專利名稱：合成氣或其他氣態碳源和甲醇轉化為1,3-丁二醇的方法和有機體的制作方法
合成氣或其他氣態碳源和甲醇轉化為1,3- 丁二醇的方法
和有機體本申請要求2009年12月10日提交的美國臨時申請NO. 61/285,312的優先權，將其全部內容引用作為參考。
背景技術：
本發明一般涉及生物合成方法，更具體地涉及在日常化學制品的生產中能夠利用碳水化合物、甲醇、合成氣體和其他氣態碳源的有機體。I, 3-丁二醇(1，3-BD0)是一種由乙炔經水合產生的四碳二元醇。得到的乙醛再轉化為3-羥基丁醛，隨后還原成1，3-BD0。近幾年中，乙炔已被較廉價的乙烯取代用作乙醛的來源。1，3-BD0通常用作食物調味劑的有機溶劑。它也是聚氨酯和聚酯類樹脂的共聚單體， 且廣泛地用作降血糖劑。光學活性的1，3-BD0是有用的生物活性化合物和液晶合成的原材料。1，3- 丁二醇的另一用途是它的脫水產生1，3- 丁二烯(Ichikawa等人，J. MolecularCatalysis A-Chemical,231:181-189(2005) ；Ichikawa 等人，J. Molecular CatalysisA-Chemical ,256:106-112 (2006))，一種用于生產合成橡膠(例如輪胎)、乳膠和樹脂的化學制品。合成氣(syngas)是一種主要為H2和CO的混合物，其可以通過任何有機原料的氣化法獲得，例如煤、石油、天然氣、生物質、或廢棄有機物質。已經開發了很多氣化方法，最多的設計是基于部分氧化，限制氧以避免有機物質在高溫(500-1500°C)下的完全氧化，從而提供0. 5:1-3:1H2/C0混合物的合成氣。有時增加蒸汽以增加氫含量，典型地伴隨水煤氣轉換反應增加的CO2生產量。工業上最常通過催化合成氣組分，CO和H2生產甲醇。當今，煤是工業生產合成氣的主要材料，其在傳統上用于取暖和電力，以及作為甲醇和液態烴類的Fischer-Tropsch合成的原料。許多大的化學制品和能源公司大范圍的采用煤氣化法，但在工業上用該技術是昂貴的。此外，事實上在世界任何地方，存在來自過剩的其他材料如生物質、廢料、聚合物等的合成氣的成本有效的生產技術。使用合成氣的好處包括靈活性，因為合成氣可以從大多數有機物包括生物質中生產得到。另一個好處是合成氣的廉價。此外，我們有已知的在有機體如Clostridium spp.中有效地利用合成氣的途徑。盡管在利用合成氣有機體的利用率方面，一般的已知有機體不足以具有該特征且不適合商業化發展。例如，Clostridium及其相關細菌是嚴格厭氣菌，其對高濃度的某些產物如丁醇不耐受，從而限制了效價和商業化潛力。Clostridium還產生多種產物，要獲得想要的產物時存在分離問題。最后，容易操作梭狀芽胞桿菌基因的遺傳工具的開發正處于起步階段；因此，它們不能迅速地順應基因工程以改善所需產物的產率或生產特征。增加廉價和容易利用的原料的靈活性，同時使化學產物的環境影響最小化是可持續化工的兩個目標。原料的靈活性依賴于大范圍的材料進入并作為化學制品生產的初始原料利用。無論乙炔還是乙烯，對以石油為基礎的原料的依賴保證了基于可再生原料的1，3- 丁二醇和丁二烯的合成路線的開發。因此，現在需要開發微生物和它們利用碳水化合物、甲醇、合成氣或其他氣態碳源生產1，3-丁二醇的方法。本發明滿足該需求，還提供相關優點。
發明概要在某些方面，本文公開的實施方式涉及一種具有1，3_ 丁二醇(1，3_BD0)途徑的非天然存在的微生物有機體，所述途徑包括至少一個編碼足量表達以生產1，3-BD0的1，3-BD0途徑酶或蛋白的外源性核酸。