新肺炎病毒組合物及其使用方法

專利名稱：新肺炎病毒組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及病毒學(xué)領(lǐng)域，并且更特定是在包括犬和貓?jiān)趦?nèi)的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的副粘病毒(Paramyxoviridae)科,肺炎病毒(Pneumovirinae)亞科的新發(fā)現(xiàn)病毒。
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背景技術(shù)：
關(guān)在一起的家犬，如在收容所、犬舍或繁育基地中，經(jīng)常受到急性呼吸道感染(犬窩咳)影響。該疾病快速傳播并難于消除，因?yàn)樾聞?dòng)物會(huì)不斷引入。一系列試劑會(huì)產(chǎn)生多 個(gè)和順序重疊感染的復(fù)雜綜合征，使診斷和治療困難。受影響犬的臨床征兆從輕度干咳和流鼻涕液到嚴(yán)重病例的肺炎和死亡。貓也被多種試劑感染，產(chǎn)生不同嚴(yán)重程度的呼吸窘迫。相同或相似病毒也能感染人。因此，當(dāng)前且仍需要確定感染多種哺乳動(dòng)物的試劑和發(fā)展用于診斷、預(yù)防和/或治療這種感染的組合物和方法。本發(fā)明滿足了這些需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于新肺炎病毒的發(fā)現(xiàn)。所述病毒能感染不同類型的哺乳動(dòng)物，包括但不必需限于犬、貓和可能的人。病毒的出現(xiàn)可與犬的急性呼吸疾病(ARDC)或貓呼吸疾病，或人或其他哺乳動(dòng)物的呼吸或其他疾病正關(guān)聯(lián)。發(fā)明提供病毒的分離多核苷酸和蛋白以及分離病毒本身。發(fā)明包括檢測(cè)病毒的組合物和方法，以及預(yù)防和/或治療與病毒出現(xiàn)正相關(guān)的疾病征兆的方法和組合物。也提供包括病毒的分離細(xì)胞。發(fā)明的病毒是負(fù)鏈RNA病毒。發(fā)明包括分尚負(fù)鏈,與負(fù)鏈反向互補(bǔ)的正鏈,RNA多核苷酸的DNA等價(jià)物，正鏈編碼的蛋白，以及多核苷酸和蛋白的片段。某些實(shí)施方式中，經(jīng)分離病毒包含的負(fù)鏈多核苷酸含有序列SEQ IDNO: I或與SEQID NO: I序列至少96%相同的序列。也提供包含SEQ IDN0:2或SEQ ID NO: 3序列的分離多核苷酸，或具有與SEQ ID N0:2或3序列至少96%相同的序列的多核苷酸。發(fā)明提供刺激哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法。刺激免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞介導(dǎo)，體液或其結(jié)合，并能對(duì)動(dòng)物提供預(yù)防和/或治療益處。刺激免疫反應(yīng)的方法包括給予哺乳動(dòng)物包括本文所述多核苷酸和/或病毒，本文所公開(kāi)病毒多核苷酸編碼的病毒蛋白，所述蛋白的片段或其組合的組合物。多核苷酸，病毒和/或蛋白和/或其片段能從任何合適來(lái)源分離，或能用熟知技術(shù)重組生成。發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物所得生物樣品中病毒出現(xiàn)的方法。所述方法包括從哺乳動(dòng)物獲得生物樣品并從生物樣品中檢測(cè)病毒包括的多核苷酸序列，或病毒蛋白或其片段。多核苷酸、蛋白、蛋白片段或其組合的出現(xiàn)指示哺乳動(dòng)物被病毒感染。附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖I.使用人類呼吸道合胞病毒特異性單克隆抗體(Mab)的A72細(xì)胞免疫熒光分析。A)感染細(xì)胞上的Mab 2G122。B)未感染細(xì)胞上的Mab2G122。C)感染細(xì)胞上的Mab5H5N。D)未感染細(xì)胞上的Mab 5H5N。從生產(chǎn)商獲得的初級(jí)Mab儲(chǔ)液以1:100稀釋使用。紅色背景通過(guò)用伊文思藍(lán)復(fù)染產(chǎn)生。圖2.免疫熒光分析顯示定向用于感染和未感染犬A72細(xì)胞的非呼吸相關(guān)測(cè)試的隨機(jī)選定犬血清的反應(yīng)性。A)1:320稀釋的感染細(xì)胞血清。B) 1:320稀釋的未感染細(xì)胞血清。紅色背景由用伊文思藍(lán)復(fù)染生成。圖3.包括SEQ ID NO: I序列的病毒基因組構(gòu)成的圖示。發(fā)明描述本發(fā)明提供新型分離病毒，分離的病毒多核苷酸和蛋白，檢測(cè)病毒的組合物和方法，和預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物中與病毒出現(xiàn)正相關(guān)的疾病征兆的組合物和方法。 發(fā)明的病毒是負(fù)鏈RNA病毒。因此，病毒顆粒中包裝的遺傳材料是與正鏈反向互補(bǔ)的單鏈RNA。由RNA依賴的RNA聚合酶從負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄生成正鏈。正鏈至少有部分mRNA功能，因?yàn)橛烧溇幋a的病毒蛋白在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中翻譯，并且之后參與新病毒顆粒的組裝和負(fù)鏈基因組的包裝。在某些實(shí)施方式中，發(fā)明提供分離的病毒包括含有序列SEQ ID NO: I或與SEQ IDNO: I序列至少96%相同序列的負(fù)鏈多核苷酸。發(fā)明也提供與負(fù)鏈互補(bǔ)的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4所示序列，或與SEQ ID NO:4至少96%相同的序列。也提供分離多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO: I序列或與SEQ ID NO: I序列至少96%相同的序列，或包括SEQ ID N0:4序列或與SEQ ID N0:4序列至少96%相同的序列。也提供包括SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3序列的多核苷酸，或具有與SEQ ID NO:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸。也提供與所述序列和與反向互補(bǔ)物至少96%相同序列的反向互補(bǔ)序列。本文公開(kāi)的所有這些多核苷酸和蛋白和其片段的結(jié)合也包括在發(fā)明中。能鑒定發(fā)明提供的病毒多核苷酸，其功能在于支持活病毒復(fù)制(包括減毒病毒)。也提供包括病毒的細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方式中，包括病毒的細(xì)胞是分離細(xì)胞，或體外增殖以使病毒減毒的細(xì)胞，和/或用于疫苗或其他目的的病毒來(lái)源。