用于結直腸癌血漿中的微rna表達譜分析的組合物和方法

專利名稱：用于結直腸癌血漿中的微rna表達譜分析的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用于結直腸癌(colorectal cancer)血衆中的微RNA(microRNA)表達譜分析的組合物和方法。
背景技術：
結直腸癌(CRC)是最重要的人類癌癥，全世界在2008年就有 1041200個新病例。其是世界上第三大最常見癌癥以及第四大引起癌癥死亡的原因。(Gry.R.etal. (1997))Curr Probl Cancer 21, 233-300 ；Petersen, G.M.et al. (1999)Cancer86,254002550)。如果能在早期階段診斷，CRC是可以治愈的。在早期階段，大部分病人是沒有疾病的臨床癥狀的，因此有必要進行早期CRC的篩查。證據表明早期結直腸癌的發現可以很大程度上降低疾病的發生率和死亡率(Anwar, R. (2006)Digestive and LiverDisease 34, 279-282)。 最初CRC的特征是結腸上皮的過度增生(異型性)，其先轉變成炎癥性的腺瘤性息肉，然后轉變成結直腸粘膜的異常新生物腺瘤(即良性腫瘤)。通常情況下，只有小部分形成的腺瘤(60歲病人的發生率是60-70% )發展成惡性腺癌。超過95%的CRC病例表現為腺癌(Muto, T. et al. (1975) Cancer36, 2251-2270 ；Fearon, E. R. and Vogelstein, B. (1990)Cell 61,759-767)。現有的CRC標準篩查方法包括結腸鏡和糞便隱血測試。但是這兩項測試都有嚴重的缺陷。結腸鏡檢查是有效的，但是多數人因為其高費用、帶來的很大不適以及潛在的更多副作用而不愿意接受這項檢查。另一方面，糞便隱血測試簡單且花費低卻相對不夠準確。然而，目前還沒有使得能夠可靠地診斷CRC的特異性的分子標記，尤其是對于表現為腺癌的CRC和/或良性腺瘤所發展成的惡性腫瘤。因此，新的生物標記的發現具有最重要的臨床效用，尤其是這些標記早期診斷腫瘤的發展，以便使癌癥得到早期治療并避免不必要的外科干預。理想情況下，這些標記應該使得能夠發現處于原位技術或者活檢或切除物顯微鏡分析不能發現惡性細胞時期的癌癥。一些診斷方法也因為其分析基于單一分子標記而影響檢測的可靠性和/或精確性而受限。此外，單一的標記通常不能詳細預測相關潛伏期階段、腫瘤進展和類似情況。因此，還有待于替代分子標記和檢測方式的發現以便克服這些障礙。一個解決這個問題的方法可能基于小的調節性RNA分子尤其是微RNA(miRNA)，其組成了進化保守的內源性表達的小型非翻譯性的長度為20-25核苷酸(nt)的RNA。從10年前發現以來，認為其可介導目標mRNA的表達并因此具有參與細胞發生、分化、增殖和凋亡的重要功能。(Bartel, D. P. (2004) Cell 116, 281-297, Ambros, V. (2004) Nature431，350-355 ；He. L. etal. (2004) Nat Rev Genet 5，522-531)。此外，作為 25 種癌癥生物標記，miRNA由于在體外很穩定且在體內長壽而相較于mRNA更具有優勢(Lu，J. etal. (2005)Nature 435, 834-838 ；Lim, L. P. et al. (2005) Nature 433,769-773)。miRNA來源于初級轉錄過程中由RNase III Drosha加工成的莖環結構前體(pre-miRNA)。運輸到胞衆以后,另一種稱為Dicer的RNaseIII將pre_miRNA發夾環切成短的雙鏈RAN(dsRNA),其中一條鏈成為miRNA蛋白(miRNP)中的成熟miRNAomiRNA引導miRNP到其能發揮功能的目標 mRNA (Bartel, D. P. (2004) Cell 23，281-292 ；He, L. and Hannon, G.J. (2004) Nat Rev Genet 5,522-531)。根據miRNA和目標的互補程度，miRNA可引導不同的調控過程。與miRNA高度互補的目標mRNA被與干擾RNA(RNAi)相同的結構特異性地切割。因此,在這種情形下,miRNA的作為小干擾RNA(SiRNA)發揮功能。與miRNA互補程度較低的目標mRNA同樣被引導到細胞退化通路或者在不影響mRNA水平的的情況下被翻譯抑制。但是，miRNA抑制目標mRNA的翻譯的機制仍然具有爭議。現有數據表明miRNA可作為腫瘤基因或者腫瘤抑制基因而在癌癥中發揮作用，例如癌癥中過度表達的mir-17-92可能作為腫瘤基因發揮功能并通過下調腫瘤抑制基因和/或控制細胞分化或凋亡的基因從而促進癌癥的發展。同樣，let-7a的低表達，其發揮腫瘤抑制基因功能，可能通過調控腫瘤基因和/或控制細胞分化或凋亡的基因從而抑制癌癥(Zhang，B. (2007) Dev Biol 302, 1-12) 0表明它們在癌癥發生和發展中發揮作用。高通量miRNA定量技術例如miRNA微陣列，基于實時RT-PCR的TaqMan miRNA 測定等等為研究整個癌基因組的整體miRNA譜提供了有力手段。越來越多的證據表明多種miRNA在人類癌癥包括白血病、淋巴瘤、膠質母細胞瘤、結腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌和卵巢癌中表現異常，且在正常組織和癌組織中表達情況不同。(Zhang, L. 25 (2008) Adv Exp Med Biol 622,69-78)。因此，miRNA 譜被用作發現多種癌癥的標志，表明其將有助于進一步確定分子診斷、預后和治療。人類癌癥中異常的miRNA表達表明這些miRNA作為生物標記和分子治療目標的潛力。在多種可能類型的樣本中，血液被認為是篩查高風險個體的理想樣本，由于其可以通過最小侵入方式收集到，可以早期發現、診斷、監測和有效治療癌癥。已經表明腫瘤來源的miRNA可通過內源性RNase的作用保護下以非常穩定的形式存在于人類血漿或者血清中。這些血漿或血清中腫瘤來源的miRNA可作為發現癌癥的生物標記并達到可測的水平。此外，血漿和血清的miRNA水平相關性大，表明血漿或者血清樣本都可以用來作為臨床以miRNA作為癌癥預后的生物標記的樣本選擇類型(Mitchell, P. S. et al. (2008)ProcNatl Acad Sci USA 105, 10513-10518 ；Gilad, S. et al. (2008)PLoSONE 3，e3148 ；Chen, X.et al. (2008)Cell Res 18,997-101006)。一些研究報導了人類結直腸癌病例的血漿或血清中的miRNA表達譜(Chen，X.(2008) Cell Res 18，997-1006 ;Ng, Ε· K. O. (2009)Gut 58，1375-1381 ;Huang, Ζ· 2009，IntJ Cancer, published on line)。在健康個體中發現超過 100 種循環 miRNA (Mitchell, P.S. (2008)Proc Natl Acad Sci USA105, 10513-10518)，并且此譜與具有多種腫瘤特異性miRNA的結直腸癌病人的miRNA譜有很大不同。