用還原劑對發酵抑制劑進行原位解毒的制作方法

專利名稱：用還原劑對發酵抑制劑進行原位解毒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于降低發酵期間漿料或水解產物的發酵抑制作用的方法。
背景技術：
基于正在減少的石油供應，由可再生資源生產商品的生物精制廠(biorefinery)提供了對煉油廠的替換物，并且允許朝向改善的能源安全的發展。來自林業和農業的木質纖維素殘余物作為原料是有吸引力的，因為它們是豐富的、相對便宜的、并且不用于食品。木質纖維素主要由木質素和兩種類型的多糖(纖維素和半纖維素)組成。多糖可在基于生物催化劑(例如工業上重要的面包酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)))的工
藝(process)中水解為糖并轉化為各種發酵產物如生物醇。纖維素的水解典型地以前是預處理，其中將半纖維素降解并使纖維素愈加易受水解纖維素酶或酸性水解的影響(accessible)。然而，該預處理過程典型地產生發酵抑制劑例如酚類化合物、脂族酸、以及呋喃醛，其可對發酵工藝的效率具有負面影響。此外，使工藝水(生產用水，process water)再循環以獲得成本有效且對環境無害的工藝可為合乎需要的。這樣的工藝循環可導致抑制劑的累積，其將促成差的發酵能力(fermentability)的問題。而且，水解本身，如果使用苛刻的(harsh)條件例如低的pH、高的溫度和/或過壓進行，可產生發酵抑制劑。

發明內容
提出了若干種方法以解決與抑制劑有關的問題。這些方法包括預處理條件的選擇，發酵程序的設計，菌株篩選，菌株適應(strain adaptation),突變、接著是篩選和基因工程。但是，操控預處理條件以減少抑制劑的形成或者選擇工藝設計以避免抑制劑問題可導致降低的糖產率、差的糖轉化率、或差的乙醇產率和生產率(productivity)。高的糖和乙醇產率和高的生產率對于大量/低附加值的產品例如燃料乙醇的成本有效的生產是必需的。水解產物的解毒，例如通過氫氧化鈣的添加，是所提出的另一種方法。但是，這樣的堿性解毒(alkali detoxification)可導致可發酵的糖的大量降解。此外，常規的解毒方法通常需要額外的工藝步驟，例如其中需要調節工藝物流的PH和/或溫度的步驟。本發明人已經認識到，本領域中需要用以克服與在由纖維素材料制造發酵產物時的發酵抑制有關的問題的改進的方法。因此，本發明的目的是提供用于降低發酵抑制的方法。為了滿足該目的，提供用于降低在得自纖維素的材料在發酵罐內的發酵中的發酵抑制的方法，其中通過向發酵罐添加至少一種還原劑來降低所述進行發酵的材料的發酵抑制性(fermentation inhibitory properties) 進一步地,提供提高發酵工藝(發酵過程,fermentation process)的發酵能力的方法，包括如下步驟a)測量發酵工藝的發酵能力，并且如果發酵能力低于參比值，則b)向發酵工藝添加至少一種還原劑。
具體實施例方式作為本發明的第一方面，提供用于降低在得自纖維素的材料在發酵罐內的發酵中的發酵抑制的方法，其中通過向發酵罐添加至少一種還原劑來降低所述進行發酵的材料的發酵抑制性。因此，提供用于降低在得自纖維素的材料在發酵罐內的發酵中的發酵抑制的方法，其特征在于向發酵罐添加至少一種還原劑以降低所述進行發酵的材料的發酵抑制性。“發酵”是本領域技術人員已知的工藝，且通常通過微生物在“發酵罐”中進行，“發 酵罐”是指可用于通過發酵制備目標化學品的任意類型的容器或反應容器。“發酵抑制”是指對發酵反應的負面影響，例如，降低發酵反應的速率或發酵反應中所產生的目標產物的總量。因此，“降低發酵抑制”是指降低這樣的負面影響。因此，降低發酵抑制可為對進行發酵的材料的解毒或調整(conditioning)，S卩，降低進行發酵的材料的一種或多種性質的影響，所述性質抑制底物到目標化學品的發酵生物體轉化(fermenting organism’ sconversion)。例如，“降低發酵抑制”可提高糖類消耗速率例如葡萄糖消耗速率、提高在發酵期間產生的目標化學品的總量、提高在發酵期間關于所消耗的糖類的目標化學品產率，即，提高由每個被消耗的糖類分子所產生的目標化學品分子的數量、或者提高目標化學品的體積生產率，例如，作為(g目標化學品X升―1※小時―1)度量。材料的“發酵抑制性”是指材料的例如通過降低發酵反應的循環(turnover)速率或在發酵反應中產生的目標產物的總量而對發酵反應具有負面影響的任何性質。因此，降低這樣的性質對發酵反應具有積極影響。“得自纖維素的材料”是指來源于纖維素和/或半纖維素的任何材料。例如，“得自纖維素的材料”可為得自木質纖維素的材料，如經預處理的和任選地水解的木質纖維素生物質。