因此，包括病毒的分離細(xì)胞，包括病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞系，細(xì)胞培養(yǎng)基中出現(xiàn)的病毒和/或病毒產(chǎn)物，和包括病毒的分離組織都是發(fā)明的各個(gè)方面。在特定實(shí)施方式中，提供本發(fā)明所述各RNA序列的DNA等價(jià)物。因此，發(fā)明包括本文所述各RNA序列，其中RNA中的每個(gè)U (尿嘧啶)被T (胸腺嘧啶)取代。本發(fā)明所述的每個(gè)病毒多核苷酸包括與各多核苷酸指定SEQ ID NO中所存在序列相同的多核苷酸，并且還包括與病毒SEQ IDNO中所存在序列至少96%相同的所有多核苷酸。在特定實(shí)施方式中，與序列表所示多核苷酸序列至少96%相同的多核苷酸與那些跨其全長(zhǎng)的序列至少96%相同。不希望受任何特定理論的束縛，認(rèn)為本文出現(xiàn)和包括那些與序列表所列病毒多核苷酸序列有至少96%相同的多核苷酸序列與相關(guān)病毒例如已知感染鼠哺乳動(dòng)物的病毒所含多核苷酸不同。不希望受任何特異理論的束縛，還認(rèn)為病毒的減毒，例如連續(xù)傳代，能產(chǎn)生包括和/或轉(zhuǎn)錄與序列表所示序列至少96%相同的多核苷酸的病毒。與序列表中特定引用序列不同的序列可與所示序列有96. 0%-99. 9%相同，包括其間到第一小數(shù)點(diǎn)的所有整數(shù)。96. 0%-100%序列相同性的所有范圍(含端值)也是發(fā)明的實(shí)施方式。
多核苷酸的片段也包括在本發(fā)明中。因此，在多個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)病毒多核苷酸(包括反向互補(bǔ)物和其DNA等價(jià)物)包括多核苷酸片段，長(zhǎng)度從10個(gè)核苷酸到多核苷酸的全長(zhǎng)，并包括其間所有整數(shù)。例如，本發(fā)明包含多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID N0:1序列且包含其序列所有片段，包含10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度到多至8，598個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且包含其間所有整數(shù)。本發(fā)明提供的多核苷酸，無(wú)論是否在病毒顆粒中出現(xiàn)，可以比本文所述那些更長(zhǎng)，因?yàn)樗拘蛄锌赡懿话暾《净蚪M序列和/或反向互補(bǔ)物和/或其DNA等價(jià)物。發(fā)明也提供刺激哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法。經(jīng)刺激免疫反應(yīng)是能提供動(dòng)物預(yù)防和/或治療益處的免疫反應(yīng)。經(jīng)刺激免疫反應(yīng)可以是體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。經(jīng)刺激免疫反應(yīng)能針對(duì)病毒編碼的任何抗原和/或免疫原。因此，完整病毒顆粒，每個(gè)病毒蛋白，和病毒蛋白片段是能用于在哺乳動(dòng)物中刺激免疫反應(yīng)的本發(fā)明實(shí)施方式。在多種實(shí)施方式中，刺激免疫反應(yīng)的動(dòng)物是家犬(Canis familiaris)或家貓(Felis catus),即分別是馴養(yǎng)的犬或貓。在特定實(shí)施方式中，用于刺激犬免疫反應(yīng)的多核苷酸包含SEQ IDN0:1序列或與·SEQ ID NO: I序列至少96%相同的序列，或其編碼蛋白或蛋白片段，或SEQ ID N0:1反向互補(bǔ)序列編碼的病毒顆粒。包含SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3的序列的多核苷酸，或具有與SEQ ID N0:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸，或由SEQ ID N0:2或3反向互補(bǔ)序列編碼的蛋白或蛋白片段或病毒蛋白，或具有與SEQ ID N0:2或3反向互補(bǔ)序列至少96%相同序列的多核苷酸，優(yōu)選用于刺激貓的免疫反應(yīng)。所述序列、蛋白、蛋白片段、和病毒顆粒與犬和貓的相同關(guān)系用于使用診斷目的的組合物，但是這并不以任何方式消除將本發(fā)明實(shí)施到其他哺乳動(dòng)物上的適用性，包括人。刺激免疫反應(yīng)的方法包括將含有本文所述病毒、本文所公開(kāi)病毒多核苷酸編碼的病毒蛋白、所述蛋白片段或其組合的組合物給予哺乳動(dòng)物。病毒和/或蛋白和/或其片段能從任何合適來(lái)源分離，或能用熟知技術(shù)重組生成。在多種實(shí)施方式中，發(fā)明提供的用于疫苗的病毒蛋白包括但不必要限于吧-1、吧-2、隊(duì)？、厘、5!1、6^2-1、厘2-2、1^蛋白和其組合。編碼這些蛋白的所有核苷序列包括在發(fā)明中，并且能由本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)技術(shù)測(cè)定。給予發(fā)明合成物的哺乳動(dòng)物能是任何有風(fēng)險(xiǎn)、懷疑有、或已經(jīng)診斷出病癥的哺乳動(dòng)物，所述病癥與一個(gè)或多個(gè)肺炎病毒的出現(xiàn)正相關(guān)，包括但不必需限于本文公開(kāi)的病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，動(dòng)物是有風(fēng)險(xiǎn)、懷疑患有、或者已診斷有ARDC的犬。在另一個(gè)實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是有風(fēng)險(xiǎn)、懷疑患有或診斷有呼吸疾病或任何其他與本文所述病毒正相關(guān)的疾病的人。這方面，本領(lǐng)域已知涉及本文所述新發(fā)現(xiàn)病毒的病毒，例如鼠肺炎病毒，能造成人的廣泛感染(例如，參見(jiàn)Pringle CR, Eglin RP. , Murine pneumoniavirus: seroepidemiological evidence of widespread human infection (〈〈鼠月市炎病毒廣泛人際感染的血清流行病學(xué)證據(jù)》).J Gen Virol. 1986年6月；67(Pt 6) :975-82)。因此，有理由認(rèn)為當(dāng)前提供的組合物和方法有刺激人免疫反應(yīng)的實(shí)用性和診斷人中病毒感染的應(yīng)用。將發(fā)明組合物即疫苗給予動(dòng)物能產(chǎn)生預(yù)防效果，意味著接受疫苗的動(dòng)物中感染的可能性低于沒(méi)有疫苗的動(dòng)物更低，或動(dòng)物中與病毒出現(xiàn)正相關(guān)的疾病征兆比沒(méi)有接受疫苗動(dòng)物更輕。