該1，3-BD0途徑包括甲醇甲基轉移酶(MtaB)、類咕啉蛋白(MtaC)、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)、類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)、鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)、鐵氧化還原蛋白(0rf7)、乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)、一氧化碳脫氫酶(AcsA)、氫化酶(Hyd)、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，乙醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4_羥基，2- 丁酮還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(乙醛形成)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)、3_羥基丁酰輔酶A轉移酶、3-羥基丁酰輔酶A水解酶、3-羥基丁酰輔酶A合成酶、3-羥基丁酸脫氫酶、3-羥基丁酸還原酶、乙酰乙酰輔酶A轉移酶、乙酰乙酰輔酶A水解酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶或乙酰 乙酸還原酶。在某些方面，本文公開的實施方式涉及一種具有1，3_ 丁二醇(1，3_BD0)途徑的非天然存在的微生物有機體，所述途徑包括至少一個編碼足量表達以生產1，3-BD0的I, 3-BD0途徑酶或蛋白的外源性核酸。該1，3-BD0途徑包括甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸酯環水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)、鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)、鐵氧化還原蛋白(0rf7)、乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)、一氧化碳脫氫酶(AcsA)、氫化酶(Hyd)、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4_羥基，2- 丁酮還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)、3_羥基丁酰輔酶A轉移酶、3-羥基丁酰輔酶A水解酶、3-羥基丁酰輔酶A合成酶、3-羥基丁酸脫氫酶、3-羥基丁酸還原酶、乙酰乙酰輔酶A轉移酶、乙酰乙酰輔酶A水解酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶或乙酰乙酸還原酶。在某些方面,本文公開的實施方式涉及一種用于生產1，3-BD0的方法,其包括在條件和足夠的時間下培養上述非天然存在微生物有機體以生產1，3-BD0。附圖簡要說明附圖I顯示了一個描述Wood-Ljungdahl途徑以及乙酸和乙醇的形成途徑的圖表。能夠在合成氣中生長的有機體的特征性轉化是1)C0脫氫酶，2)氫化酶，3)能量轉化氫化酶(ECH)JP 4)雙功能CO脫氫酶/乙酰輔酶A合酶。附圖2顯示了完整的Wood-Ljungdahl途徑，其能夠使氣體包括CO、CO2和/或H2轉換至乙酰輔酶A，其隨后轉換至細胞群和產物例如乙醇或乙酸。縮寫=IOFTHF =10-甲酰四氫葉酸，5MTHF :5-甲基四氫葉酸，，ACTP :乙酰磷酸，CFeSp :類咕啉鐵硫蛋白，FOR :甲酸，MeOH :甲醇，METHF :甲基四氫葉酸，MLTHF :次甲基四氫葉酸，THF :四氫葉酸。