Chen等人證明了存在于結直腸癌病人血清中而不存在于正常對照組血清中的69種miRNA (Chen, X. (2008) Cell Resl8, 997-1006)。此外，他們發現了存在于結直腸癌而不存在于另外的癌癥組(肺癌)血清中的14種miRNA的獨特表達譜。Ng等人的研究表明miR-92在CRC病例的血漿中顯著升高，并且具有作為CRC篩查的非侵入性分子標記的潛力(E. K. 0. (2009)Gut 58,1375-1381)。此外，Huang等人發現血漿miR-29a具有作為早期發現CRC的新的非侵入性生物標記的很大潛力(Huang, Z. 2009, Int J Cancer, published on line)。但是，另一項研究發現 has_miR-92a在急性白血病病人血漿中顯著下降，并且血漿中miR-92a/miR-638比例具有作為檢測白血病的新生物標記的很大潛力(Tanaka, M. et al. (2009) PLoS ONE 4，e5532)。但是，由于缺乏足夠的敏感性和特異性，單一的miRNA不適于作為準確的診斷生物標記用于臨床應用。因此，仍然有必要發現一組結直腸癌病人血漿中或者血清中診斷miRNA標記。結合多種miRNA生物標記的基于血液的miRNA譜(特征)的確定會使非侵入性、快速的、精確的且經濟的確定結直腸癌病人的方法成為可能。此外，還一直需要在高風險個體中針對早期階段的相應方法即結直腸癌篩查、癌癥復發的早期檢測、和/或監測癌癥治療。發明目的和概述本發明的目的是提供用于診斷結直腸癌、監測癌治療、和/或治療結直腸癌的新方法，其中通過測定血中的多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA(miRNA)序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在結直腸癌的血漿中經分析與健康對照相比和/或與健康個體、肝細胞癌和肺癌相比差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，該核酸表達特征是結直腸癌存在的指征，其中所述核酸表達特征包括腫瘤相 關特征(tumor-related signature)和血衆特異性特征(plasma-specific signature)。此外，本發明的目的是提供用于在展現結直腸癌的血液中鑒別一或多種核酸表達特征的相應方法。更具體地，本發明的目的是提供用于與健康對照、和/或健康個體、肝細胞癌和肺癌相比較來區分結直腸癌的方法。這些及其它目的從以下描述將變得清楚，其通過獨立權利要求的主題來達成。本發明的一些優選實施方案則通過從屬權利要求的主題來限定。在第一方面，本發明涉及用于鑒別一或多種展現出結直腸癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子源于腫瘤相關或血漿特異性特征，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征是結直腸癌存在的指征。本文限定的核酸表達特征可包括至少35種核酸分子，優選至少12種核酸分子，特別優選至少6種核酸分子。在優選的實施方案中，所述核酸表達特征包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康對照相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康對照相比被下調。在優選的實施方案中，所述核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa-miR-409_3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsamiR_301a、hsa-miR-342_3p、hsa_miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsamiR-187*、hsa_miR-92a、hsa_miR-19a、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-17、hsa-miR-140-3p、hsa_miR-30e、hsa-miR-185 ;及血衆特異性特征 hsa-mir-671_3p、hsa-mir-16_2*、hsa-miR-SOc-l^Khsa-miR-SASc-Sp'hsa-miR-lB'hsa-miR-lSa'hsa-miR-ASS'hsa-let-Ti、hsamiR-363、hsa_miR-15b、hsa-miR-101、hsa_miR-190b、hsa_miR-130a、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-345 ;和內部穩定對照hsaniR-1238和hsaniR-1228的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與一或多種健康對照相比，在所述一或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671_3p的的任意一種或多種核酸分子的表達被上調；而編石馬 hsa-miR-25、hsa-miR-93Λ hsa-miR-96Λ hsa_miR-301a、hsa-miR-342_3p、hsa_miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-187*、hsa_miR-92a、hsa_miR-19a、hsa_miR-20b、hsa_miR-20a、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-107、hsamiR-17、hsa-miR-140_3p、hsa_miR-30e、hsa-miR-185’ hsa-mir-16_2*、 hsa-miR-30c_l*、 hsa-miR-548c_5p、 hsa-miR-16、hsa_miR-15a、hsa-miR-425、hsa-let_7i、hsa-miR-363、hsa_miR-15b、hsa-miR-101、hsa_miR-190b、hsa_miR-130a、has-miR-331_3p 和 hsa-miR-345 的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228沒有變化。在更優選的實施方案中，核酸表達特征包括編碼腫瘤相關特征hsamiR-409_3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsa_miR-301a、hsa-miR-342_3p、hsa_miR-19b、hsa-miR-451 和編碼血衆特異性特征 hsa-mir-671_3p、hsa-mir-16-2*、hsa-miR-30c_l*、hsa-miR-548c-5p的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與一種或多種健康對照相比，在一種或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671_3p的任意一或多種核酸分子表達被上調；而編碼 hsa-miR-25、hsamiR-93、hsa-miR-96、hsa_miR-301a、hsa-miR-342_3p、hsa_miR-19b、hsa-miR-451、hsamir-16-2*、hsa-miR-30c_l* 和 hsa-miR-548c_5p 的任意一種或多種核酸分子表達被下調。