“還原劑”是指在其自身被氧化時能夠導致另一物質的還原的化學試劑，即，能夠在氧化-還原反應中給出電子的化學試劑。本發明是基于如下發現(insight):向發酵罐中直接添加還原劑提供原位解毒(in situ detoxification)并且是克服與纖維素材料向目標化學品的生物轉化有關的障礙的有效途徑。發酵能力的顯著改善可利用還原劑的相對少的添加實現，并且進一步地，還原劑與酶和發酵生物體如酵母是相容的，因而導致對酶或酵母性能的微小影響或沒有影響。此外，直接向發酵罐添加還原劑是有利的，因為不需要進行用于添加還原劑的任何額外的單獨步驟，所述額外的單獨步驟可促成更高的工藝成本。因此，直接向發酵罐添加還原劑允許充分的工藝靈活性，即，為了降低發酵抑制，不需要對通常的工藝設計進行調整或修改，因為在發酵步驟中進行了還原劑的添加。可在將發酵生物體添加到發酵罐之前或之后將還原劑添加到發酵罐。此外，還原劑可與發酵生物體同時添加。
此外，本發明的第一方面的原位解毒不要求在工業過程中引入經基因改造的微生物。根據本發明的第一方面的方法的進一步好處包括還原劑的添加可在適于發酵的PH下和在室溫或發酵溫度下進行，并且導致改善的發酵能力而不發生可發酵的糖的降解。根據第一方面的原位解毒的這些好處和簡易性提供了實現由木質纖維素水解產物更有效地制造發酵產物例如乙醇的方法。因此，根據本發明的第一方面的方法提供了來自纖維素材料的燃料如乙醇和其它化學品的有效生產。此外，得自纖維素的材料的發酵可通過發酵生物體進行，所述發酵生物體是指能夠將糖類發酵成目標化學品的生物體。發酵生物體可為至少一種真核或原核微生物，例如細菌和/或酵母。能夠將糖類發酵成其它化合物的細菌 和酵母的實例是本領域技術人員已知的。來自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和假絲酵母屬(Candida)的酵母可用作發酵生物體。發酵生物體可例如為野生型、突變的或重組的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。使用釀酒酵母(S. cerevisiae)通過發酵制造目標化學品是有利的，因為釀酒酵母在工業發酵中被廣泛使用且提供高的產物產率。在第一個方面的實施方式中，發酵是包括纖維素的材料的同步糖化和發酵(SSF)。SSF工藝是指其中在發酵罐中同時進行酶法水解和發酵的工藝。酶法水解是指由至少一種酶催化的水解反應。所述至少一種酶可為至少一種糖化酶，其是指可將纖維素生物質轉化或水解為可發酵的糖類如單糖和/或多糖的至少一種酶。這樣的糖化酶可為使多糖水解的糖苷酶。糖苷酶的實例包括纖維素水解糖苷酶(如纖維素酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(exoglucanase)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)和0_葡糖苷酶)、半纖維素水解糖苷酶(如木聚糖酶、內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、^ -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)、果膠酶和葡糖醒酸酶(glucuronase))、以及淀粉水解葡糖苷酶(如淀粉酶、a-淀粉酶、3 -淀粉酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶和異淀粉酶)、或者在 EC 3. 2. LxOBEC 3.2. I. 4，其中 EC 是 Enzyme Commission 編號)中找至Ij的酶的組中的任何酶。因此，在SSF工藝中，通過纖維素的酶法水解在發酵罐中直接制備可發酵的糖類，并通過發酵將所制備的糖類轉化為目標化學品。因此，在其中可能存在可發酵的糖類通過發酵生物體的連續循環的SSF工藝中，酶法水解反應的糖產率可更高，并且可防止可發酵的糖類的高濃度的建立。可發酵的糖類的高濃度對糖化酶可為抑制性的。此外，避免了游離糖的潛在損失，因為在SSF工藝中通過酶法水解制備的游離糖不需要在發酵前與得自纖維素的材料的其它部分分離。進一步地，SSF工藝減少了制備目標化學品所需要的容器的數量，由此降低了該工藝的總體成本。此外，所述發酵可為聯合生物工藝(consolidated bioprocess,CBP),其中使單糖轉化的生物催化劑也產生使纖維素材料水解的酶。在第一方面的實施方式中，得自纖維素的材料是由在與發酵分開的步驟中進行的水解獲得的水解產物。在本公開內容的上下文中，水解是指使纖維素材料(即包括纖維素和/或半纖維素的材料)經受水解條件，使得在水解產物中游離糖變得易得到(accessible)以用于進一步發酵。因此，纖維素材料的水解可在發酵前進行，使得在發酵開始前從纖維素材料釋放出游離糖。