給予本發(fā)明疫苗也能有治療效果，意味著感染程度(如病毒負(fù)荷或效價(jià)和/或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的感染程度標(biāo)記)在感染并接受疫苗后的動(dòng)物中相對(duì)于感染但沒(méi)有接受疫苗的動(dòng)物更低。類似地，感染并接受疫苗的動(dòng)物中與動(dòng)物病毒出現(xiàn)正相關(guān)的疾病征兆比沒(méi)有接受疫苗的動(dòng)物更輕。本文所述病毒和/或蛋白和多核苷酸能分離，意味著其從自然環(huán)境中去除，例如從動(dòng)物和/或獲自動(dòng)物的生物樣品中分離病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括本文所述病毒的分離細(xì)胞視作包括分離病毒。此外，本發(fā)明的分離病毒和/或蛋白和/或其片段和/或分離和/或重組多核苷酸能純化成任何所需純化程度。發(fā)明提供的組合物可以包含病毒、病毒蛋白、其片段和/或多核苷酸、多核苷酸片段和/或其組合，由其組成或主要由其組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括將包括含SEQ ID NO: I序列的多核苷酸或具有與SEQID NO: I序列至少96%相同序列的多核苷酸的組合物給予犬，從而在犬中刺激針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸作為DNA疫苗給予。制作、配制含DNA疫苗的藥物組合物和給予含DNA疫苗的組合物的方法為本領(lǐng)域已知。在一個(gè)實(shí)施方式中，給予犬的多核苷酸在病毒顆粒中出現(xiàn)。病毒顆粒能分離和/或重組。在多個(gè)實(shí)施方式中，給予犬的病毒包括含某一氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列是病毒顆粒所包括的部分蛋白。由病毒基因組編碼的病毒顆粒所含病毒蛋白的預(yù)測(cè)氨基酸序列包括犬病毒蛋白NS I，非結(jié)構(gòu)蛋白 I (SEQ ID N0:7)，NS2，非結(jié)構(gòu)蛋白 2 (SEQ ID N0:8)，N，核蛋白(SEQ ID N0:9)，P，磷蛋白(SEQ ID NO: 10)，M，基質(zhì)蛋白(SEQ ID NO: 11)，SH，小疏水蛋白(SEQ ID NO: 12)，G，附著蛋白(SEQ ID N0:13)，F(xiàn)，融合蛋白(SEQ ID NO: 14)，M2，基質(zhì)蛋白 M2-1 (SEQ ID 勵(lì)15)和] 2-2(SEQ ID NO: 16)，L，RNA依賴性RNA聚合酶，其中部分序列已提供(SEQ ID NO: 17)。發(fā)明也提供這些蛋白的貓病毒形式。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括給予貓組合物，所述組合物包括含SEQ IDN0:2和/或SEQ ID NO:3序列的多核苷酸、或具有與SEQ IDN0:2或3序列至少96%相同序列的多核苷酸，從而在貓中刺激針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，給予貓的多核苷酸在病毒顆粒中出現(xiàn)。所述顆粒能分離和/或重組。在多個(gè)實(shí)施方式中，給予貓的病毒包括含選自SEQ ID N0:5或SEQ IDN0:6的氨基酸序列的蛋白。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括能針對(duì)本文所公開(kāi)病毒感染提供預(yù)防和/或治療效果的疫苗。所述疫苗能包括活或死(失活)病毒或其片段。死病毒是不能復(fù)制的病毒。死疫苗能用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)制備，包括但不限于熱滅活和病毒蛋白和/或核酸的修飾，方法包括但不必需限于接觸多聚甲醛，福爾馬林和紫外光。例如，病毒蛋白能共價(jià)修飾，如通過(guò)能修飾病毒蛋白的交聯(lián)劑以防止病毒細(xì)胞進(jìn)入和/或復(fù)制所需的一個(gè)或多個(gè)步驟。認(rèn)為活病毒包括減毒病毒。減毒病毒是相對(duì)于未減毒形式毒力降低的病毒。因此，減毒病毒能復(fù)制，但僅相對(duì)于同一類型的未減毒病毒變慢，并且因此一般不致病。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)識(shí)別未減毒，減毒和死病毒之間的這些和其他區(qū)別，從而能互相區(qū)分。減毒病毒能用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)得到。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒通過(guò)連續(xù)傳代哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)減毒。連續(xù)傳代能通過(guò)許多機(jī)理引起減毒。支持病毒復(fù)制的任何細(xì)胞包括但不限于人細(xì)胞，能用于以病毒增殖和/或減毒為目的的傳代。在多個(gè)非限定實(shí)施例中，傳代的細(xì)胞培養(yǎng)物能獲自或衍生自犬或貓，例如分別來(lái)自家犬或家貓。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞是初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞包括犬衍生的A-72細(xì)胞系，其美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的產(chǎn)品號(hào)是CRL-1542。適合病毒減毒的任何傳代數(shù)目都能使用。根據(jù)本公開(kāi)的優(yōu)勢(shì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定病毒減毒的傳代參數(shù)。一般說(shuō)，可以使用5-150，包括其間所有整數(shù)，并優(yōu)選20-50傳代。包括病毒的組合物能作為疫苗用途的藥物制品提供。包括病毒的組合物能制備成懸浮液或凍干形式，并能另外包括所述組合物通常使用的藥學(xué)上可接受載體和/或稀釋齊U。適用于發(fā)明的載體和稀釋劑的一些示例參見(jiàn)Remington:The Science and Practiceof Pharmacy (《雷明登藥物的科學(xué)和實(shí)踐》)(2005)第21版，賓西法尼亞州費(fèi)拉德?tīng)柗苼?，Lippincott Williams和Wilkins。載體的特定非限制性示例包括穩(wěn)定劑，防腐劑和緩沖液。穩(wěn)定劑的特定非限制性示例包括糖(如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖苷、谷氨酸或葡萄糖)，蛋白(如奶粉血清、清蛋白或酪蛋白)或其降解產(chǎn)物。合適緩沖液的特定非限制性示例包括堿金屬磷酸鹽。合適防腐劑的特定非限制性示例是硫柳汞、硫柳汞和慶大霉素。