在另一優選的實施方案中，核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa-miR-409_3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96 和血衆特異性特征hsa-mir-671_3p、hsa-mir-16-2*的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與一種或多種健康對照相比，在一種或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-409-3p和hsa-mir-671_3p的任意一種或多種核酸分子的表達被上調，而編碼hsa-miR-25 λ hsamiR-93 λ hsa-miR-96 和 and hsa-mir-16-2* 的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。在特別優選的實施方案中，核酸表達特征包括編碼hsa-miR-409_3p/hsa-miR-16-2*、 hsa-miR-409-3p/hsa_miR-96、 hsa-miR-671-3p/hsa-miR-548c_5p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-30c_l*、hsa-miR-671_3p/hsa-miR-342_3p、hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-96、hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-30la、hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa_miR-345、hsa-miR-409/hsa-miR-331_3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-331_3p、hsa-miR-671-3p/hsa_miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-93 和 hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-93 的任意一種或多種核酸分子組合。在第二方面，本發明涉及用于將結直腸癌與健康個體、肝細胞癌和肺癌的區別開的診斷試劑盒。所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種健康個體、肝細胞癌和肺癌中差異表達，而其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征是結直腸癌存在的指征。本文限定的核酸表達特征可包括至少23種核酸分子，優選至少18種核酸分子，以及更優選至少6種核酸分子。
在優選的實施方案中，所述核酸表達特征包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康個體、肝細胞癌和肺癌相比被上調；以及包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血衆中與一或多種健康個體、肝細胞癌和肺癌相比被下調。在更優選實施方案中，核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa25miR-409-3p、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-33b*、hsa-miR-7、hsa-miR-196b、hsa-miR-93、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-25、hsa_miR-92a、hsa_miR-19b ;血衆特異性特征 hsa-miR-67l_3p 和hsa-miR-16—2*、hsa_miR-92b、hsa—miR-129*、hsa—miR-563、hsamiR—602、hsa—miR-1227、hsaniR-196a和內部穩定對照hsaniR-1238和hsaniR-1228的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與健康個體、肝細胞癌和肺癌相比，一或多種目標血漿中編碼 hsa-miR-409_3p、hsa-mir-671_3p、hsa_miR-33b*、hsa_miR-92b、hsa-miR-149、hsa—miR-129*、hsa—miR-563、hsa-miR-129_3p、hsa—miR-634、hsa-let_7b*、hsa—miR-602和hsa-miR-1227的任意一種或多種核酸分子表達被上調，而編碼hsa-miR-16-2*、 hsa-miR-7、hsa_miR-196a、hsamiR_196b、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-93、hsa-miR-25、hsa_miR-92a和hsaniR-19b的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsa_miR-1238和hsa-miR-1228 沒有變化。在更優選的實施方案中，核酸表達特征包括編碼腫瘤相關特征has-10miR-409_3p、hsa-miR-129_3p、hsa_miR-33b*、hsa-miR-7 和血衆特異性特征hsa-miR-67l_3p和hsa-miR-16-2*的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與健康個體、結直腸癌和肺癌相比，一種或多種目標血漿中編碼hsa-miR-409-3p、hsa-miR-129-3p、hsa_miR-33b*、hsa-miR-67l_3p 的任意一種或多種核酸分子表達被上調；而編碼hsa-miR-16-2*和hsa-miR-7的任意一種或多種核酸分子表達被下調。