作為實例，在水解前纖維素材料可已被預處理。預處理纖維素材料是指使纖維素材料經受使得在隨后的水解中纖維素變得更易受影響的條件。預處理可涉及本領域技術人員已知的一種或若干種預處理方法。作為實例，預處理可以是酸性預處理或堿性預處理。此夕卜，預處理可以是浸潰，其是指用浸潰流體對纖維素材料進行浸潰，隨后加熱。所述流體可以是酸性溶液，例如無機酸溶液。也可以使用氣體如SO2氣體或CO2氣體、或者使用氣體與液體的組合進行浸潰。預處理也可包括汽蒸(Steaming)。汽蒸是指用于從纖維素生物質中驅逐出空氣以促進纖維素的進一步水解的工藝。汽蒸是用于對例如木質纖維素生物質進行預處理的公知方法。作為另一實例，預處理可涉及蒸汽爆破(steam explosion)。蒸汽爆破是用于使纖維素纖維破裂的結合了蒸汽、快速壓力釋放和水解的工藝。作為實例，所述方法可進一步包括對包括纖維素的材料進行酶法水解以獲得水解產物的步驟。因此，酶法水解和發酵可作為兩個單獨的工藝步驟進行。如果所述發酵反應和所述酶反應具有不同的最優溫度，這可例如為有利的。作為實例，可保持酶法水解期間的溫度高于發酵期間的溫度，由此促進嗜熱酶的利用。
此外，在酶法水解前，可對經預處理的纖維素材料進行中和。例如，可通過添加NaOH或氨水對經預處理的纖維素材料進行中和。也可使用CaOH2。作為進一步的實例，所述方法可進一步包括對包括纖維素的材料進行酸性水解以獲得水解產物的步驟。包括纖維素的材料的酸性水解是指使任選地預處理的纖維素材料經受酸性條件例如低于4或低于3的pH，使得從所述材料中釋放出游離糖。所述酸性條件可通過添加至少一種任選地稀釋的無機酸如硫酸、鹽酸、硝酸、磷酸、亞硫酸、硼酸和/或氫氟酸來實現。此外，所述水解可在升高的溫度和壓力下進行。所述水解可以一個或兩個步驟進行。多于兩個步驟是可能的選擇，但通常不需要。兩步水解可在兩個單獨的水解單元中和在兩種不同的酸性環境中進行，所述兩種不同的酸性環境可通過如下實現在兩個水解單元中添加不同的酸或不同的濃度，或在兩個單獨的水解單元中使用不同的溫度。在第一方面的實施方式中，得自纖維素的材料由紙漿制造工藝獲得。因此，得自纖維素的材料可以是來自制漿工業的工藝液體。此外，該工藝液體可具有懸浮固體物內容物(content)，例如包含纖維素纖維。這樣的包含纖維素纖維的工藝液體可在發酵前進行水解以進一步從纖維素纖維中釋放糖類。得自纖維素的材料可通常從紙漿制造工藝以大的量獲得，且通過由這樣的工藝獲得的得自纖維素的材料的發酵進行的目標化學品的生產可為成本有效的。作為實例，得自纖維素的材料可以是廢的蒸煮液。廢的蒸煮液是指來自制漿期間木材的蒸煮(煮解，digestion)的任何工藝液體。取決于所使用的制衆工藝，其可含有得自纖維素的材料和其它木材化學品(如木質素)和廢的蒸煮劑(digestant)。此外，得自纖維素的材料可以是來自纖維素材料的亞硫酸鹽制漿的工藝液體。亞硫酸鹽制漿是指通過使用亞硫酸的各種鹽提取木質素而由木質纖維素材料生產紙漿的工藝。來自亞硫酸鹽制漿的工藝液體通常包含得自半纖維素的單糖，且可因此進行發酵。在第一方面的實施方式中，向具有28_38°C的溫度的材料添加所述至少一種還原劑。因此，還原劑可在進行發酵的材料具有28_38°C的溫度時添加，這意味著還原劑可在適于發酵的溫度下添加。因此，可不需要用于調節溫度的額外的工藝步驟。初步結果表明，使用還原劑的解毒可以在多種pH水平下進行。但是，本發明人已經注意到，使用還原劑的解毒看來在高于3、例如高于4的pH下比在低于3、例如低于2. 5的PH下更有效率。這意味著，本發明人相信，如果在將經預處理的材料或經水解的材料(其經常具有約2的pH)中和之后進行解毒,則該解毒更有效率。因此，在第一方面的實施方式中，將所述至少一種還原劑添加到具有3-7、如4-6、或如5-6的pH的材料中。這意味著，還原劑可在適合于水解和/或發酵的pH下添加。例如，發酵和SSF常常在約5. 5的pH下進行。因此，可不需要用于調節pH的額外工藝步驟。在第一方面的實施方式中，得自纖維素的材料為得自木質纖維素的材料。得自木質纖維素的材料是指可由木質纖維素獲得的材料，其包括纖維素、木質素 和可能的半纖維素。得自木質纖維素的材料可例如得自木材殘余物或林業殘余物(如木屑、鋸木廠或造紙廠廢棄物)、或農業殘留物。作為實例，得自木質纖維素的材料可以是得自木材的材料或得自甘蔗渣的材料。取決于地理位置，木材或甘蔗渣可以大的量獲得，使得它們作為原材料是有吸引力的。得自纖維素的材料可例如為木材或甘蔗渣的水解產物。在第一方面的實施方式中，所述至少一種還原劑包含硫。作為實例，所述至少一種還原劑可以選自連二亞硫酸鹽和亞硫酸鹽。這些還原劑已經表明適合用于降低發酵抑制，如在本公開內容的實施例中所示的。亞硫酸鹽(so32_)用于若干種大規模工業過程中。