合適稀釋劑的特定非限制性示例包括水，水性緩沖液(如緩沖鹽水)，乙醇和多元醇(如甘油)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本文提供疫苗制品能包括有佐劑活性的一種或多種化 合物。合適佐劑包括但不必需限于弗氏不完全佐劑，蘇氨酰胞壁酰二肽，氫氧化鋁，-磷酸鹽或-氧化物，水包油或油包水乳液，基于例如礦物油或植物油如維生素E醋酸酯和皂苷。本發(fā)明提供的疫苗能通過(guò)任何合適途徑給予。在多種實(shí)施方式中，疫苗能通過(guò)胃腸外、肌肉內(nèi)或皮下、靜脈內(nèi)或口服給予，包括但不必需限于經(jīng)鼻給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到疫苗的有效劑量能用正?？紤]因素確定，例如需要刺激免疫反應(yīng)的動(dòng)物類型，大小，年齡，環(huán)境，感染風(fēng)險(xiǎn)或階段。一般說(shuō)，根據(jù)發(fā)明的活疫苗能以每只動(dòng)物IO1-IO6噬斑形成單位(pfu)的劑量給藥,例如Iml劑量。滅活疫苗可以包括每個(gè)動(dòng)物IO6-IOuiPfu的抗原等價(jià)物。發(fā)明的多核苷酸可以修飾成攜帶一個(gè)或多個(gè)異源基因，例如不僅針對(duì)本文所公開(kāi)病毒，也對(duì)其他相關(guān)或不相關(guān)病毒和/或其他感染原提供免疫。同樣，本文提供的免疫制劑也能包括旨在針對(duì)與本文公開(kāi)病毒不同的感染原刺激免疫反應(yīng)的免疫原性試劑。因此，發(fā)明包括用于不同哺乳動(dòng)物和針對(duì)不同感染原的疫苗組合。疫苗組合能包括含所有或部分本文公開(kāi)病毒蛋白的融合蛋白，和能含有來(lái)自其他蛋白多肽序列的融合蛋白以提供對(duì)不同感染原有效的多價(jià)疫苗。發(fā)明還包括給予其他能提供動(dòng)物有益效果的組合物，其能在所述感染的傳統(tǒng)治療之前、同時(shí)或之后給藥。發(fā)明也提供檢測(cè)本文公開(kāi)病毒的方法。所述方法包括從動(dòng)物獲得生物樣品和檢測(cè)樣品中和樣品來(lái)源的病毒蛋白和/或病毒多核苷酸的存在。任何病毒多核苷酸和蛋白能用于檢測(cè)有或沒(méi)有病毒的方法。認(rèn)為檢測(cè)SEQ IDN0:1、2或3的反向互補(bǔ)物或DNA等價(jià)物與檢測(cè)多核苷酸相同，所述多核苷酸包括SEQ ID NO: 1、2或3序列或與任何這些序列至少96%相同的序列。檢測(cè)能用獲自需要診斷的哺乳動(dòng)物的任何合適生物樣品進(jìn)行。生物樣品的合適來(lái)源包括但不限于血液、粘膜刮片、組織活檢或唾液。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物樣品包括鼻和/或咽部拭子或氣管灌洗液。可以使用本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)測(cè)試DNA、RNA或蛋白來(lái)檢測(cè)有或沒(méi)有病毒。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)檢測(cè)包括全部或部分病毒基因組的多核苷酸，或從全部或部分病毒基因組擴(kuò)增的多核苷酸來(lái)測(cè)定病毒的存在。這方面，通過(guò)鑒定來(lái)自病毒負(fù)鏈、病毒正鏈或其組合的多核苷酸序列，發(fā)明包括測(cè)定病毒存在(或缺失)。發(fā)明還包括檢測(cè)病毒負(fù)鏈，病毒正鏈或其組合的DNA形式。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)能用于生成病毒負(fù)鏈或其部分的DNA拷貝，并且DNA拷貝能用作病毒基因組擴(kuò)增的模板以獲得在雜交雙鏈體中包括正鏈和負(fù)鏈或其部分的DNA形式的多個(gè)雙鏈DNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解有多種擴(kuò)增技術(shù)能增加遺傳物質(zhì)的數(shù)量以用于確定病毒是否或曾經(jīng)在感興趣生物樣品中，并且擴(kuò)增(沒(méi)有擴(kuò)增)的遺傳物質(zhì)能用很多檢測(cè)多核苷酸序列的熟知技術(shù)和試劑分析。因此，發(fā)明包括任何和所有從生物樣品中獲得和分析核酸的方法，從而能確定有或沒(méi)有病毒多核苷酸，包括但不限于那些涉及通過(guò)核酸和/或其他類型探針的雜交，和通過(guò)使用任何已知測(cè)序技術(shù)測(cè)定病毒多核苷酸序列來(lái)檢測(cè)多核苷酸的方法?？蓽y(cè)定所有或部分序列并用于鑒定病毒多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，發(fā)明提供包括用于核酸雜交和/或擴(kuò)增的分離病毒多核苷酸和成分的組合物。因此，所述組成物可額外包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、游離核苷三磷酸、鹽、緩沖液和其他通常用于雜交和/或擴(kuò)增核酸的試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明提供分離病毒多核苷酸和/或從病毒多核苷酸擴(kuò)增的多核苷酸，其中所述病毒多核苷酸和/或從病毒多核苷酸擴(kuò)增的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)用于實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針 雜父。發(fā)明還提供分離病毒多核苷酸和/或從病毒多核苷酸擴(kuò)增的多核苷酸，其中所述多核苷酸與陣列中存在的至少一個(gè)探針雜交。例如，陣列可以存在于用以檢測(cè)多種不同多核苷酸存在與缺失的芯片上。所述芯片市售可得并且能定制檢測(cè)基本上任何多核苷酸的存在與缺失。在多種實(shí)施方式中，發(fā)明還包括有形介質(zhì)中固定檢測(cè)哺乳動(dòng)物是否已經(jīng)被本文公開(kāi)的病毒感染。有形介質(zhì)能是任何類型的有形介質(zhì)，例如任何類型數(shù)字媒介，包括但不限于能存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)、DVD、CD-R0M或電子郵件的數(shù)字化文件。有形介質(zhì)能提供給醫(yī)療服務(wù)人員以發(fā)展用于已感染哺乳動(dòng)物的治療方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)，能生成多種試劑并用于檢測(cè)本文公開(kāi)病毒的診斷方法。例如，多克隆或單克隆抗體能用病毒顆?；虿《绢w粒部分、或分離或重組病毒蛋白或其片段生成。因此，抗體可制備成特異性識(shí)別任何病毒蛋白中存在的任何抗原決定簇。在多種實(shí)施方式中，抗體識(shí)別NS-I、NS-2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L病毒蛋白或部分或其組合。