專利名稱：包含增強性多肽和淀粉降解酶的組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含淀粉降解酶活性增強性多肽并進一步包含淀粉降解酶的組合物。本發明還涉及增強性多肽，編碼增強性多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸構建體，包含所述核酸構建體的重組表達載體，包含所述核酸構建體或載體的重組宿主細胞，用于產生所述增強性多肽的方法，和本發明的組合物在淀粉常規工藝包括用于產生發酵產物如特別是乙醇中的用途。
背景技術：
淀粉可由酸，多種酶，或其組合水解為更簡單的糖類。用于將淀粉水解為更簡單的糖類的主要酶為內淀粉酶、外淀粉酶和脫支酶，其水解直鏈淀粉、和支鏈淀粉。直鏈淀粉主要由淀粉酶水解，而支鏈淀粉還需要脫支酶如普魯蘭酶(E. C. 3. 2. I. 41)以供完全水解。內淀粉酶(最常見的為α -淀粉酶(E. C. 3. 2. I. I))，對于直鏈淀粉和支鏈淀粉的α -I, 4_連接具特異性。外淀粉酶具有水解直鏈淀粉和支鏈淀粉的α-1,4-連接和α-1,6-連接兩者的能力。常見的實例是淀粉匍糖苷酶(常常稱作匍糖淀粉酶)(E. C. 3. 2. I. 20)。β -淀粉酶是具有水解直鏈淀粉的α-1,4-連接的能力的酶。脫支酶例如普魯蘭酶，水解支鏈淀粉中的α-1,6-連接。脫支酶的水解產物主要為麥芽三糖和麥芽糖。增強淀粉降解酶的酶活性并改善含淀粉材料轉化為糖，特別是能夠轉化為發酵產物如乙醇的可發酵的糖，會是有利的。
發明內容
本發明提供了包含淀粉降解酶活性增強性多肽和淀粉降解活性的組合物。本發明的組合物導致與不具有淀粉降解活性增強性多肽的相同組合物相比，增加的淀粉降解活性。本發明的組合物包含至少兩種組分增強性多肽和淀粉降解酶。然而，應理解的是，所述組合物可包含多于一個每種組分。在第一個方面，本發明涉及包含多肽并進一步包含淀粉降解酶的組合物，所述多肽包含或組成為Χ46域。在一個實施方案中，所述包含或組成為Χ46域的多肽可自身不具有淀粉降解酶活性。在另一個實施方案中，所述包含Χ46域的多肽亦具有淀粉降解活性，如下文進一步所述。在一個優選實施方案中，所述包含Χ46域的多肽具有普魯蘭酶、淀粉普魯蘭酶和/或淀粉酶，如α-淀粉酶活性。在一個實施方案中，所述包含或組成為Χ46域的多肽選自下組i)多肽，其包含或組成為SEQ ID N0:2、4、6-81、85、87和89中任一中所示的氨基酸序列；或ii)氨基酸序列，其與SEQ ID N0:2、4、6-81、85、87和89中任一具有至少60%同一性；或iii)多肽，其由使用SEQ ID NO:7-81，85，87和89的隱蔽馬爾科夫模型(HMM)確定，具有至少150的HMM得分；iv)它們的(即 i)，ii)或 iii)的)變體，其在 SEQ ID NO:2、4、6_81、85、87 和 89中任一中的一個或多個(幾個)位置包含改變。在另一個實施方案中，本發明涉及從含淀粉材料產生發酵產物特別是乙醇的工藝，其包括下述步驟在另一個方面，本發明涉及從含淀粉材料產生發酵產物的工藝，其包括下述步驟(a)在本發明的組合物和任選地在α _淀粉酶的存在下液化含淀粉材料；(b)使用糖源生成酶糖化步驟(a)中獲得的液化材料；(C)使用發酵生物發酵。本發明還涉及組成為X46域的多肽。在一個實施方案中，所述組成為X46域的多肽不具有淀粉降解活性。本發明還涉及編碼本發明的X46域的分離的多核苷酸，以及包含可操作地連接的本發明的多核苷酸和一個或多個(幾個)調控序列的核酸構建體，所述調控序列指導所述多肽在表達宿主中的產生。本發明還涉及包含本發明的核酸構建體的重組表達載體,和包含本發明的核酸構建體或本發明的載體的重組宿主細胞。本發明進一步涉及用于產生組成為X46域的多肽的方法，其包括(a)在有助于產生X46域的條件下培養本發明的重組宿主細胞；和(b)回收所述X46域。最終，本發明涉及本發明的組合物在從淀粉產生增甜劑的工藝中的用途或在從糊化(gelatinized)產生發酵產物如乙醇的工藝中的用途。
圖I顯示了附錄A，其列出了通過隱蔽馬爾科夫模型(HMM)鑒定的X46域。圖2顯示了附錄C，其顯示了 X46域的多重比對。舉例而言，SffISSPROT:C1QSR8:898.. 1122/1-225 表示序列來自 Swissprot 數據庫，具有標識號“C1QSR8”，所述X46域位于氨基酸898至1122，且為225個氨基酸長。圖3顯示了附錄D，其顯示在當前Pfam發布(版本24. 0，2009年十月)中DUF2223域的組成為16個種子序列。附錄D展示DUF2223域(或X46域)序列的多重比對。發明詳述本發明涉及包含增強淀粉降解酶的酶活性的多肽的組合物。本發明還涉及將含淀粉材料轉化為糖和/或發酵產物，如特別是乙醇的工藝。本發明人鑒定了位于來自嗜熱網球菌(Dictyoglomus thermophilum)DSM3960的淀粉普魯蘭酶基因Apu (Uniprot :Q9Y8I8)上游的未表征的多肽。SEQID NO: I的翻譯產物為SEQ ID勵:2出11丨？1'0185￥0￥6)，并鑒定為具有域0現2223(根據？€&111命名)。本發明人發現包含含有X46域的多肽的組合物增強了淀粉降解酶的淀粉水解活性。舉例而言，本發明人發現當溫育包含來自SEQ ID N0:6中所示的嗜熱網球菌(Dictyoglomus thermophilum)普魯蘭酶的X46域(SEQ ID NO:89)的多肽時，盡管X46域自身不具有普魯蘭酶活性，普魯