連二亞硫酸鹽(S2O42O是在紙漿和造紙工業中用于還原性漂白和在紡織工業中用作染色工藝中的還原劑的工業化學品。因此，亞硫酸鹽和連二亞硫酸鹽兩者都可以大的量獲得。進一步地，將理解，還原劑可包括鹽形式的亞硫酸鹽和/或連二亞硫酸鹽，即，與不同的陽離子復合(complex)。實例包括 Na2S03、NaHS03、KHSO3 和 Na2S204。作為實例，還原劑可以是連二亞硫酸鹽，并且連二亞硫酸鹽可以使得發酵期間連二亞硫酸鹽的濃度為1-30禮、例如5-25mM、例如7. 5_20mM的量添加。作為進一步的實例，還原劑是亞硫酸鹽，并且亞硫酸鹽以使得發酵期間亞硫酸鹽的濃度高于10mM、例如高于15mM、例如高于20mM的量添加。連二亞硫酸鹽和亞硫酸鹽的這些濃度分別已經表明適合用于降低發酵抑制，如在本公開內容的實施例中所示的。但是，添加超過IOOmM的亞硫酸鹽對于發酵工藝可為不利的。因此，為了實現發酵抑制性的降低所需的連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽的量是相對低的，并且來自本公開內容的實施例的結果顯示，連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽的這樣的量允許使用例如SSF程序生產高水平的乙醇。進一步地，與亞硫酸鹽相比，添加連二亞硫酸鹽可為更有利的，因為當添加至相同濃度時，與亞硫酸鹽相比，連二亞硫酸鹽的添加導致發酵抑制的更大降低，如本公開內容的實施例中所見的。因此,通過添加比亞硫酸鹽低的濃度的連二亞硫酸鹽，可以實現相同的發酵抑制效果。添加比亞硫酸鹽低的濃度的連二亞硫酸鹽還意味著發酵期間的總的鹽濃度較低，這對于發酵反應可為有利的。可用作還原劑的其它化合物包括硫代硫酸鹽(S2O32O (例如Na2S2O3 5H20和Na2S2O3)、堿分解的糖(alkali-decomposed sugar)、抗壞血酸、半胱氨酸、二乙醇胺、三乙醇胺、二硫蘇糖醇(DTT)和還原谷胱甘肽。在本發明的實施方式中，在得自纖維素的材料的發酵中產生乙醇。乙醇是可源自纖維素生物質且可通過發酵產生的目標化學品。目標化學品也可以是丁醇或琥珀酸，其也可源自纖維素材料。目標化學品的其它實例是其它的醇或酸、烷烴、烯烴、芳族化合物、醛、酮、生物聚合物、蛋白質、肽、氨基酸、維生素、抗生素和其它藥品。在本發明第一方面的實施方式中，向其添加還原劑的材料具有至少5%(重量/重量)、例如至少10%(重量/重量)、例如至少12%(重量/重量)的懸浮固體物含量。已經發現，可將還原劑添加至具有相對高的固體物含量的纖維素材料，例如，進行SSF或CBP的纖維素材料。這使得能夠對經預處理的纖維素材料漿料進行解毒或調整而沒有任何固體物分離步驟。這樣的原位解毒或調整提供了目標化學品的高產品產率以及成本有效的收取，例如，通過蒸餾。在本發明第一方面的實施方式中，向其添加還原劑的材料具有至少45g/l、例如至少65g/l、例如至少85g/l的糖濃度。因此，可將還原劑添加到具有高的糖濃度的纖維素材料中，例如，添加到經水解的纖維素材料中。 在本公開內容的上下文中，“糖”是指可發酵的糖類，例如，可發酵的單糖和二糖。在本發明的實施方式中，根據本發明第一方面的方法進一步包括測量經水解的材料的發酵的發酵能力；并且如果所測量的發酵能力低于參比值，則向所述發酵添加至少一種還原劑。在本公開內容的上下文中，發酵的“發酵能力”是與發酵工藝的結果成比例的任意參數。作為實例，發酵能力可以是糖消耗速率、所產生的目標化學品的量、關于所消耗的糖的所產生的目標化學品的產率和/或目標化學品的體積生產率。糖消耗速率可以每小時的糖濃度的降低來度量，目標化學品的量可以g目標化學品/升來度量，關于所消耗的糖的所產生的目標化學品的產率可通過監測在發酵期間的糖類濃度的降低和目標化學品濃度的增加以由每個被消耗的糖類分子所產生的目標化學品分子的數量來度量，并且目標化學品的體積生產率可以每升和每小時的目標化學品克數來度量。此外，發酵能力可通過測量總的糖濃度來度量。如果例如發酵生物體在SSF工藝中變得不太有效率，則可以測量總的糖濃度的提高。因此，發酵能力也可以是總的糖濃度的相反值。因此，本發明人已經進一步發現，在用于由纖維素生物質生產目標化學品的工藝中，向具有低發酵能力的發酵工藝中添加至少一種還原劑可提高該工藝的發酵能力。因此，這提供了“挽救”在某些方面未正常運轉的發酵工藝的可能性。作為實例，在發酵工藝中可以連續地監測葡萄糖消耗速率，并且如果該速率低于令人滿意的參比水平，則可以添加還原劑以提高葡萄糖消耗速率。可例如選擇發酵能力的參比值，使得具有低于該參比值(例如低于一定的葡萄糖消耗速率)的發酵能力的發酵工藝導致目標化學品的不令人滿意的量，并且具有高于該參比值(例如高于一定的葡萄糖消耗速率)的發酵能力的發酵工藝導致目標化學品的合乎需要的量。