附圖3描述了從乙酰乙酰輔酶A至1，3_ 丁二醇的途徑。酶的步驟是A)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，B)3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，C) 3-羥基丁醛還原酶，D)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)，E) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，F)4-羥基，2- 丁酮還原酶，G)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，H) 3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)，I) 3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)，J) 3-羥基丁酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，K) 3-羥基丁酸脫氫酶，L) 3-羥基丁酸還原酶，M)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，N)乙酰乙酸還原酶。附圖4顯示了碳水化合物例如葡萄糖，包括C0、C02和/或仏的氣體以及甲醇到乙酰輔酶A并進一步到1，3-丁二醇的生物合成代謝途徑。加工到生產宿主中的特定酶轉化編號并顯示在該附圖中。縮寫10FTHF 10-甲酰四氫葉酸，5MTHF 5-甲基四氫葉酸，ACTP 乙酰磷酸，CFeSp :類咕啉鐵硫蛋白，FOR :甲酸，MeOH :甲醇，METHF :甲基四氫葉酸，MLTHF :次甲基四氫葉酸，THF :四氫葉酸。附圖5顯示了碳水化合物例如葡萄糖、包括CO，CO2和/或H2的氣體以及甲醇到乙酰輔酶A并進一步到1，3- 丁二醇的生物合成代謝途徑。加工到產物宿主中的具體酶的轉化被編號并顯示在該附圖中。縮寫=IOFTHF 10~甲酰四氫葉酸，5MTHF:5-甲基四氫葉酸，ACTP 乙酰磷酸，CFeSp 類咕啉鐵硫蛋白，FOR :甲酸，MeOH :甲醇，METHF :甲基四氫葉酸，MLTHF :次甲基四氫葉酸，THF :四氫葉酸。附圖6顯示了 IOmg下述物質的蛋白質印跡ACS90 (泳道1)，ACS91 (泳道2)，Mta98/99 (泳道3和4)標準大小的細胞提取物(泳道5)和熱醋穆爾氏菌C0DH(Moth_1202/1203)或 Mtr (Moth_1197)蛋白(50、150、250、350、450、500、750、900 和IOOOng)的對照。附圖7顯示了在甲基紫精分析中使用的比色皿。右邊是空白對照，左邊是含還原的甲基紫精的比色皿。注，每個比色皿頂部的塞子和真空油酯用來維持反應是缺氧的。附圖8顯示了 ACS90細胞提取物的光譜圖，為了分析CH3從加入的CH3-THF到純的熱醋穆爾氏菌類咕啉蛋白的轉移。附圖9從左到右顯示了在空載體、ACS90和ACS91三種情況下，重組大腸桿菌MG1655在37°C下在N2和CO中厭氧生長36小時。附
圖10顯示了通過采用Wood-Ljungdahl途徑酶結合1，3_ 丁二醇生物合成途徑，在葡萄糖中可生產I. 09mol/mol產率的1，3- 丁二醇的示例性流量分布。附圖11顯示了通過采用可共同利用甲醇作為底物的酶，在葡萄糖中可生產I. 2mol/mol產率的1，3- 丁二醇的示例性流量分布。發明詳述本發明涉及開發和使用有機體，所述有機體能夠利用碳水化合物、甲醇、合成氣和/或其他氣態碳源生產1，3-丁二醇。本發明進一步涉及擴展利用合成氣的微生物的產品范圍和產生能夠利用合成氣生產1，3- 丁二醇的重組有機體，并優化它們的產率、效價和生產能力。重組有機體的開發為可再生化學制品和染料制造提供成本優勢的方法，所述重組有機體例如大腸桿菌(Escherichia coli)或其他適合商業化規模的有機體,其可以有效地利用合成氣作為底物來生長和化學制品生產。有機體可以得到優化且快速測定并在合理的成本內。