5蘭酶活性仍得到增強。已顯不Thermococcus Iitoralis/Thermococcushydrothermalis X4嵌合普魯蘭酶(SEQ ID N0:83)在 pH 5. O 使用 LIQUEZYME SC DS(即來自 Novozymes 的商業性嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) α -淀粉酶變體)產生+0. 6g/L (相對于對照)的乙醇產量的增加。僅經含X46域多肽處理的醪與對照相比產生+0.9g/L更多的乙醇。當與含X46域多肽(SEQ ID NO:89)組合測試時，其相對于對照增強了 +1. 2g/L的乙醇產量。本發明人亦發現對α-淀粉酶起增強作用的活性。具體而言，本發明人發現WO 2009/140504中公開的Subulispora sp. (AM3162-P8GR) α -淀粉酶增強乙醇產量，如亦可見于實施例。本發明的組合物在第一個方面，本發明涉及包含多肽和進一步包含淀粉降解酶的組合物，所述多肽包含或組成為Χ46域。本發明的組合物導致相對于不含所述包含或組成為Χ46域的多肽的相應組合物增加的(即增強的)淀粉降解活性。在一個實施方案中，所述包含或組成為Χ46域的多肽增加(即增強)普魯蘭酶，優選家族GH13的類型I的普魯蘭酶和/或家族GH57的類型II的淀粉普魯蘭酶的活性。在一個優選實施方案中，所述家族GH13的類型I的普魯蘭酶(EC. 3. 2. 1.41)是來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)的菌株，如菌種Bacillusderamificans的菌株的普魯蘭酶，特別是WO 00/01796中SEQ IDNO:2中所示的普魯蘭酶，或菌種Bacillus acidopulIulyticus的菌株的普魯蘭酶，特別是WO 00/01796中的SEQ ID NO: I中所示的普魯蘭酶(通過提述將上述公開并入本文)。所述X46域亦可來源于細菌，優選網球菌屬(Dictyoglomus)的菌株，特別是菌種嗜熱網球菌(Dictiglomus thermophilum)的菌株，或閃爍桿菌屬(Fervido bacterium)的菌株，特別是菌種多節閃爍桿菌(F. nodosum)的菌株；火球菌屬(Pyrococcus)的菌株，特別是沃氏火球菌(Pyrococcus woesi)的菌株，或熱球菌屬(Thermococcus)包括Thermococcus litoralis、Thermococcushydrothermalis 的菌株。應理角軍的是，X46 域亦可來自其他微生物，如來自由HMM發現的X46域的屬，特別是種(如下文進一步所述)。這些包括激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，海葡萄嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)， Pyrobaculum aerophilum, Pyrobaculum aerophilum， 嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)， Pyrococcus abyssi， Staphylothermus hellenicus， 海葡萄嗜熱菌(Staphylothermus marinus)，沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)，球形節桿菌(Artheobacter globiformis)， Scardovia inopinata， Parascardovia denticolens，Thermosphaera aggregans，Thermosphaera aggregans，Thermincola potens，Staphylothermus hellenicus,Ktedonobacter racemifer，Pyrobaculum calidifontis，阿拉伯糖醋鹽桿菌(Acetohalobium arabaticum)，Pyrobaculum calidifontis,Pyrobaculumarsenaticum，Pyrobaculum arsenaticum，多節閃爍桿菌(Fervidobacterium nodosum),Anaeromyxobacter dehalogenans，冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)，冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)，Psychroflexustorques，奧氏鹽熱發菌(Halothermothrixorenii)， Anaeromyxobacter sp.