在本公開內容的教導下，本領域技術人員知道如何選擇發酵能力的參比值。在參考下面的圖8的實施例中顯示，即使添加還原劑，已長時間經受抑制劑的發酵中的發酵能力也可能不完全恢復。不受任何科學理論的束縛，本發明人相信，這可能是由于部分酵母死亡。因此，在正在進行的發酵或SSF中的發酵能力不足的情況下，除還原劑外之還可以添加額外的酵母。額外的酵母可以在添加還原劑之前、同時或之后添加。例如，酵母和還原劑可在兩小時內、例如在I小時或30分鐘內添加。在用于通過發酵生產目標化學品的工藝中，工藝水的再循環通常導致工藝水的抑制性的累積。但是，由于根據本發明的第一方面的還原劑的添加降低了發酵抑制，可進行工藝水的再循環而沒有抑制性的任何有害累積。因此，在第一方面的實施方式中，所述方法進一步包括任選地純化之后，將由目標化學品的生產所得到的水的至少一部分再循環至目標化學品生產中的步驟的至少一個。再循環工藝水是指在用于生產目標化學品的工藝中在上游重新使用工藝水。作為實例，可將發酵液的部分或全部再循環。此外，如果通過蒸餾從發酵液中提取目標化學品，可將釜餾物(例如釜餾物的濾液)的部分或全再循環。再循環的工藝水可例如用作纖維素材料的預處理中的預處理流體、纖維素材料的水解中的水解液、或者糖的發酵中的發酵液。因此，工藝水的再循環減少了在由纖維素生物質生產目標化學品時引入新鮮水的需要。 在本發明的第二方面中，提供提高發酵工藝的發酵能力的方法，包括如下步驟a)測量發酵工藝的發酵能力，并且如果發酵能力低于參比值，則b)向發酵工藝添加至少一種還原劑。本發明的第二方面中所用的術語和定義如關于上述第一方面所定義的。此外，第一方面的實施方式加以必要的變更地應用于第二方面。本發明的第二方面是基于如下發現向其中發酵能力低的發酵工藝添加還原劑可提高該工藝的發酵能力。因而，這提供了“挽救”在某些方面未正常運轉的發酵工藝的可能性。作為例子，發酵能力可為糖消耗速率、所產生的目標化學品的量、關于所消耗的糖的所產生的目標化學品的產率和/或目標化學品的體積生產率。如上所述，發酵能力也可以是總的糖濃度的相反值。在本發明公開內容的教導下，本領域技術人員知道如何選擇發酵能力的參比值。


圖I顯示具有云杉水解產物的單獨的水解和發酵的實驗中的葡萄糖消耗。圖中的每個點作為兩次發酵的平均值計算。誤差條(error bar)表示標準偏差。數據表示■:添加連二亞硫酸鹽(5mM), :添加連二亞硫酸鹽(IOmM),-:添加亞硫酸鹽(5mM), ▲:添加亞硫酸鹽(IOmM)， 未經處理的水解產物，X =NH4OH處理以及+ :參比發酵。圖2顯示在云杉水解產物的14小時發酵(單獨的水解和發酵實驗)后的乙醇產量(production) (g/L)。每個條作為兩次發酵的平均值計算。誤差條表示標準偏差。圖3顯示具有甘蔗渣水解產物的單獨的水解和發酵的實驗中的葡萄糖消耗。圖中每個點作為兩次發酵的平均值計算。誤差條表示標準偏差。數據表示■:連二亞硫酸鹽處理(5mM), :連二亞硫酸鹽處理(10. OmM),-:亞硫酸鹽(5mM), ▲:亞硫酸鹽處理(10. OmM)， :未經處理的水解產物，X =NH4OH處理以及+ :參比發酵。圖4顯示在甘蔗渣水解產物的6小時發酵后的乙醇產量(g/L)(單獨的水解和發酵)。每個條作為兩次發酵的平均值計算。誤差條表示標準偏差。圖5顯示在云杉漿料的同步糖化和發酵期間的乙醇產量。圖中的每個點作為兩次發酵的平均值計算。誤差條表示標準偏差。數據表示■:連二亞硫酸鹽處理(7.5禮)，令連二亞硫酸鹽處理(IOmM), X :亞硫酸鹽處理(7. 5mM) ,▲:亞硫酸鹽處理(IOmM),以及 未經處理的漿料。圖6顯示在具有不同濃度的連二亞硫酸鹽添加的云杉漿料的同步糖化和發酵期間的乙醇產量。數據表示■，實線連二亞硫酸鹽處理(2. 5mM) ; ，實線連二亞硫酸鹽處理(5mM) ;▲，虛線連二亞硫酸鹽處理(7. 5mM) ; ，實線連二亞硫酸鹽處理(IOmM) ;□，實線連二亞硫酸鹽處理(15mM) ; ，實線連二亞硫酸鹽處理(20mM) ;A，實線連二亞硫酸鹽處理(30mM)。圖7顯示在具有不同濃度的亞硫酸鹽添加的云杉漿料的同步糖化和發酵期間的乙醇產量。數據表示■，實線亞硫酸鹽處理(2.5mM) ; ，實線亞硫酸鹽處理(5mM)；▲，虛線亞硫酸鹽處理(7. 5mM) ; ，實線亞硫酸鹽處理(IOmM) ;□，實線亞硫酸鹽處理(15mM) ; ,實線亞硫酸鹽處理(20mM) ;A,虛線亞硫酸鹽處理(30mM)。圖8顯示在云杉漿料的24小時(黑條)、48小時(灰條)和72小時(白條)的 同步糖化和發酵后的乙醇產量(g/L)。