期望生成的抗體能區(qū)分本發(fā)明病毒和其他相關(guān)病毒，例如MPV?？贵w能用于任何技術(shù)，因此能測(cè)定生物樣品中或來(lái)自生物樣品的病毒抗原的存在與缺失。所述技術(shù)包括但不限于Western印跡、免疫熒光、免疫組織化學(xué)和基于珠的ELISA分析或傳統(tǒng)蛋白陣列。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明提供在抗體復(fù)合物中出現(xiàn)的分離和/或重組病毒或病毒蛋白。以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明特定實(shí)施方式，但不應(yīng)以任何方式對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例I從混種犬的鼻和咽部拭子獲得樣品并且用于接種犬A72細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CRL-1542)培養(yǎng)物以分離呼吸道病毒。在對(duì)應(yīng)于接種后約21天的傳代培養(yǎng)后期，一些培養(yǎng)物顯示細(xì)微細(xì)胞病性改變。持續(xù)傳代后，培養(yǎng)物顯示細(xì)胞變圓的小灶點(diǎn)，隨后整個(gè)培養(yǎng)物中細(xì)胞快速死亡。所述模式主觀評(píng)定為非特性的ARDC常見(jiàn)相關(guān)病毒。獲得十三例個(gè)體病毒分離物并且在本實(shí)施例中描述。用普通犬呼吸道病毒特異性診斷試劑組的檢測(cè)未能鑒定出已知病毒。用針對(duì)其他病毒的附加試劑進(jìn)一步測(cè)試使用人呼吸道合胞病毒的單克隆抗體(Mab)庫(kù)(抗HRSV，編號(hào)VP-R151，美國(guó)加利福尼亞州伯林格姆的載體實(shí)驗(yàn)室(VectorLaboratories))通過(guò)免疫熒光分析(IFA)最終揭示正識(shí)別。所述抗體制品通常用于我們實(shí)驗(yàn)室中以檢測(cè)牛RSV (BRSV)。染色模式包括絲狀膜結(jié)合和自由漂浮病毒顆粒和胞質(zhì)包含體，這是通常在RSV感染細(xì)胞中觀察到的模式。根據(jù)初始IFA結(jié)果，我們?cè)噲D使用基于人、牛和綿羊RSV序列比對(duì)設(shè)計(jì)的PCR引物從病毒中擴(kuò)增核衣殼基因(N)片段。這未成功。抗RSV庫(kù)中單獨(dú)Mab的存儲(chǔ)和其特異性從生產(chǎn)商獲得并用于IFA (圖I)。用Mab5H5N (M2蛋白特異)染色顯示病毒顆粒和包含體。Mab 2G122 (P蛋白特異)主要染色包含體并給出相對(duì)一致的膜相關(guān)信號(hào)。沒(méi)有獲得Mabs 1C3 (N蛋白特異)或5A6 (F蛋白特異)染色。所有四個(gè)單獨(dú)Mab通過(guò)IFA識(shí)別BRSV。4個(gè)Mab中只有2個(gè)識(shí)別犬病毒不能擴(kuò)增RSV基因組保守區(qū)域這與RSV有關(guān)，但不是典型形式。通過(guò)使用C0DEH0P算法基于高度保守氨基酸(aa)序列簡(jiǎn)并PCR引物。定位L (聚合酶)和N基因中的特異性區(qū)域。反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序和BLAST分析揭示該病毒與傳統(tǒng)稱為小鼠肺炎病毒(或肺炎病毒)的鼠肺炎病毒(MPV)密切相關(guān)。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)L基因PCR產(chǎn)物與MPV有95%-97%相同并且N基因片段有約96%相同。為解決是否新鑒定肺炎病毒限于所測(cè)試收容所犬的問(wèn)題，我們隨機(jī)篩選犬血清樣品并發(fā)現(xiàn)27例動(dòng)物中的6例有特異性識(shí)別感染培養(yǎng)物中病毒的抗體。染色模式與Mab觀察到的類似(圖2)。包含可變量的BRSV中和抗體的牛血清沒(méi)有染色受犬病毒感染的細(xì)胞。本實(shí)施例顯示從13例有ARDC的狗分離的病毒似乎與MPV密切相關(guān)，并且因此我們認(rèn)為其為犬肺炎病毒(CnPnV)。鼠肺炎病毒是分類在副粘病毒科肺炎病毒亞科肺炎病毒屬的僅有三個(gè)病毒種之一。人RSV是模式種并與BRSV密切相關(guān)，而MPV相關(guān)性更遠(yuǎn)。例如，人和牛RSV的N蛋白核苷序列互相有約94%相同，但對(duì)MPV只有60%相同。只有兩個(gè)完全測(cè)序的MPV菌株“株15”和J3666，并且在核苷水平有99. 7%相同。CnPnV與ARDC的關(guān)聯(lián)在一些病例中有致病性，特別當(dāng)涉及復(fù)雜病因時(shí)。通過(guò)類比，MPV通常已知感染實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物群落并且血清學(xué)證據(jù)指出感染幾個(gè)野生嚙齒動(dòng)物種但對(duì)自然生態(tài)知之甚少。事實(shí)上，不清楚嚙齒動(dòng)物是否是唯一 MPV宿主或如果密切相關(guān)，病毒可以在其他物種循環(huán)。已經(jīng)報(bào)道了與呼吸道癥狀相關(guān)的人感染證據(jù)(Pringle CR等，J GenVirol. 1986 ;67:975_82)。本質(zhì)上，嚙齒動(dòng)物感染可以是亞臨床或潛伏。實(shí)驗(yàn)室小鼠臨床征兆可從無(wú)癥狀變化到發(fā)展為有高發(fā)病率和死亡率的肺水腫。包括J3666和株15在內(nèi)的致病株，能產(chǎn)生嚴(yán)重肺炎并在低劑量接種后6-10天死亡。致病性或其缺失可依賴于病毒和小鼠品系。多個(gè)細(xì)菌和病毒劑能涉及犬呼吸道疾病。因此認(rèn)為CnPnV是另一個(gè)能引起上呼吸道防護(hù)機(jī)理受損的事件順序，造成更嚴(yán)重疾病的的試劑。實(shí)施例2本實(shí)施例所述的材料和方法用于獲得其他實(shí)施例所述結(jié)果。病毒分離
使用濕拭子從有呼吸道疾病征兆的混種狗收集鼻和咽樣品，并且在康奈爾大學(xué)動(dòng)物健康診斷中心收到24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理。接種前，拭子浸入3ml有厄爾(Earle)鹽的極限必需培養(yǎng)基(吉布可(Gibco) 10370,美國(guó)加州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen) ),0. 5%牛血清白蛋白，青霉素(200U/ml),鏈霉素(200μ g/ml)和兩性霉素B(Fungizone)(2. 5 μ g/ml)中30分鐘并且然后機(jī)械攪拌10秒。合并各O. 5ml的等分鼻和咽部拭子提取物的，并用于接種沒(méi)有其他培養(yǎng)基的半融合A72細(xì)胞的單獨(dú)T25燒瓶(Binn等，1980) (CRL-1542，美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。使提取物保持單層1-3小時(shí)然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗。細(xì)胞于37oC維持在6ml培養(yǎng)基(Leibovitz L15培養(yǎng)基，10%熱滅活胎牛血清(FBS )，200U/ml青霉素，200 μ g/ml鏈霉素，50 μ g/ml慶大霉素)中，并且每