，球形節桿菌(Arthrobacter globiformis),嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)，球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)，禮色標粧菌(Stigmatella aurantiaca)，球形節桿菌(Arthrobacter globiformis),Anaeromyxobacter dehalogenans，嗜中性熱變形菌(Thermoproteus neutrophilus)，激烈火球菌(Pyrococcus furiosus),水生棲熱菌(Thermus aquaticus), Thermococcusbarophilus,解蛋白幾熱桿菌(Coprothermobacter proteolyticus),嗜熱網球菌(Dictyoglomus thermophilum),Thermococcus hydrothermalis,Dictyoglomus turgidum,Thermococcus sp. , Kosmotoga olearia, Thermococcus onnurineus, Desulfurococcuskamchatkensis, Thermococcus litoralis, Thermosipho melanesiensis, Catenulisporaacidiphila, Thermococcus gammatolerans, Thermococcus gammatoIerans,嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus), Thermococcus kodakaraensis 和 Catenulisporaacidiphila。在另一個實施方案中，所述包含或組成為X46域的多肽增加(即增強)α-淀粉酶的活性。在一個實施方案中，所述包含Χ46域的多肽具有普魯蘭酶、淀粉普魯蘭酶和/或淀粉酶活性。在一個實施方案中，在本發明的組合物中包含或組成為Χ46域的多肽和淀粉降解酶的比例為10:1至I : 10，特別是5:1至1:5，特別是2:1至1:2，如約1:1。包含或組成為Χ46域的多肽本發明的組合物包含多肽并進一步包含淀粉降解酶，所述多肽包含或組成為Χ46域。所述包含或組成為Χ46域的多肽可選自下組i)多肽，其包含或組成為SEQ ID NO:2、4、6_81、85、87和89中任一中所示的氨基酸序列；ii)氨基酸序列，其與SEQ ID NO: 2、4、6_81、85、87和89中任一具有至少60%同一性；或iii)多肽，其由使用SEQ ID NO: 7_81，85，87和89和/或圖I (附錄A)中鑒定的序列的隱蔽馬爾科夫模型(HMM)確定，具有至少150的HMM得分；iv)它們的(即 i)，ii)或 iii)的)變體，其在 SEQ ID NO:2、4、6_81、85、87 和 89中任一中的一個或多個(幾個)位置包含改變。包含或組成為X46域的多肽可通過下文“通過Hidden Markov Model鑒定X46域”部分描述的方法發現。根據本發明，此種(類)多肽增加淀粉降解酶的淀粉水解活性。當使用HMM以鑒定含有X46域的多肽時，HMM得分可優選為至少200，如150-400或200-400的范圍，如230-350或170-350的范圍。在一個優選實施方案中，所述含X46域的多肽可包含或組成為a. SEQ ID N0:2、4和6中任一中所示的氨基酸序列；或b.與SEQ ID N0:2、4和6中任一具有至少60%同一性的氨基酸序列；或c.它們的(即a或b的)變體，其在SEQ ID N0:2、4和6中任一中在一個或多個(幾個)位置包含改變。在一個實施方案中，所述包含X46域的多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID N0:2、4、6-81、85、87和89中所示的多肽具有至少70%，優選至少80%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%的同一性。