數據表示(A)在接種前10分鐘添加的IOmM連二亞硫酸鹽、⑶在接種前10分鐘添加的IOmM亞硫酸鹽、(C)在接種時添加的IOmM連二亞硫酸鹽、(D)在接種時添加的IOmM亞硫酸鹽、(E)在接種后45分鐘添加的IOmM連二亞硫酸鹽、(F)在接種后45分鐘添加的IOmM亞硫酸鹽、(G)在接種后105分鐘添加的IOmM連_■亞硫酸鹽、(H)在接種后105分鐘添加的IOmM亞硫酸鹽、(I)在接種后240分鐘添加的IOmM連_■亞硫Ife鹽、(J)在接種后240分鐘添加的IOmM亞硫酸鹽、(K)在接種后480分鐘添加的IOmM連二亞硫酸鹽、(L)在接種后480分鐘添加的IOmM亞硫酸鹽、以及(M)未添加還原劑的云杉漿料。給出基于兩次測量結果的平均值。誤差條表示標準偏差。圖9顯示在甘蔗渣漿料的13小時(白條)和45小時(黑條)的同步糖化和發酵后的乙醇產量(g/L)。數據表示(A)添加IOmM連二亞硫酸鹽、(B)添加7. 5mM連二亞硫酸鹽、(C)添加IOmM亞硫酸鹽、(D)添加7. 5mM亞硫酸鹽、(E)未添加還原劑的甘鹿洛衆料。每個條表不兩次平行的SSF實驗的平均值。誤差條表不標準偏差。圖10顯示在不同處理后在由酸性水解制備的云杉水解產物的發酵期間的葡萄糖消耗。+:連二亞硫酸鈉處理(2. 5mM) ；X :連二亞硫酸鈉處理(5. OmM) :連二亞硫酸鈉處理(7. 5mM) ； :連二亞硫酸鈉處理(10. OmM) ；■:連二亞硫酸鈉處理(12. 5mM) ；▲:連二亞硫酸鈉處理(15mM)。圖11顯示在不同處理后在由酸性水解制備的云杉水解產物的發酵期間的葡萄糖消耗。X :未經處理的水解產物； 亞硫酸鈉處理(0. 1%)；-:亞硫酸鈉處理(1%) ；▲:亞硫酸鈉處理(15mM) ；■ :NH40H處理； :糖溶液。圖12顯示具有2. 5mM松柏醛的糖溶液的葡萄糖消耗。 :具有松柏醛的糖溶液(2. 5mM)。■:具有松柏醛(2. 5mM)和連二亞硫酸鈉處理(IOmM)的糖溶液。圖13顯示在用DTT(二硫蘇糖醇)處理后在由酸性水解制備的云杉水解產物的發酵期間的葡萄糖消耗。■:未經處理的水解產物；( ):用20mM DTT處理。
實施例下面的非限制性實施例將進一步說明本發明。實施例I.對照試驗亞硫酸鹽和連二亞硫酸鹽對通過酶法水解制備的水解產物的糖類濃度的影響材料和方法通過熱化學預處理和隨后的酶法水解，由云杉木和甘蔗渣制造木質纖維素水解產物。對于使用甘蔗渣的SHF (單獨的水解和發酵)實驗，將Ikg (干重，DW)經干燥的甘蔗渣用500g稀硫酸(4%)浸潰，并保持在塑料袋中20小時。然后將經浸潰的甘蔗渣裝入30升反應器中。使用蒸汽在195°C的溫度和14. I巴的壓力下處理該材料15分鐘。將經預處理的材料(此后稱作甘蔗渣漿料)冷卻并在4°C下儲存直至進一步使用。云杉的預處理是在瑞典的纖維素乙醇中試設備(通過瑞典OmskOldsvik的SEKAB運行)中通過SEKAB E-Technology進行的。在30升反應器中在203°C的溫度下在2. 0-2. 3的pH下使用二氧化硫以連續模式用5分鐘的停留時間處理未剝皮的木屑。每40kg木屑使 用Ikg 二氧化硫，干物質含量為25-27%。將該經預處理的材料(此后稱作云杉漿料)冷卻并在4°C下儲存直至進一步使用。用于SSF實驗的甘蔗渣的預處理是在瑞典的纖維素乙醇中試設備(通過瑞典Omskeldsvik的SEKAB E-Technology運行)中進行的。在30升反應器中在198_199°C的溫度下以連續模式用13-14分鐘的停留時間處理甘蔗渣。進料速率為24kg(干重)/h，且甘蔗渣用二氧化硫(0. 5kg/h)浸潰。預處理后的pH為2. 7。干物質含量為19%。將經預處理的材料冷卻并在4°C下儲存直至進一步使用。用5M氫氧化鈉溶液將甘蔗渣漿料的pH調節至5. 3。然后將該漿料過濾并去掉液體部分的一部分以得到干物質含量為10%的漿料。在四個2升搖瓶中裝入750g漿料。用5M氫氧化鈉溶液將云杉漿料的pH調節至5. 3。在六個750mL搖瓶中裝入350g漿料。干物質含量為16%。將市售的纖維素酶和纖維二糖酶制劑添加到所述漿料中。來自里氏木霉(Trichoderma reesei) ATCC 26921的纖維素酶制劑具有700內切葡聚糖酶單位(E⑶)/g的宣稱活力(stated acitvity) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)，且負載(loading)為319E⑶/g固體物(DW)。纖維二糖酶制劑Novozyme 188具有250纖維二糖酶單位(CBU)/g的宣稱活力(Sigma-Aldrich)，且負載為23CBU/g固體物(DW)。酶的劑量是基于一組小規模實驗的結果。在添加酶后，在50°C和70rpm下在振蕩下將所述漿料培養48小時(InforsEcotron, InforsAG, Bottmingen, Switzerland)。在水解后，將所述漿料過濾，并通過高效液相色譜法(HPLC)測量所述漿料中的釋放的葡萄糖和甘露糖的量。