6-8天進(jìn)行繼代培養(yǎng)。未接種對(duì)照A72培養(yǎng)物在分離過(guò)程中平行進(jìn)行。免疫熒光分析
細(xì)胞附于載玻片，然后用PBS沖洗并在冷丙酮中固定10分鐘。載玻片在空氣中干燥并在染色前于-20° C保存。在PBS中稀釋的初級(jí)和二級(jí)抗體用于載玻片并且37° C孵育30分鐘。每個(gè)孵育中，載玻片用PBS沖洗15分鐘。染色用熒光顯微鏡觀察。針對(duì)HRSV的Mab庫(kù)在1:400稀釋下用于初始鑒定(VP-R151，美國(guó)加利福尼亞州伯林格姆的載體實(shí)驗(yàn)室)。以IX濃度提供的小鼠抗PVM (CL-603IFA，馬薩諸塞州威爾明頓的查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories))在1:20稀釋下使用。二抗FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(02-18-06，KPL，美國(guó)馬里蘭州蓋瑟斯堡)在1:40 (12. 5 μ g/ml)稀釋下使用。RNA 純化總細(xì)胞RNA從A72細(xì)胞(74106，美國(guó)加州瓦倫西亞的凱杰公司(Qiagen))中純化。從一個(gè)顯示約50-75%細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的感染25cm2燒瓶收集細(xì)胞并經(jīng)各柱純化。包括拭子洗脫液的無(wú)細(xì)胞上清液和培養(yǎng)基用140 μ I樣品純化(52906，凱杰公司)。純化的RNA重懸于40 μ I無(wú)RNase的水中。PCR起始用于獲得基因組片段的簡(jiǎn)并引物序列是基于肺炎病毒亞科病毒的比對(duì)，并用 C0DEH0P 算法設(shè)計(jì)(blocks, fhcrc. org/codehop. html) (Rose 等，1998)。逆轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明以25 μ I體積用一步反應(yīng)(210212，凱杰公司)完成。每一個(gè)反應(yīng)使用1:5-1:10稀釋的Iyl總RNA和10皮摩爾的各引物。RT步驟的反應(yīng)條件是在50° C 30分鐘，然后95° C 15分鐘。循環(huán)條件是95° C 60秒，54-56° C 30秒，和72。C 60-90 秒，共 35 個(gè)循環(huán)。N 基因的引物組N276F, tccgtgcaggccgaratggarcarg/PlR, (SEQ ID NO:35) ggaactcgggggcgaayttytccat ；SEQ ID NO:36) ;L 基因號(hào) I :L428F，ccggatcttcggccayccnatggt/SEQ ID NO:37) L538R, ttcttaggaggggagatggcyttrtcrtt ；SEQ ID NO:38)L 基因號(hào) 2 :L698F, catcaccgacctgtccaagttyaaycargc/SEQ ID NO:39)L894R, ttgaagtcgtccaggatggtrttdatcca SEQ ID NO:40。兩個(gè)用于來(lái)自多個(gè)地理位置的拭子樣品的PCR引物組基于CnPnV，MPV J3666和菌株15序列比對(duì)而設(shè)計(jì)。G蛋白G715F, ggcttctgtttcttcctttctgg/SEQ ID NO: 41 )G1062R, ccgtggtggtgcctgtgSEQ ID NO:42) ；SH1 蛋白SH1F, atggatcctaacatgacctcayacSEQ ID NO:43) /SH187R,gattgggatgaacygtgcattg SEQ ID N0:44)。用于擴(kuò)增低傳代 Brne 分離物的引物G84F,tgtaaaagtgaaccaaatgtgta SEQ ID NO:45) /G404R, aaatcttcaggtaaatcaggtc SEQ IDNO:46) ；G849F, ttttaacaacaagaatcagtc SEQ ID NO:47) /G1048R, ctcctaggtgcgggggttggSEQ IDN0:48)。用于G和SH擴(kuò)增子的反應(yīng)條件是RT在50° C 30分鐘，滅活/變性在95° C15分鐘，和PCR在95° C 60秒，54° C 30秒和72° C 90秒，共35個(gè)循環(huán)?；蚪M分析PCR產(chǎn)物用康奈爾大學(xué)測(cè)序和基因型核心實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)3730DNA分析儀測(cè)序。用于檢測(cè)完全序列的引物是基于MPV序列或前面測(cè)定的CnPnV序列。生成重疊PCR產(chǎn)物以覆蓋間隙和引物結(jié)合區(qū)域。所有區(qū)域在2條鏈上測(cè)序。CnPnV分離物與MPV株15 (GenBank AY729016)和 J3666 (GenBank NC006579)的序列使用 Lasergene (DNASTAR,美國(guó)威斯康星州麥迪遜)作比較。實(shí)施例3 分離和鑒定采用鼻和咽部拭子洗脫液接種A72細(xì)胞。相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，通常在第三或第四傳代后觀察到有限CPE。起始CPE通常包括細(xì)胞變圓的散布小灶點(diǎn)，有時(shí)有小合胞體和形成空泡。靜置培養(yǎng)的所述CPE在幾天內(nèi)進(jìn)展緩慢。繼代培養(yǎng)常導(dǎo)致維持此低級(jí)CPE的單層，但是一些培養(yǎng)物在24-48小時(shí)內(nèi)有快速進(jìn)展和單層的分解。盡管與一些皰疹病毒感染相似，所述模式不測(cè)試犬皰疹病毒陽(yáng)性，并不顯示通常使用相似過(guò)程分離的任何犬呼吸道病毒典型特征。一些早期傳代分離物在培養(yǎng)中復(fù)制較差，顯示新鮮細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移后CPE很少或沒(méi)有。然而，一些持續(xù)傳代的培養(yǎng)物發(fā)展出更一致的轉(zhuǎn)移CPE，并且選擇它們用于進(jìn)一步分析。起始測(cè)試顯示來(lái)自幾只不相關(guān)狗的血清似乎在CPE培養(yǎng)中識(shí)別病毒抗原(數(shù)據(jù)未顯示)，但是普通犬呼吸道病毒測(cè)試為陰性。如實(shí)施例I所報(bào)道，對(duì)HRSV特異的Mab有效識(shí)別病毒抗原。有抗PVM多克隆血清的正IFA染色用于確證?？