所述管以1200rpm離心10分鐘；.12.棄去上清液；.13.將所產生的細胞沉淀重懸于5cm3至10cm3DMEM-HG培養基(Dulbecco改良的Eagle培養基_高葡萄糖)中；.14.將包含在該液體中的細胞以約75，000至90，000個細胞/cm2的密度接種在無菌盒中；.15.通過在Neubawer室中進行細胞計數來核實細胞密度；.16.將所接種的細胞(角質形成細胞)在37°C下儲存24小時。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-F包括以下步驟 10’ -在步驟9之后，將在消化之后獲得的自體皮膚的深部接種到無菌盒中；.11’ -添加2cm3至5cm3DMEM_HG (Dulbecco改良的Eagle培養基-高葡萄糖)和2cm3至 5cm3從需要皮膚之個體的血液中獲得的血漿；.12’ -將所得物在37°C下儲存48小時以使成纖維細胞生長；.13’ -在48小時之后將所接種和儲存的成纖維細胞提取并放置在無菌管中；.14，-將所述管以1200rpm離心10分鐘；.15’ -棄去上清液；.16’-向細胞沉淀中添加2cm3至5cm3DMEM_HG(Dulbecco改良的Eagle培養基-高葡萄 糖)和2cm3至5cm3從需要皮膚之個體的血液中獲得的自體血漿。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-G包括以下步驟.17.儲存24小時之后提取角質形成細胞培養物的培養液或培養基；.18.再次應用2cm3至5cm3DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle培養基-高葡萄糖)以及 lcm3至10cm3自體血衆(源自患者的血液)；.19.再次在37°C下儲存24小時。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-H包括以下步驟.20.將步驟16’中所獲得的產品接種在所需大小的膠原網上；.21.核實自體成纖維細胞具有90%融合；.22.將該網置于振動臺上最少4小時；.23.再次在37°C下儲存最少20小時。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述步驟I-I包括以下步驟.24.在更換培養基并對其進行儲存24小時之后，使用2cm3至10cm3磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)從所述盒中分離角質形成細胞；.25.將具有細胞的該液體放置在無菌管中并以1200rpm離心10分鐘；.26.棄去由離心所產生的上清液；.27.將細胞沉淀重懸于5cm3至10cm3自體血漿中；..28.將浸入血漿中的角質形成細胞接種到成纖維細胞和膠原網上，同時核實它們具有 250，000個細胞/cm2的密度；.29.將所接種的細胞在37°C下儲存24小時；.30.然后觀察融合和細胞在膠原敷料上的附著從而獲得充足的自體組織皮膚層。
11.一種片或敷料，其特征在于其包含網基質，在所述網基質上放置膠原，隨后放置角 質形成細胞并且隨后放置成纖維細胞。
12.根據權利要求11所述的片或敷料，其特征在于使用權利要求1至10中任一項的方 法產生所述角質形成細胞和成纖維細胞。
全文摘要
該方法一般是基于從患者取皮膚樣品和血液樣品并且基于這兩種要素培養皮膚，置于膠原片上以產生敷料，隨后將所述敷料置于對其有需要的患者上。
文檔編號C12N5/071GK103003415SQ201080067724
公開日2013年3月27日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者胡安·卡洛斯·桑布拉諾比格爾, 珍妮弗·克里斯蒂娜·高納席爾瓦 申請人:羅德里戈·福西翁·索托帕雷哈, 胡安·卡洛斯·桑布拉諾比格爾, 珍妮弗·克里斯蒂娜·高納席爾瓦