將液體部分(此后稱為甘蔗渣和云杉水解產物)的PH用12M鹽酸溶液調節至2. 0以防止在儲存期間的微生物生長。通過蒸發(Rotavapor Buchi001, Biichi Labortechnik AG,Flawil, Switzerland)將甘鹿禮:水解產物濃縮以得到與云杉水解產物中相似的葡萄糖濃度。將水解產物在4°C下儲存直至進一步使用。用5M氫氧化鈉溶液將甘蔗渣和云杉水解產物的pH調節至5. 5。在八個裝有磁力攪拌棒的IOOmL玻璃容器中進行各水解產物的調整。向所有容器添加26mL水解產物，并將所述容器放在磁力攪拌板(IKA-Werke, Staufen, Germany)上。將連二亞硫酸鈉(化學級；>87%,Merck, Darmstadt, Germany)以5和IOmM的濃度添加到水解產物中。還進行亞硫酸鈉到5mM和IOmM的添加。在室溫(23°C )下進行所述添加，并將樣品在攪拌下保持10分鐘。進行一式兩份所述實驗。將還原劑的添加功效與堿性解毒進行比較。因此，在前述條件下用氫氧化銨處理水解產物樣品(Alriksson 等(2006)，Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132，599-611)。將pH調節至9并在攪拌下使水解產物在55°C下保持3小時。通過使用高效液相色譜法(HPLC)進行單糖和呋喃醛[糠醛和2-羥甲基糠醛(HMF)]的分析。在裝有YL9170系列折射率(RI)檢測器的YoungLin YL9100系列系統(YoungLin, Anyang, Korea)中使用 Shodex SH-IOll 柱(6u m,8X300mm)(ShowaDenko, Kawasaki, Japan)以進行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、HMF和糠醛的分析。用0. OlM H2SO4水溶液的等度流(isocratic flow)進行洗脫。流速為I. OmL/min,并將柱溫設定為50°C。為了分析木糖和阿拉伯糖，將ShodexSP-0810柱(7 ii m，8 X 300mm)與相同的HPLC系統一起使用。使用Milli-Q水以I. OmL/min的流速進行洗脫，并將柱溫設定為80°C。使用YLClarity軟件(YoungLin, Anyang, Korea)進行數據分析。根據前述方法(Nilvebrant等人(2001), AppI. Biochem. Biotechnol. 91-93，35-49)使用 HPLC (MoRe Research, OrnskdIdsvik,Sweden)進行酌■類化合物的總量的測定。通過使用酶試劑盒(enzymatic kit)進行乙醇測量(乙醇UV法，BoehringerMannheim GmbH, Mannheim, Germany)。進行發酵實驗以評價所述添加和處理的有效性。為了對比，在發酵實驗中包括未經處理的水解產物以及基于糖的培養基(medium)的參比發酵，其具有與水解產物樣品中對應的可發酵的糖(即葡萄糖和甘露糖)的量。使用面包酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)) ( Jfistbolagef AB, Rotebro, Sweden)進行所述發酵。在具有300mLYEro培養基(2%酵母提取物，1%蛋白胨，2%D_葡萄糖)的750mL棉塞搖瓶(cotton-plugged shake flask)中制備酵母接種體。在30°C下在攪拌下對所述瓶進行接種和培養約12小時。在后期指數生長階段(late exponential growth phase)通過以1500g離心分離(Hermla Z206A, Hermle Labortechnik GmbH, Wehingen, Germany) 5 分鐘而收獲細胞(cell)。將細胞再懸浮于適量的無菌水中以在所有發酵容器中實現由2. Og/L(細胞干重)組成的接種體。發酵在14個裝有用于攪拌的磁體并用橡膠塞密封的25mL玻璃瓶中進行，所述橡膠塞用插管刺穿以用于排放二氧化碳。將水解產物樣品(23.75mL)或者用于參比發酵的糖溶液與0. 5mL營養液(I50g/L酵母提取物，75g/L (NH4)2HPO4, 3. 75g/LMgS047H20,238. 2g/LNaH2P04H20)和0. 75mL酵母接種體一起添加到發酵瓶中。在30°C下，在具有磁力攪拌(IKA-Werke)的水浴中，對所述瓶進行培養。在發酵期間取出用于測量糖和乙醇的樣品。通過使用葡萄糖儀(glucometer) (Glucometer Elite XL, Bayer AG, Leverkusen, Germany)評估發酵期間的葡萄糖水平。結果用于SHF實驗的云杉和甘蔗渣水解產物的制備導致具有超過80g/L葡萄糖和大于100g/L單糖的水解產物(表I和2)。在這兩種水解產物中，葡萄糖均為主要的可發酵的糖，但是，如所預料的，云杉水解產物含有大量的甘露糖(表I)。如通過HPLC所評估的，酚類化合物的總濃度相對相似。這兩種水解產物都含有約4g/L的呋喃醛以及糠醛的約3倍的HMF。云杉水解產物中脂族酸的含量稍高于甘蔗渣水解產物中脂族酸的含量。在這兩種情況中，在脂族酸之中，醋酸均為最普遍的。