在一個實施方案中，所述包含X46域的多肽的變體與SEQ ID N0:2、4和6中任一中所示的親本多肽具有至少60%同一性，至少70%，優選至少80%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性，但少于100%同一性。在一個實施方案中，所述組成為X46域的多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 7-81、85、87和89中任一中所示的親本多肽具有至少70%,優選至少80%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%，如至少96%，如至少97%如至少98%，如至少99%同一性，但少于100%同一性。在一個實施方案中，所述組成為X46域的多肽的組成可為a. SEQ ID NO:7-81、85、87或89中任一中所示的氨基酸序列；或b.與SEQ ID NO:7-81、85、87或89中任一具有至少60%同一性的氨基酸序列；c.SEQ ID NO:7-81、85、87 或 89 中任一的變體；其任選地進一步具有N和/或C端氨基酸序列，其中所述N和/或C端氨基酸序列組成為I至50個氨基酸，優選1-25個氨基酸，特別是I至10個氨基酸。淀粉降解酶如上所提及，本發明的組合物包含多肽并進一步包含淀粉降解酶，所述多肽包含或組成為X46域。所述淀粉降解酶可優選為家族GH13或家族GH57的淀粉降解酶。所述淀粉降解酶可選自下組普魯蘭酶、淀粉普魯蘭酶和α-淀粉酶，異淀粉酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶和CGT酶。根據本發明，在優選實施方案中，所述淀粉降解酶可選自下組普魯蘭酶、淀粉普魯蘭酶和α-淀粉酶。在一個優選實施方案中，所述淀粉降解酶當與本發明的包含或組成為Χ46域的多肽組合時，具有增加的水解活性(即增強的酶活性)。家族GHl3 酶家族GH13由CAZy團隊所定義，且更新的列表可見于CAZy服務器(參見“www.cazy. org”)。家族GH13酶包括α -淀粉酶(EC 3. 2. I. I);普魯蘭酶(EC3. 2. I. 41);環麥芽糊精葡聚糖轉移酶(EC 2. 4. I. 19);環麥芽糊精酶(EC 3. 2. I. 54);海藻糖_6_磷酸水解酶(EC 3. 2. I. 93);寡聚-α -葡糖苷酶(EC 3. 2. I. 10);產麥芽糖淀粉酶(EC 3. 2. I. 133)；新普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 135) ； α -葡糖苷酶(EC 3. 2. I. 20);麥芽四糖形成α -淀粉酶(EC3. 2. I. 60);異淀粉酶(EC 3. 2. I. 68);葡糖葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 70);麥芽六糖形成α -淀粉酶(EC 3. 2. I. 98);麥芽三糖形成α -淀粉酶(EC 3. 2. I. 116);支化酶(EC 2. 4. I. 18)；海藻糖合酶(EC 5. 4. 99. 16) ;4_α -葡聚糖轉移酶(EC 2. 4. I. 25);麥芽五糖形成α -淀粉酶(EC 3. 2. I.-);淀粉蔗糖酶(EC2. 4. I. 4);蔗糖磷酸化酶(EC 2. 4. I. 7);麥芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(malto-o Iigosy I trehalose trehalohydrolase) (EC 3. 2. I. 141);異麥芽酮糖合酶(isomaltulose synthase) (EC 5. 4. 99. 11);氨基酸轉運蛋白。在一個優選實施方案中，根據本發明涵蓋的家族13酶是淀粉降解酶，特別是歸類為EC 3.2. 1.41(普魯蘭酶)和EC 3. 2. I. 1(α-淀粉酶)的。家族GH57 酶家族GH57由CAZy團隊所定義，且更新的列表可見于CAZy服務器(參見“www.cazy.org”)。家族GH57酶包括α -淀粉酶(EC 3. 2. I. I) ;4_ α -葡聚糖轉移酶(EC2.4. 1.25) ;α-半乳糖苷酶(EC 3. 2. I. 22);淀粉普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 41);支化酶(EC