在特別優選的方案中，核酸表達特征包括編碼hsa-miR-33b*/hsa20_miR-196a、hsa-miR-92b/hsa_miR-196a、hsa-miR-563/hsa_miR-196a、hsa-miR-1227/hsa_miR-196a、hsa-miR-129-3p/hsa-miR-16_2*、 hsa-miR-129*/hsa-miR-16_2*、 hsa_miR-92b/hsa-miR-16-2*、 hsa-miR-129*/hsa_miR-196a、 hsa-miR-1227/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-129-3p/hsa_miR-196a、 hsa-miR-602/hsa_miR-196a、 hsa_miR-33b*/hsamiR-16-2*、hsa-miR-563/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-129*/hsa_miR-7、hsa_miR-33b*/hsa25_miR-7、hsa-miR-563/hsa_miR-7、hsa-miR-602/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-129_3p/hsamiR-7、 hsa-miR-92b/hsa_miR-7、 hsa-miR-1227/hsa_miR-7、 hsa_miR-33b*/hsa_miR-196b、hsa_miR-l 227/hsa_miR-196b、hsa-miR-92b/hsa_miR-196b 和 hsa-miR-602/has-miR-7的任意一種或多種核酸組合。第三方面，本發明涉及用于鑒別一或多種展現出結直腸癌的血漿的方法，所述方法包括(a)在所述一或多種目標血漿中確定多種核酸分子的表達水平，每種核酸分子編碼微RNA序列；(b)在一或多種健康對照血漿中確定所述多種核酸分子的表達水平；(c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑒別出在所述目標血漿和對照血漿中差異表達的一或多種核酸分子，其中所述差異表達的一或多種核酸分子一起代表本文所定義的特征(signature),其是結直腸癌存在的指征。在本發明的優選實施方案中，所述方法包括(a)在一或多種目標血漿中確定核酸分子組合的表達水平，每種核酸分子均編碼微RNA序列，并用特定的公式計算；(b)在一或多種健康對照血漿中確定所述核酸分子組合的表達水平，并用特定的公式計算；以及(C)通過比較在(a)和(b)步驟中所獲得的各自的表達水平來鑒別所述組合在所述一或多種目標血衆中的差異，其中一或多種差異表達的組合一切代表特征，其表明結直腸癌的存在。在更優選的實施方案中，本方法進一步用于將結直腸癌與健康個體、肝細胞癌和肺癌區別開。第四方面，本發明涉及用于監測結直腸癌治療的方法，所述方法包括(a)通過使用本文所定義的方法在一或多種目標血漿中鑒別核酸表達特征；和(b)在血液中監測所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述監測以如下的方式進行，即其血漿中的表達在治療前被上調的核酸分子的表達在治療后被下調，而其血漿中的表達在治療如被下調的核Ife分子的表達在治療后被上調。 第五方面，本發明涉及用于預防或治療結直腸癌的方法，所述方法包括(a)用本文限定的方法在血漿中鑒別核酸表達特征；和(b)在血液中改變所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在血液中被上調的核酸分子的表達被下調，而其表達在血液中被下調的核酸分子的表達被上調。第六方面，本發明涉及用于預防和/或治療血液中的結直腸癌的藥物組合物，所述組合物包含一或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列，所述序列與如本文所定義的在來自結直腸癌患者的血漿中其表達被上調的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應于如本文所定義的在來自結直腸癌患者的血漿中其表達被下調的核酸分子所編碼的微RNA序列。最后，第七方面，本發明涉及所述藥物組合物在制備用于預防和/或治療肝細胞癌的藥物中的用途。本發明的其它實施方案從以下詳細描述中將變得明了。附圖
簡述圖I :示出流程圖，其系統地闡明了參照本發明的方法來確定表達特征的基本方法步驟，用于鑒別一或多種展現出結直腸癌的目標血漿。圖2 :描述了根據本發明確定結直腸癌中一個或多個目標血衆，包含在第一個方面中特別優選表達特征中的人類miRNA。也說明了結直腸癌患者與健康對照相比，這些miRNA的表達水平和準確性(RUC)(即上調或下調)。圖3 :描述了結直腸癌進展中兩個上調(hsa-miR-409_3p和has-miR-671_3p)的miRNA的各自表達水平和ROC曲線分析，這些病例從Dukes ^ A、B、C和D癌癥分組中挑選得至IJ。數據分別從微陣列獲得，并已與內部穩定對照has-miR-1238標準化后得到。數據表明可通過本發明發現的miRNA特征檢測到Dukes' A階段的結直腸癌。圖4 :說明了依據本發明的第二個方面中特別優選表達特征中包含的人類miRNA，目的是為了進一步區分結直腸癌和健康對照、肝細胞癌和肺癌。同樣表明結直腸癌與健康對照、肝細胞癌和肺癌相比，病人的這些miRNA的表達水平和準確性(AUC)(即上調或下調)。第一位的組合(hsa20-miR-33b*/hsa-miR-196a)表明其作為區分CRC和健康個體、肝細胞癌和肺癌的診斷生物標記的準確性為85% (AUC=O. 860)。圖5 :描述兩個腫瘤相關miRNA的ROC曲線分析不例(hsa-miR-93和hsa-miR-25),這兩個miRNA通過定量RT-PCR方法測定結直腸癌和健康對照血漿獲得(O :健康個體；1 :結直腸癌)。結果表明這些miRNA作為診斷生物標記的高敏感性和特異性。發明詳沭本發明基于如下出乎意料的發現，即結直腸癌能可靠地通過血漿中特定miRNA表達特征以高準確性和靈敏性來鑒定，其中所述表達特征如本文定義典型地包括被上調和下調的人類miRNA。更特別地,所述miRNA表達特征一通過分析血衆中整體miRNA表達模式和/或各個miRNA表達水平一使得能檢測早期疾病狀態下的HCC以及鑒別健康個體、肝細胞癌和肺癌。以下例證的本發明可以合適地在不存在未在本文中具體揭示的任何一或多個元 件、一或多種限制的條件下實施。本發明將根據特定的實施方案并參照附圖加以描述，但是本發明不受其限制，僅受權利要求書限制。所描述的附圖僅是示意性的，被認為是非限制性的。當術語“包含”被用于本發明說明書和權利要求書中時，其不排除其它元件或步驟。為本發明目的，術語“由…組成”被認為是術語“包含”的優選實施方案。如果在下文中組被限定為包含至少一定數目的實施方案，這也被理解為揭示了優選地僅由這些實施方案組成的組。當指代單數形式名詞使用不定冠詞或定冠詞例如“一個”或“一種”，“所述”時，包括該名詞的復數形式，除非特別指出。術語“大約”在本發明中是指本領域技術人員理解仍能保證目的特征的技術效果的準確性區間。該術語通常表示偏離指示值的±10%，優選±5%。另外，術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(C)等在說明書和權利要求書中用于區分類似的元件，不是描述順序或時間次序必須的。應理解如此應用的術語在合適情況下可互換，并且本發明描述的實施方案能以不同于本文所述或例證的其它順序操作。術語的進一步定義在以下使用術語時給出。以下術語或定義僅為了理解本發明而提供。這些定義不應被認為具有小于本領域技術人員理解的范圍。本發明的一個目的是通過測定血液中多種核酸分子，為診斷結直腸癌、監測癌癥治療、和/或治療結直腸癌提供新的方法，每種核酸分子均編碼微RNA (miRNA)序列，其中所述多種核酸分子中的一種或多種在結直腸癌血漿與健康個體、肝細胞癌和肺癌血漿中差異表達，其中所述一種或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，該核酸表達特征是結直腸癌存在的指征，其中的核酸表達特征包括腫瘤相關特征和血漿特異性特征。