合成氣作為原料的潛力在于它能夠有效率地且成本有效地轉化成化學制品和燃料的利益。合成氣轉化的兩個主要技術是Fischer-Tropsch方法和發酵方法。Fischer-Tropsch (F-T)技術自第二次世界大戰就已被開發，并且包含無機和金屬的催化齊U，從而能夠有效地生產甲醇或混合烴類作為燃料。F-T方法的缺點是1)缺少產物選擇性，其導致分離想要的產物的難度；2)催化劑敏感性中毒；3)由于高溫和壓力要求導致的高能量成本；和4)商業競爭成本上的可用的產品范圍有限。至于發酵方法，合成氣已表現出能給許多厭氧微生物充當碳和能源，其中厭氧微生物可以把這材料轉化成產物如乙醇、乙酸和氫。合成氣發酵轉化的主要優點是有機體生產單一產物的選擇性，對合成氣雜質更強的耐受性，溫度和壓力的較低操作要求，以及潛在的來自合成氣的大型組合的產物。發酵方法的主要缺點是已知有機體只能把合成氣轉化成有限范圍的化學制品，如乙醇和乙酸，而不能有效生產其他化學制品，有機體缺少既定的工具用于遺傳操作，且有機體對高濃度的最終產物敏感。本發明涉及微生物的產生，其能有效地從合成氣或其他氣態碳源中生產1，3- 丁二醇。與傳統的基于石油的產品和直接衍生自葡萄糖、蔗糖或木質纖維糖的相比，本發明的有機體和方法在1，3_ 丁二醇的生產成本上有顯著的優勢。在一個實施方式中，本發明 提供一種非天然存在的微生物，其能夠利用合成氣或其他氣態碳源生產1，3- 丁二醇，其親本微生物沒有利用合成氣的本能，如附圖4和5所示。在這些微生物中，一個或多個蛋白或酶在微生物中表達，從而賦予一個利用合成氣或其他氣態碳源生產想要產物的途徑。在另一實施方式中，本發明提供一種非天然存在的微生物，其在遺傳上已被改良，例如，通過表達一個或多個外源性基因或酶而賦予一種增加的生產1，3-丁二醇的能力，其親本微生物具有利用合成氣或其他氣態碳源生產想要產品的能力。因此，本發明涉及產生一種具有新的利用合成氣的代謝途徑能力的微生物，以及產生一種利用合成氣或其他氣態碳源生產I, 3- 丁二醇的效率提高的微生物。本發明還提供了非天然存在的微生物，其表達這樣的基因，所述基因編碼與MtaABC型甲基轉移酶系統相連的Wood-Ljungdahl途徑中的羰基分支相關的催化反應的酶。該有機體能夠將甲醇和包含C0、C02、和/或仏的氣體轉化到乙酰輔酶A、細胞量和產物中，其中甲醇是一種可以來自合成氣的相對廉價的有機原料。本發明進一步提供可以使碳水化合物原料中的1，3-丁二醇產率增加并超過天然預期的產率的途徑，大約Imol I, 3-丁二醇/mol葡萄糖，通過提供高效的機制將外源提供或內源產生的甲醇或二氧化碳中的碳裝配到乙酰輔酶A中。大腸桿菌是一種工業上大量使用的有機體，具有無與倫比的遺傳工具適用性。為了加工將C02、C0和/或H2轉化至乙酰輔酶A的能力，作為所有細胞量組分和多種有用產物來源的中心代謝物進入外源宿主例如大腸桿菌可以通過下述的外源性基因的表達來實現，其中的外源性基因編碼Wood-Ljungdahl途徑的多種蛋白。該途徑在產乙酸有機體例如熱醋穆爾氏菌(Moorella thermoacetica,以前稱為 Clostridium thermoaceticum)中是高度活躍的，其中熱醋穆爾氏菌自從1942年分離得到就成為解釋Wood-Ljungdahl途徑的模型有機體(Fontaine 等人,J Bacteriol. 43:701-715 (1942) )。Wood-Ljungdahl 途徑包括 2 個分支東向或甲基分支，和西向或羰基分支，前者能將CO2轉化成甲基四氫葉酸(Me-THF)，后者能將甲基-THF、C0和輔酶A轉化至乙酰輔酶A(參見附圖I和2)。正如本文所公開的，本發明提供一種非天然存在的微生物，其表達催化Wood-Ljungdahl途徑的兩個分支的基因，以及用于生產1，3-丁二醇的基因。該有機體能夠將包含C0、C02和/或仏的氣體轉化至乙酰輔酶A、l，3-丁二醇、細胞量和產物。該有機體還能夠以化學當量的最佳產率從碳水化合物生產1，3- 丁二醇。例如，與任一乙酰輔酶A至1，3- 丁二醇途徑結合,Wood-Ljungdahl酶能使每11摩爾的葡萄糖產生12摩爾1，3- 丁二醇，這與缺少Wood-Ljungdahl途徑酶下可得到Imol 1，3-丁二醇/Imol葡萄糖不同。