單糖的濃度不受連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽的添加的影響(表I和2)。但是，與添加連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽相比，堿性解毒，即NH4OH的添加，導致更低的糖濃度。例如，堿性解毒后的云杉水解產物的葡萄糖濃度僅為約70g/L，然而，連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽的添加導致超過80g/L的葡萄糖濃度。與使用連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽時相比，堿性解毒還導致云杉水解產物中的較少量的木糖、半乳糖和甘露糖。此外，與添加連二亞硫酸鹽或亞硫酸鹽時相比，堿性解毒導致甘蔗渣水解產物中的較少量的木糖和半乳糖(表I和2)。因此，與堿性解毒相比，連二亞硫酸鹽和亞硫酸鹽的添加導致更高的糖濃度。表I.用于具有單獨的水解和發酵的實驗的云杉水解產物中的單糖和抑制劑的濃度(g/U。所使用的縮寫=Galact=半乳糖；Arabin=阿拉伯糖；Phen=酹類化合物；HMF=2-p5甲基糠醒；Untreat. hydro=未經處理的水解產物；NH40H_detox.=氫氧化銨解毒。
權利要求
1.用于降低發酵罐中得自纖維素的材料的發酵中的發酵抑制的方法，其特征在于，向所述發酵罐添加至少一種還原劑以降低所述進行發酵的材料的發酵抑制性。
2.根據權利要求I的方法，其中所述發酵是包括纖維素的材料的同步糖化和發酵(SSF)。
3.根據權利要求I的方法，其中，所述得自纖維素的材料是由在與所述發酵分開的步驟中進行的水解獲得的水解產物。
4.根據權利要求3的方法，進一步包括對包括纖維素的材料進行酶法水解以獲得所述水解產物的步驟。
5.根據權利要求3的方法，進一步包括對包括纖維素的材料進行酸性水解以獲得所述水解產物的步驟。
6.根據權利要求I的方法，其中所述得自纖維素的材料由紙漿制造工藝獲得。
7.根據前述權利要求中任一項的方法，其中將所述至少一種還原劑添加到具有28-38 °C的溫度的材料中。
8.根據前述權利要求中任一項的方法，其中將所述至少一種還原劑添加到具有3-7、例如4-6的pH的材料中。
9.根據前述權利要求中任一項的方法，其中至少一種還原劑選自連二亞硫酸鹽和亞硫酸鹽。
10.根據前述權利要求中任一項的方法，其中在所述得自纖維素的材料的所述發酵中產生乙醇。
11.根據前述權利要求中任一項的方法，其中，向其中添加所述還原劑的材料具有至少5%(重量/重量)、例如至少10%(重量/重量)、例如至少12%(重量/重量)的懸浮固體物含量。
12.根據前述權利要求中任一項的方法，其中，向其中添加所述還原劑的材料具有至少45g/l、例如至少65g/l、例如至少85g/l的糖濃度。
13.根據前述權利要求中任一項的方法，進一步包括測量經水解的材料的所述發酵的發酵能力；和如果所述測量的發酵能力低于參比值，則向所述發酵添加至少一種還原劑。
14.根據前述權利要求中任一項的方法，進一步包括任選地純化之后，將由所述目標化學品的所述生產得到的工藝水的至少一部分再循環到所述目標化學品生產中的步驟的至少一個。
15.提高發酵工藝的發酵能力的方法，包括如下步驟 a)測量所述發酵工藝的發酵能力，和如果所述發酵能力低于參比值，則 b)向所述發酵工藝添加至少一種還原劑。
16.根據權利要求15的方法，其中步驟b)進一步包括向所述發酵工藝添加酵母。
全文摘要
本發明提供用于降低發酵罐中得自纖維素的材料的發酵中的發酵抑制的方法，其中通過向發酵罐添加至少一種還原劑來降低進行發酵的材料的發酵抑制性。此外，提供提高發酵工藝的發酵能力的方法，包括如下步驟測量該發酵工藝的發酵能力，和如果該發酵能力低于參比值，則向該發酵工藝添加至少一種還原劑。
文檔編號C12P19/14GK102770551SQ201080064461
公開日2012年11月7日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月21日
發明者B.阿爾里克森, L.瓊森, S.萬斯特羅姆 申請人:瑞典乙醇化工技術有限公司