筆VM小鼠血清通過(guò)IFA中僅微弱結(jié)合BRSV。實(shí)施例I所述CnPnV的最初13種分離物源自由相同組織管理的2個(gè)動(dòng)物收容所。為檢測(cè)是否病毒限于所述兩個(gè)地點(diǎn)，來(lái)自其他地理位置的病狗的鼻或咽部拭子樣品用PCR測(cè)試。美國(guó)8個(gè)州(C0、GA、FL、IN、M0、NV、SC、VA)的19只狗用G和SH基因的引物組測(cè)試。19例樣品中，一例來(lái)自內(nèi)華達(dá)州，和5例來(lái)自南卡羅來(lái)納州的9只狗的組，對(duì)G和SH PCR都是陽(yáng)性并且通過(guò)測(cè)序證實(shí)。沒(méi)有從其他13例狗中獲得PCR陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)其他6例進(jìn)行犬呼吸道診斷的來(lái)自紐約州和賓夕法尼亞州的鼻拭子樣品嘗試A72細(xì)胞的病毒分離。其中，兩例額外分離物來(lái)自紐約市獸醫(yī)院且另一個(gè)來(lái)自從賓西法尼亞州費(fèi)城收容所。用抗RSV和抗PVM抗體通過(guò)IFA和隨后RT-PCR證實(shí)所述分離物為CnPnV。盡管所述RT-PCR和病毒分離結(jié)果不提供流行性的精確評(píng)價(jià)，它們確實(shí)表明CnPnV感染廣泛。序列分析前面研究已經(jīng)注意到病毒分離物間的差異可歸因于存在自然準(zhǔn)種，傳代培養(yǎng)中的突變或PCR人造產(chǎn)物。為測(cè)定CnPnV分離物的最精確共有序列，使用將總細(xì)胞RNA用作模板的多個(gè)重疊RT-PCR反應(yīng)。測(cè)序兩只狗的病毒分離物，一個(gè)在組織傳代4 (Ane4)且一個(gè)在組織傳代 17 (Brnel7),并且與序列 J3666 (Thorpe 和 Easton, 2005)和株 15 (Krempl 等，2005)作比較。8598nt序列(SEQ ID NO: I)從CnPnV_Ane4獲得，從毗鄰NSl的3’前導(dǎo)區(qū)開(kāi)始并延伸到L編碼區(qū)域的短距離，完全覆蓋10個(gè)基因組預(yù)測(cè)基因中的九個(gè)。證實(shí)基因順序NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L。此CnPnV_Ane4區(qū)域相較MPV株的全部nt序列相同性是J366695. 0%和株1594. 7%。MPV株互相是99. 7%相同性。在CnPnV_Ane4和MPV株比較中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)內(nèi)的間隙。除了部分3. 4和3. 5所述的G和SH的長(zhǎng)度不同外，發(fā)現(xiàn)所有MPV和CnPnV-Ane4編碼區(qū)域編碼同一長(zhǎng)度的蛋白。非翻譯區(qū)的比較分析CnPnV中GS和GE序列邊界通過(guò)J3666和株15序列比對(duì)來(lái)確定(Thorpe, L. C.,Easton, A. J.，2005. J. Gen. Virol. 86,159-169 ；KrempI 等，2005. Virus Genes30, 237-249)。MPV的GS序列由Chambers等(1991)描述，并且最近(Dibben和Easton, 2007)描述為9nt長(zhǎng)度，基于由Collins等(1986)測(cè)定的RSV GS序列。Kuo等(1997)提供第IOnt還在RSV的GS中重要并且其IOnt的長(zhǎng)度與MPV GS相等的證據(jù)(Krempl等，2005)。表I中，GS表示為IOnt以包括兩種解釋。表I提供CnPnV-Ane4相較MPV株15和J3666的編碼區(qū)域間的GS ,GE和IGR序列。表I
......^Cl..............................................................IGRGS...............................................................涵...5，............................^NTR.....函
aggacaagug NS I
N SI uagimaamiaaaa caaagggu aggacaaauc* N S2沒(méi){\ I x:別
NS2 IiaguiiIiiigaaia mm*aggaiiaaana N沒(méi) )%觀
Nuauuiiaairaaaaa cuggaiiaiigi* aggauaatia PK I m
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Giiaginiaatigaaaa iiaagcuaiigaua aggacaaaua
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M2 uaguiiauauaais uaaucaauu* aggaucaaua L%j 2 nt
a (部φ表I中，兩個(gè)MPV株的NTR長(zhǎng)度沒(méi)有區(qū)別。RNA序列是5’ -3’方向。* :指示從J3666和株15的至少I(mǎi)nt改變。nt差異采用粗體和下劃線。GE :基因末端；IGR :基因間區(qū)域；GS:基因起點(diǎn)；沒(méi)有區(qū)別；長(zhǎng)度沒(méi)有區(qū)別。3對(duì)M-SH總體NTR長(zhǎng)度沒(méi)有區(qū)別；一個(gè)u從IGR刪除和另一個(gè)u在NTR上游加入。b3核苷酸IGR和看似M2GS是基于Dibben和 Easton (Dibben，0.，Easton，A. J.，2007. Mutational Analysis of the Gene StartSequences of Pneumonia Virus of Mice (《小鼠肺炎病毒基因起始序列的突變分析》).Virus Res. 130，303-309)分析。表I所示有10個(gè)或更多核苷酸的序列具有以下SEQ ID:對(duì)于“GE，，列序列NS1 uaguuaauuaaaa (SEQ ID NO: 18) ；NS2 uaguuauagaaaaa (SEQ IDNO:19) ；N uauuuaauuaaaaa (SEQ ID NO:20) ；P (SEQ ID NO:18) ；M uaguuaaauaaaa (SEQID NO:21) ；SH uaguuaacaaaaaa (SEQ ID NO:22) ；G uaguuaaugaaaaa (SEQ ID NO:23) ；Fuaguuaauuaaaaaa (SEQ ID NO:33);和 M2uaguuauauaaaaa (SEQ ID N0:34)。