本文的術語“結直腸”指的是結腸、直腸和/或闌尾，即整個大腸。本文術語“癌癥”(也稱為癌)通常指任何類型的惡性新生物，即與未受影響的(健康)野生型對照細胞相比顯示或具有發生癌特征傾向的靶細胞的任何形態學和/或生理學改變(基于遺傳重編程(genetic re-programming))。這種改變的例子可涉及細胞大小和形狀(變大或變小)、細胞增殖(細胞數增加)、細胞分化(生理學狀態變化)、凋亡(程序性細胞死亡)或細胞存活。因此，術語“結直腸癌”指的是結腸、直腸和闌尾的癌性生長。最常見的結直腸癌(CRC)細胞類型是腺癌，大約占95%。其他類型的CRC包括尤其是淋巴瘤和鱗癌。結直腸癌可根據Dukes 系統分類(Dukes, C. E. (1932) J. Pathol.Bacteriol. 35, 323-325)。包括以下分期Dukes A-腫瘤局限于腸壁；Dukes B-腫瘤侵犯穿過腸壁；Dukes C-腫瘤涉入淋巴結；Dukes D-腫瘤有遠處轉移。本文術語“血漿”指的是血液的黃色液體成分，其中全血的血細胞通常會懸浮。大約占整個血液體積的55%。絕大部分是水(90%體積)并含有溶解的蛋白、葡萄糖、凝集因子、礦物質離子、激素和二氧化碳(血漿是分泌產物運輸的主要介質)。血漿通過將新鮮血液在離心機中離心直到血細胞沉降到離心管底部而制備。然后血漿被純化和轉移。血漿的密度大約是1025kg/m3，或1.025kg/l。現今的研究表明miRNA在血漿中是穩定的。術語“血漿樣本”指的是從被檢測的個體或者健康對照獲得的血漿。
本文所用術語“患者”，是指至少應該被認為是患有肝細胞癌的人；本文所用術語“目標血漿”是指從患者獲取的血漿；術語“健康個體”或“健康對照”特指不具有任一癌癥表現的健康個體。并且這里“對照血漿”是指從這些健康個體獲取的血漿。但是，在一些應用里，例如，當比較不同的癌癥類型時，這些個人有其他的癌癥類型，這些從這些個體中獲取的血漿也被特指為“對照”。通常，所用的血漿樣本來源于被診斷為結直腸癌的研究對象的生物學樣本。另外，為了更確定從“對比樣本”獲得數據，可從已知疾病狀態的研究對象中收集。生物學樣本可包括身體組織和液體,例如結直腸組織、血清、血細胞、痰液和尿液。此外,生物學樣本可從具有結直腸癌特征或者疑似病例中獲得。此外，如有有必要，樣本可從得到的身體組織和液體中純化得到，然和作為生物學樣本。根據本發明，核酸分子標記的表達水平通過研究對象來源的生物學樣本測定得到。在本發明的體外方法中用于檢測的樣品通常應以臨床可接受的方式收集，優選以保護核酸(特別是RNA)或蛋白質的方式收集。待分析的樣品典型地是血液。另外，肝組織及其它類型樣品也可以使用。樣品特別在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的樣品。本文所用術語“微RNA”(或“miRNA”)是其在本領域的普通含義(Bartel，D.P. (2004) Cell 23，281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004)Nat. Rev. Genet. 5，522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因組基因座的RNA分子，其從可以形成局部RNA前體miRNA結構的轉錄物加工而來。成熟miRNA通常長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸，其它數目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27個核苷酸。miRNA編碼序列具有與側翼基因組序列配對的潛力，使成熟miRNA放置在非完全配對的RNA雙鏈體之內(本文也稱作莖-環或發夾結構或pre-miRNA)，所述雙鏈體作為從更長的前體轉錄物進行miRNA加工的中間體。這一加工典型地通過分別稱為Drosha和Dicer的兩種特異的內切核酸酶的連續作用而發生。Drosha從初級轉錄物(本文也稱作“pri-miRNA”)產生典型地折疊成發夾或莖-環結構的miRNA前體(本文也稱作“pre-miRNA”)。從這個miRNA前體，通過Dicer切割miRNA雙鏈體，其在發夾或莖-環結構的一條臂包含成熟miRNA，在另一條臂包含類似大小的節段(通常稱為miRNA*)。miRNA然后被導向其靶mRNA以發揮其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自與預測的蛋白質編碼區不同的基因組節段。本文所用術語“miRNA前體”(或“前體miRNA”或“pre-miRNA” )是指從其加工成熟miRNA的miRNA初級轉錄物的部分。典型地,pre-miRNA折疊成穩定的發夾(即雙鏈體)或莖-環結構。發夾結構典型地長度為50-80個核苷酸，優選60-70個核苷酸(計數miRNA殘基，與miRNA配對的殘基，及任何間插節段，但排除更遠端的序列)。本文所用術語“編碼微RNA序列的核酸分子”是指編碼微RNA (miRNA)的任何核酸分子。因此，該術語不僅指成熟miRNA,也指相應的如上所述的前體miRNA及初級miRNA轉錄物。另外，本發明不限于RNA分子，也包括相應的編碼微RNA的DNA分子，例如通過逆轉錄miRNA序列產生的DNA分子。編碼本發明的微RNA序列的核酸分子典型地編碼單個miRNA序列(即個體miRNA)。但是，也可能這種核酸分子編碼兩個或多個miRNA序列(即兩個或多個miRNA)，例如一個轉錄單位包含在常用調節序列如啟動子或轉錄終止子控制下的兩個或多個miRNA序列。
本文所用術語“編碼微RNA序列的核酸分子”也被理解為包括“有義核酸分子”(即核酸序列(5' —3')匹配或相應于所編碼的miRNA(5' —3')序列的分子)及“反義核酸分子”(即核酸序列互補于所編碼的miRNA(5' —3')序列或者換句話說匹配所編碼的miRNA序列的反向互補序列(3' —5,)的分子)。本文所用術語“互補”是指“反義”核酸分子序列與相應的“有義”核酸分子序列(具有互補于反義序列的序列)形成堿基對、優選Watson-Crick堿基對的能力。在本發明范圍內，兩個核酸分子(即“有義”和“反義”分子)可以完全互補，即它們不含有任何堿基錯配和/或額外的或缺失的核苷酸。或者，兩個分子包含一或多個堿基錯配或者在它們的核苷酸總數上不同(由于添加或缺失導致)。優選地，“互補”核酸分子包含與包含在相應的“有義”核酸分子中的序列顯示完全互補性的至少10個連續核苷酸。因此，包含在本發明的診斷試劑盒中的編碼miRNA序列的多種核酸分子可包括一或多種“有義核酸分子”和/或一或多種“反義核酸分子”。有時，診斷試劑盒包括一或多種“有義核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被認為組成了差異表達的miRNA(即分子標記)的全體或至少亞集合，所述差異表達的miRNA是存在或發生特定病癥傾向的指征，本文是結直腸癌。另一方面，當診斷試劑盒包括一或多種“反義核酸分子”(即與miRNA序列互補的序列)時，所述分子可包含適合用于檢測和/或定量給定樣品中的一或多種特定(互補)miRNA序列的探針分子(用于進行雜交測定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆轉錄或PCR應用)。