2.4. I. 18)。優選的是家族GH57的普魯蘭酶，其包括歸類于EC 3. 2. I. 41的普魯蘭酶，并常常稱作類型II的普魯蘭酶，或有時稱作“淀粉普魯蘭酶”。與類型I普魯蘭酶(其特異性攻擊α-1，6連接)相對，類型II普魯蘭酶亦水解α-1,4連接。家族GH57普魯蘭酶的集合描述于Zone等(2004) Eur. J. Biochem. 271，2863-2872 (通過提述并入本文)。在本發明的上下文中，家族GH57普魯蘭酶并不限于本文中描述的那些。優選的類型II的家族GH57普魯蘭酶包括UNIPROT:Q9Y8I8和UNIPROT:Q8NKS8，其分別來源于超嗜熱細菌 Thermococcus hydrothermalis (SEQ ID NO: 2)和 Thermococcuslitoralis的菌株。其雜合物，優選為截短的GH57普魯蘭酶亦涵蓋于本發明。優選的實例為 SEQ ID NO: 83 中所不的 Thermococcus litoralis/Thermococcus hydrothermalisX4 嵌
合普魯蘭酶。家族GH57普魯蘭酶可從任何來源，如微生物，優選細菌或真菌生物如酵母和絲狀真菌獲得。在一個實施方案中，所述家族GH57普魯蘭酶是野生型酶。在一個優選實施方案中，所述普魯蘭酶來源于細菌，優選熱球菌屬(Thermococcus)或火球菌屬(Pyrococcus)的細菌，包括下表中的那些
權利要求
1.一種組合物，其包含多肽并進一步包含淀粉降解酶，所述多肽包含或組成為X46域。
2.權利要求I的組合物，其中所述包含或組成為X46域的多肽選自下組 i)多肽，其包含或組成為SEQID N0:2、4、6-81、85、87和89中任一中所示的氨基酸序列； ii)氨基酸序列，其與SEQID N0:2、4、6-81、85、87和89中任一具有至少60%同一性； iii)多肽，其由使用SEQID NO: 7_81，85，87和89和/或圖I (附錄A)中鑒定出的序列的隱蔽馬爾科夫模型(HMM)確定，具有至少150的HMM得分； iv)它們的(即i)，ii)或 iii)的)變體，其在 SEQ ID NO:2、4、6_81、85、87 和 89 中任一中的一個或多個(幾個)位置包含改變。
3.權利要求1-2的組合物，其中所述淀粉降解酶選自下組普魯蘭酶、淀粉普魯蘭酶，α -淀粉酶，異淀粉酶，β -淀粉酶，葡糖淀粉酶和CGT酶。
4.權利要求1-3任一項的組合物，其中所述含Χ46域的多肽不具有任何淀粉降解活性，特別是不具有普魯蘭酶活性，α-淀粉酶活性，異淀粉酶活性，β_淀粉酶活性，葡糖淀粉酶活性或CGT酶活性。
5.一種組成為Χ46域的多肽，其選自下組 i)SEQID NO:7-81、85、87和89中任一中所示的氨基酸序列；或 ii)與SEQID NO:7-81、85、87和89中任一具有至少60%同一性的氨基酸序列；或 iii)它們在SEQID NO: 7_81、85、87和89中任一中一個或多個(幾個)位置包含改變的變體。
6.—種分離的多核苷酸,其編碼權利要求5的X46域,所述分離的多核苷酸選自下組 i)多核苷酸，其與SEQID勵:84、86或88中所示的乂46域編碼部分或其互補鏈具有至少60%，優選至少70%，更優選至少80%，更優選至少90%，更優選至少95%，至少96%，優選至少97%，優選至少98%，優選至少99%同一性；和 ii)多核苷酸，其在低嚴格條件下，優選中等，特別是高嚴格條件下與SEQIDN0:84、86或88的X46域編碼部分或其互補鏈雜交。
7.—種核酸構建體,其包含可操作地連接的權利要求6的多核苷酸和一個或多個(幾個)調控序列，所述調控序列指導所述多肽在表達宿主中的產生。
8.—種重組表達載體，其包含權利要求7的核酸構建體。
9.一種重組宿主細胞,其包含權利要求7的核酸構建體或權利要求8的載體。
10.一種用于產生權利要求5的X46域的方法,其包括(a)在有助于產生X46域的條件下培養權利要求9的重組宿主細胞；和(b)回收所述X46域。
11.一種用于從含淀粉材料產生發酵產物的工藝，其包括下述步驟 (a)在權利要求1-4任一項中定義的組合物和任選地α-淀粉酶的存在下液化含淀粉材料； (b)使用糖源生成酶糖化步驟(a)中獲得的液化材料； (C)使用發酵生物發酵。
12.權利要求11的工藝，進一步其中在步驟(a)、步驟(b)或步驟(C)過程中存在包含或組成為X46域的多肽，優選SEQ ID NO:2、4、6-81、85、87和89的多肽。
13.如權利要求1-4任一項所定義的組合物在從淀粉產生增甜劑的工藝中的用途。
14.如權利要求1-4任一項所定義的組合物在從糊化產生發酵產物如乙醇的工藝中的用途。
全文摘要
本發明提供一種組合物，所述組合物包含多肽并進一步包含淀粉降解酶，所述多肽包含或組成為X46域，及此類組合物的用途。所述包含或組成為X46域的多肽能夠增強淀粉降解酶的活性。
文檔編號C12P7/06GK102933227SQ201080064479
公開日2013年2月13日 申請日期2010年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者M.博徹特, P.F.哈林, 李明 申請人:諾維信公司