對(duì)于“IGR，，列序列N cuggaaaauau (SEQ ID N0:24);和 G uaagcuaugauauaau (SEQ ID NO:25);對(duì)于“GS，，列序列；NS1 aggacaagug (SEQID NO: 26 ；NS2 aggacaaauc (SEQ ID NO: 27) ；N aggauaaaua(SEQ ID NO:28)；P (SEQ ID NO:28)；M aggacaaaua (SEQ ID NO:29);SH aggauaagua (SEQIDNO:30) ；G (SEQ ID NO::30) ；M2 aggauaagug (SEQ ID N0:31)；F (SEQID N0:29)和 Laggaucaaua SEQ ID NO:32)。在CnPnV-Ane4NTR中鑒定了一些長(zhǎng)度變化和nt差異，主要在IGR中發(fā)現(xiàn)。IGR內(nèi)的兩個(gè)MPV 株沒(méi)有不同。Chambers 等(Chambers,P. ,Matthews,D. A. ,Pringle,C. R. ,Easton,A. J.，1991. Virus Res. 18，263-270)從 cDNA 克隆中測(cè)定 M2 的 GS,也注意到 56nt IGR 中存在2個(gè)額外潛在GS序列(GSl和GS2)。稍后的突變分析測(cè)定由于位點(diǎn)6的G取代A，推定的GS序列沒(méi)有功能。隨后，他們測(cè)定GSl和GS2序列能在最重要的弟一序列(GSl)中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始。他們的結(jié)論是最初鑒定的GS序列可能由于cDNA克隆中的自發(fā)缺失而錯(cuò)鑒定。CnPnV中，立即跟隨F GE序列的M2GS I序列與SH和G基因起始序列相同，除了第10nt。認(rèn)為主要使用 GSl 并示于表 I。M2 的 GS2，AGGACAGGG，與(Dibben，O. , Easton, A. J. ,2007.Virus Res. 130，303-309)報(bào)道的共有序列僅差異2個(gè)位置，但可有有限活性，因?yàn)槠湓谖稽c(diǎn)7沒(méi)有保守性A。這不同于J3666和株15，其中A是保守的。CnPnV_Ane4中的第三潛在M2GS (GS3)與J3666和株15相同，并且因此假定由于位點(diǎn)6的G而功能較差。非結(jié)構(gòu)蛋白的分析非結(jié)構(gòu)小疏水蛋白看來(lái)耐受顯著變化，因?yàn)槠涫莾蓚€(gè)MPV株之間分歧最大的蛋白，其中它們共有的92aa中只有92. 4%aa相同。CnPnV_Ane4中，相較MPV株15，SH蛋白在所有檢測(cè)蛋白中分歧最大。CnPnV-Ane4SH與J3666差異4aa (95. 7%)，和與株15差異9aa(90. 2%)，并且因此與J3666比MPV株之間更相似(表2)。另一顯著差異是不同分離物的SHORF長(zhǎng)度。CnPnV-Ane4和株15 二者都有279nt (92aa)的SH 0RF,而發(fā)表的J3666SH序列是345nt(114aa)。然而，已經(jīng)報(bào)道了 J3666的單獨(dú)擴(kuò)增序列不同地編碼92、96或114aa并且表明這些所示抗體逃避突變。表2提供對(duì)肺炎病毒亞科病毒的CnPnV-Ane4基因和蛋白的相同性百分比的總結(jié)。表 權(quán)利要求
1.一種包括與SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的分離多核苷酸的組合物。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸是與SEQIDN0:1序列至少96%相同的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸是與SEQIDN0:2序列至少96%相同的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸是與SEQIDN0:3序列至少96%相同的多核苷酸。
5.一種包括與SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸的分離病毒。
6.如權(quán)利要求5所述的分離病毒，其特征在于，所述分離病毒已經(jīng)減毒。
7.如權(quán)利要求5所述的分離病毒，其特征在于，所述分離病毒包括與SEQID N0:1序列至少96%相同的多核苷酸。
8.如權(quán)利要求6所述的分離病毒，其特征在于，所述分離病毒包括與SEQID N0:2序列至少96%相同的多核苷酸。
9.如權(quán)利要求7所述的分離病毒，其特征在于，所述分離病毒包括與SEQID N0:3序列至少96%相同的多核苷酸。
10.一種含有病毒的分離細(xì)胞或體外細(xì)胞培養(yǎng)物，所述病毒包括與SEQ ID ΝΟ:1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸的。
11.一種在哺乳動(dòng)物中刺激免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物含有權(quán)利要求5所述分離病毒、或所述分離病毒所含蛋白的片段的組合物，其中免疫反應(yīng)在給藥后于動(dòng)物中被刺激。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，權(quán)利要求5所述的分離病毒包括與SEQIDNO: I序列至少96%相同的多核苷酸，并且其中將所述組合物給予犬。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，權(quán)利要求5所述的分離病毒包括與SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 3序列至少96%相同的多核苷酸，并且其中將所述組合物給予貓。
14.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物是否被肺炎病毒感染的方法，所述方法包括從哺乳動(dòng)物中獲得生物樣品和檢測(cè)與SEQ ID ΝΟ:1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸，或通過(guò)檢測(cè)由SEQID NO: 1，2或3反向互補(bǔ)物所編碼蛋白的存在來(lái)檢測(cè)與SEQ ID NO: 1，2或3序列至少96%相同的多核苷酸，其中，多核苷酸或蛋白的存在指示哺乳動(dòng)物被肺炎病毒感染。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是犬或貓。
全文摘要
本發(fā)明提供新鑒定的能感染哺乳動(dòng)物的肺炎病毒，所述哺乳動(dòng)物包括狗、貓和可能的人。提供分離的病毒多核苷酸和蛋白，和分離的病毒本身。發(fā)明包括檢測(cè)病毒的組合物和方法，和預(yù)防和/或治療與病毒出現(xiàn)正相關(guān)的疾病征兆的方法和組合物，和包括病毒的分離細(xì)胞。也提供完整病毒顆粒，病毒蛋白和其片段。
文檔編號(hào)C12N15/45GK102884193SQ201080064234
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者E·杜博維, R·W·瑞沙 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)