在本發明中定義的多種核酸分子可以包含至少2種、至少10種、至少50種、至少100種、至少200種、至少500種、至少1000種、至少10000種或至少100000種核酸分子，每種分子編碼miRNA序列。本文所用術語“差異表達”是指特定miRNA在目標血漿中的表達水平相比于健康對照血漿是改變的，其可以是上調(即在目標血漿中miRNA濃度增加)或下調(即在目標血漿中miRNA濃度降低或消失)。換句話說，核酸分子在目標血漿中被激活至比在對照血漿中更高或更低的水平。本發明范圍內，核酸分子被認為是差異表達的，如果該核酸分子在靶細胞和對照細胞中的相應表達水平典型地相差至少5%或至少10%，優選地至少20%或至少25%，最優選地至少30%或至少50%。因此，后者的值相應于給定核酸分子在靶細胞中的表達水平相比于野生型對照細胞分別上調至少I. 3倍或至少I. 5倍，或者反之在靶細胞中的表達水平下調至少O. 7倍或至少O. 5倍。本文所用術語“表達水平”是指特定的miRNA序列從其基因組基因座被轉錄的程度，即miRNA在一或多種被分析血漿中的濃度。如上所述，術語“對照血漿”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)血漿。但是，在一些應用中，例如當比較顯示不同的癌或癌前狀態的血漿時，具有較不嚴重疾病特征的血漿典型地被認為是“對照血漿”。表達水平的確定典型地遵循本領域熟知的已建立的標準程序(Sambrook，J.et al. (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd Ed. , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；Ausubel, F. M. et al. (2001)CurrentPro-cols in Molecular Biology. Wiley & Sons, Hoboken, NJ)。確定可以在RNA水平進行, 例如使用miRNA特異性探針進行Northern印跡分析,或者在逆轉錄(及克隆)RNA群后例如通過定量PCR或實時PCR技術在DNA水平進行。本文所用術語“確定”包括分析編碼上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re_mRNA半衰期短,典型地僅測量成熟miRNA的濃度。在具體的實施方案中，在給定樣品的若干獨立測量(例如兩個、三個、五個或十個測量)和/或在一群目標血漿或對照血漿內的若干測量中獲得的表達水平的標準值被用于分析。標準值可以用本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值±2SD(標準差)或平均值±3SD的范圍可被用作標準值。所獲得的疾病或對照血漿表達水平之間的差異可以歸一化至進一步的對照核酸例如管家基因的表達水平，管家基因的表達水平已知不根據獲得樣本的個體的疾病狀態而不同。舉例的管家基因包括β_肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl等。在優選的實施方案中，對照核酸是已知在收集樣本的不同非癌和癌(前)狀態中穩定表達的另一種 miRNA。但是，代替在任何實驗中測定血漿樣本表達水平，也可以基于實驗證據和/或現有技術數據定義針對特定疾病表型(即疾病狀態)的一或多個截斷值。在這種情況中，血漿樣本的格子表達水平可以用用于歸一化的穩定表達的對照miRNA測定。如果計算的“歸一化”的表達水平高于相應定義的截斷值，則這一發現是基因表達上調的指征。反之，如果計算的“歸一化”的表達水平低于相應定義的截斷值，則這一發現是基因表達下調的指征。在本發明的背景下中，術語“鑒定結直腸癌和/或區分其他類型癌”也包括預測和可能性分析(“診斷”意義上)。本文公開的組合物和方法意在臨床應用，以決定治療形式，包括治療性干預，診斷標準如疾病階段，和疾病監控和疾病監視。根據本發明，可提供用于檢查對象狀態的中間結果。這種中間結果可與額外信息組合以幫助醫生、護士或其它從業人員診斷出該對象患有該疾病。或者，本發明可用于檢測對象衍生組織中的癌細胞，并提供有用信息給醫生以進行診斷。另外，本發明還用于區分結直腸癌和其他類型癌包括肝細胞癌和肺癌。在本發明中，所鑒定的一或多種差異表達的核酸分子一起代表一種核酸表達特征，該核酸表達特征是通過血漿樣本鑒定結直腸癌存在的指征。本文所用術語“表達特征”是指一組核酸分子(例如miRNA)，其中各個核酸分子的表達水平在結直腸癌血漿和健康對照之間不同。本文中，核酸表達特征也指一組標記并代表最低數目的(不同)核酸分子，每種核酸分子編碼能鑒定個體的表型狀態的miRNA序列。在一個方面，本發明涉及為確定結直腸癌的血液分子標記的診斷試劑盒，此試劑盒包括多種核酸分子，每種核酸分子編碼一種microRNA序列。其中所述一中或多種核酸分子在目標血漿和健康對照組中差異表達，并且其中差異表達的標記來源于腫瘤相關的或者血漿特異性標記，并且這其中一個或者多個差異表達的核苷酸分子一起代表一個核酸表達特征表明了結直腸癌的存在。本文限定的核酸表達特征可包括至少35中核酸分子，優選地至少12種核酸分子，且特別優選地至少6中核酸分子。在優選的實施方案中，核酸分子表達特征包括至少一種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在一個或多個血漿中相比一個或多個對照組而言有上調，并且至少一種編碼 miCToRNA的核酸分子，其表達在一個或多個血漿中相比一個或多個健康對照而言有下調。本文所用的術語“來源于腫瘤”或“腫瘤來源的”指的是結直腸癌病人和對照血漿中差異表達的特征，并且在結直腸癌組織細胞核非癌組織細胞中也差異表達。本文所用的結直腸癌組織細胞，指的是從診斷為結直腸癌研究對象中切出收集到結直腸癌細胞。本文所用的非癌組織細胞通常是指沒有癌表型特征的一個(健康)野生型細胞。本文所用術語“血漿特異性的”指的是結直腸癌病人和對照血漿中差異表達，并在結腸癌組織細胞和非癌組織細胞沒有顯著差異。通常，包含在核酸表達特征中的核酸分子是人類序列(以后稱為“has”(智人(Homo sapiens)))。在本發明的優選實施方案中，核酸表達特征包括編碼腫瘤相關的hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:I), hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)， hsa-miR-93(SEQ ID NO:3)，hsa-miR-96(SEQ ID NO:4)，hsa_miR-301a(SEQ ID NO:5)，hsa-miR-342_3p(SEQ ID N0:6),hsa-miR-19b(SEQ ID NO:7)，hsa-miR-451(SEQ ID NO:8),hsa-miR-486-5p(SEQ ID NO:9),hsa-miR-187*(SEQ IDNO:10)，hsa_miR-92a(SEQ ID NO:11)，hsa_miR-19a(SEQ ID NO:12)，hsa-miR-20b(SEQ ID NO:13)， hsa_miR-20a(SEQ ID NO:14)， hsa-miR-139_3p(SEQ IDNO:15), hsamiR-107(SEQ ID NO:16)， hsa-miR-17(SEQ ID NO:17)， hsa-miR-140_3p(SEQID N0:18)，hsa-miR-30e(SEQ ID NO: 19)，hsa-miR-185 (SEQ ID NO:20)的任意一種或多種核酸分子的表達；編碼血漿特異性的hsa-mir-671-3p(SEQ ID NO:21)，hsa-mir-16-2*(SEQID NO:22), hsa-miR-30c-l*(SEQ ID NO:23)，hsa-miR-548c_5p (SEQ ID NO:24),hsa-miR-16(SEQ ID NO:25)，hsa_miR-15a(SEQ ID NO:26)，hsa-miR-425(SEQ ID NO:27)，hsa-let-7i(SEQ ID NO:28)，hsa-miR-363(SEQ ID NO:29)，hsa_miR-15b(SEQ ID NO:30)，hsa-miR-101(SEQ ID NO:31)，hsa_miR-190b(SEQ ID NO:32)和 hsa_miR-130a(SEQID NO :33), hsa-miR-331-3p(SEQ ID NO: 46)，hsa-miR-345 (SEQ ID NO :47)任意一種或多種核酸分子的表達；編碼穩定內部穩定對照的hsa-miR-1238(SEQ ID NO:36)和hsa-miR-1228 (SEQ ID NO: 37)的核酸分子。
為了將血漿中核酸分子(即在核酸表達特征中所包含的編碼微RNA序列的核酸分子)的表達水平歸一化，可優選使用miRNAhsa-miR-1238 (SEQ ID NO: 44)和hsa-miR-1228 (SEQ ID NO: 45)，其在結直腸癌血漿中穩定表達。上述miRNA的核酸序列列于表I。表I
權利要求
1.用于鑒別一或多種展現出結直腸癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列， 其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達， 其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特征，所述核酸表達特征是結直腸癌存在的指征。
2.權利要求I的試劑盒，其中所述核酸表達特征可包含至少35種核酸分子，優選至少12種核酸分子，以及特別優選至少6種核酸分子。
3.權利要求I或2的試劑盒，其中所述核酸表達特征包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與在一或多種對照血漿中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子,其表達在一或多種目標血衆中與在一或多種對照血衆中相比被下調。
4.權利要求1-3任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包含編碼腫瘤相關特征hsa-miR-409_3p、hsa-miR-25、hsa-miR-93、hsa-miR-96、hsamiR_301a、hsa-miR-342_3p、hsa_miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsamiR-187*、hsa_miR-92a、hsa_miR-19a、hsa-miR-20b、hsa-miR-20a、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-17、hsa-miR-140-3p、hsa_miR-30e、hsa-miR-185 ;及血衆特異性特征 hsa-mir-671_3p、hsa-mir-16_2*、hsa-miR-SOc-l^Khsa-miR-SASc-Sp'hsa-miR-lB'hsa-miR-lSa'hsa-miR-ASS'hsa-let-Ti、hsamiR-363、hsa_miR-15b、hsa-miR-101、hsa_miR-190b、hsa_miR-130a、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-345 ;和內部穩定對照hsaniR-1238和hsaniR-1228的任意一種或多種核酸分子。
5.權利要求4的試劑盒，其中與一或多種健康對照相比，在所述一或多種目標血漿中編碼hsa-miR-409_3p和hsa-mir-671_3p的任意一種或多種核酸分子的表達被上調；而編石馬 hsa-miR-25、hsa-miR-93Λ hsa-miR-96Λ hsa_miR-301a、hsa-miR-342_3p、hsa_miR-19b、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-187*、hsa_miR-92a、hsa_miR-19a、hsa_miR-20b、hsa_miR-20a、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-107、hsamiR-17、hsa-miR-140_3p、hsa_miR-30e、hsa-miR-185’ hsa-mir-16_2*、 hsa-miR-30c_l*、 hsa-miR-548c_5p、 hsa-miR-16、hsa_miR-15a、hsa-miR-425、hsa-let_7i、hsa-miR-363、hsa_miR-15b、hsa-miR-101、hsa_miR-190b、hsa_miR-130a、has-miR-331_3p 和 hsa-miR-345 的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228沒有變化。
6.利要求1-3任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包括編碼hsa-miR-409-3p/hsa-miR-16-2*、hsa-miR-409-3p/hsa_miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-548c_5p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-30c_l*、hsa-miR-671_3p/hsa-miR-342_3p、hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-96、hsa-miR-671-3p/hsa_miR-30la、hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-345、hsa-miR-409-3p/hsa_miR-345、hsa-miR-409/hsa-miR-331_3p、hsa-miR-671-3p/hsa-miR-331_3p、hsa-miR-671-3p/hsa_miR-25、hsa-miR-409-3p/hsa-miR-93 和 hsa-miR-67l-3p/hsa_miR-93 的任意一種或多種核酸分子組合。
7.權利要求1-6任一項的試劑盒，進一步用于將結直腸癌與健康個體、肝細胞癌和肺癌區別開。
8.權利要求7的試劑盒，其中所述核酸表達特征可包括至少23種核酸分子，優選至少18種核酸分子，特別優選至少6種核酸分子。
9.權利要求1-8任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特征包含任意一種或多種編碼腫瘤相關特征 hsa-miR-409_3p、hsa-miR-129_3p、hsa_miR-33b*、hsa-miR-7、hsa_miR-196b、hsa-miR-93、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-25、hsa_miR-92a、hsamiR_19b ；血楽■特異性特征 hsa-miR-67l_3p 和 hsa-miR-16-2*、has_miR-92b、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsa-miR-602、hsa-miR-1227、hsa_miR-196a 和內部穩定對照 hsa-miR-1238和hsa-miR-1228的核酸分子。
10.權利要求9的試劑盒，其中與一種或多種健康個體、肝細胞癌和肺癌相比，在所述一或多種目標血楽■中，編碼 hsa-miR-409_3p、hsa-mir-671_3p、hsa_miR-33b*、hsa_miR-92b、hsa-miR-149、hsa-miR-129*、hsa-miR-563、hsa-miR-129_3p、hsa-miR-634、hsa_let_7b*、hsa-miR-602和hsa-miR-1227的任意一種或多種核酸分子表達被上調；而編碼 hsa-miR-16-2*、hsa-miR-7、hsa_miR-196a、hsa_miR-196b、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-93>hsa-miR-25>hsa-miR-92a和hsa_miR-19b的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsa-miR-1238 和 hsa-miR-1228 沒有變化。
11.權利要求7-10任一項的試劑盒,其中所述核酸表達特征包括編碼hsa-miR-33b*/hsa_miR-196a、hsa-miR-92b/hsa_miR-196a、hsa-miR-563/hsa_miR-196a、hsa-miR-1227/hsa_miR-196a、 hsa-miR-129-3p/hsa-miR-16_2*、 hsa-miR-129*/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-92b/hsa-miR-16_2*、 hsa-miR-129*/hsa_miR-196a、 hsa-miR-1227/hsa-miR-16-2*、 hsa-miR-129-3p/hsa_miR-196a、 hsa-miR-602/hsa_miR-196a、hsa-miR-33b*/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-563/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-129*/hsa_miR-7、hsa-miR-33b*/hsa_miR-7、hsa-miR-563/hsa_miR-7、hsa-miR-602/hsa-miR-16_2*、hsa-miR-129-3p/hsa_miR-7、hsa_miR-92b/hsamiR-7、hsa-miR-1227/hsa_miR-7、hsa-miR-33b*/hsa_miR-196b、hsa-miR-1227/hsa_miR-196b、hsa-miR-92b/hsa_miR-196b和hsa-miR-602/hsa-miR-7的任意一種或多種核酸組合。
12.用于鑒別展現出結直腸癌的一或多種目標血漿的方法，所述方法包括 (a)在所述一或多種目標血漿中確定多種核酸分子的表達水平，每種核酸分子編碼微RNA序列； (b)在一或多種健康對照血漿中確定所述多種核酸分子的表達水平；及 (c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑒別出在所述目標血漿和對照血漿中差異表達的一或多種核酸分子，其中所述差異表達的一或多種核酸分子一起代表如權利要求1-11任一項所定義的核酸表達特征，所述核酸表達特征是結直腸癌存在的指征。
13.權利要求12的方法，其進一步用于將結直腸癌與健康個體、肝細胞癌和肺癌區別開。
14.用于監測結直腸癌治療的方法，所述方法包括 (a)通過使用本文所定義的方法在一或多種目標血漿中鑒別核酸表達特征'及 (b)在血液中監測所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述監測以如下的方式進行，即其血漿中的表達在治療前被上調的核酸分子的表達在治療后被下調，而其血漿中的表達在治療前被下調的核酸分子的表達在治療后被上調。
15.用于預防或治療結直腸癌的方法，所述方法包括 (a)通過使用權利要求12或13的方法在血液中鑒別核酸表達特征；及 (b)在血液中改變所述核酸表達特征所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在血液中被上調的核酸分子的表達被下調，而其表達在血液中被下調的核酸分子的表達被上調。
16.用于預防和/或治療血液中結直腸癌的藥物組合物，所述組合物包含一或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列， 所述序列與如本文所定義的在來自結直腸癌患者的血漿中其表達被上調的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應于如權利要求1-13任一項所定義的在來自結直腸癌患者的血漿中其表達被下調的核酸分子所編碼的微RNA序列。
17.權利要求16的藥物組合物在制備用于預防和/或治療結直腸癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及用于結直腸癌血漿中微RNA(miRNA)表達譜分析的組合物和方法。特別地，本發明涉及用于診斷結直腸癌、監測癌癥治療、和/或治療結直腸癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子中的一或多種的在結直腸癌血漿與在健康對照血漿中差異表達，且其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表一種核酸表達特征，所述特征是結直腸癌存在的指征。本發明還涉及相應的方法，其使用這種核酸表達特征來鑒別結直腸癌以及預防或治療此病癥。最后，本發明涉及用于預防和/或治療結直腸癌的藥物組合物。
文檔編號C12Q1/68GK102933719SQ201080064801
公開日2013年2月13日 申請日期2010年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者李兆勇, 吳瑩, 朱虹光, 李健, 任一萍 申請人:復旦大學