本發明還提供了一種非天然存在的微生物，其表達這樣的基因，所述基因編碼催化與MtaABC型甲基轉移酶系統相連的Wood-Ljungdahl途徑的羰基分支的酶，以及生產1，3- 丁二醇的基因。該有機體能夠將甲醇和包含CO、CO2、和/或H2的氣體轉化至乙酰輔酶A、l，3-丁二醇、細胞量和產物，其中甲醇是來自合成氣的相對廉價的有機底物。除氣體底物以外，有機體可以單獨地利用甲醇或與碳水化合物如葡萄糖組合的甲醇來高產率的生產 1，3-丁二醇。合成氣也稱為syngas或水煤氣，是煤和含碳材料如生物質材料，包括農作物和殘 渣氣化的主要產物。合成氣是主要為H2和CO的混合物，可以從任何有機原料包括但不限于煤、石油、天然氣、生物質和廢棄有機物質的氣化而得到。氣化通常在高的燃料對氧氣比率下發生。除了大量的H2和CO，合成氣還可包括較少量的CO2和其他氣體。因此，合成氣提供了氣態碳如CO和CO2的成本有效來源。正如本文所公開的，氣態碳源如包含CO和/或CO2的合成氣可以被本發明的非天然存在的微生物利用以生產1，3-丁二醇。盡管本文通常以合成氣來舉例說明，但可以理解地，任何來源的包含CO和/或CO2的氣態碳都可以被本發明的非天然存在的微生物利用。因此，本發明涉及非天然存在的微生物，其能夠利用CO和/或CO2作為碳源。Wood-Ljungdahl途徑催化CO和H2轉化至乙酰輔酶A和其他產物如乙酸。能夠利用CO和合成氣的有機體通常也能夠通過Wood-Ljungdahl途徑包含的酶和轉化的基本設置來利用CO2和C02/H2的混合物。早在揭露CO也能夠被相同的有機體利用并涉及相同的途徑之前，微生物的CO2至乙酸的H2依賴轉化已得到公認。已經證明，許多產乙酸菌在存在CO2和產物化合物如乙酸的情況下生長，只要存在氫以供應必需的還原當量(例如參見Drake，Acetogenesis, pp. 3_60Chapman 和 Hall, New York, (1994))。這可以用以下的公式概括2C02+4H2+n ADP+n Pi — CH3COOH+2H20+n ATP因此，具有Wood-Ljungdahl途徑的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2的混合物用于生產乙酰輔酶A和其他想要產物，例如1，3- 丁二醇。Wood-Ljungdahl途徑是現有技術已知的，由可分成兩個分支的12個反應組成(I)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支將合成氣轉化為甲基四氫葉酸(甲基-THF)，而羰基分支將甲基-THF轉化為乙酰輔酶A。甲基分支的反應依次被以下酶或蛋白催化鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸酯環化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。羰基分支的反應依次被以下酶或蛋白催化甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白(例如AcsF)、鐵氧化還原蛋白、乙酰輔酶A合酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如CooO0根據本文提供的引入足量的編碼核酸來產生乙酰輔酶A途徑的教導和指導，本領域技術人員可以理解，為了引入至少編碼宿主有機體缺少的Wood-Ljungdahl酶或蛋白的基因，也可以進行相同的加工設計。因此，將一個或多個編碼核酸引入到本發明的微生物中，這樣，改良的有機體包含一個分支或完整的Wood-Ljungdah途徑,將賦予合成氣利用能力。因此，本發明的非天然存在的微生物可以使用合成氣或其他提供CO和/或CO2的氣態碳源來生產1，3-丁二醇。關于CO2，其他的來源包括，但不限于，氨和氫工廠里作為副產物的CO2的產生，其中甲烷轉化成CO2 ;木材和礦物燃料的燃燒；作為啤酒、威士忌和其他酒精飲料釀造中糖發酵或其他發酵過程的副產物，CO2的產生；在生產石灰CaO過程中石灰石CaCO3的高溫分解；作為磷酸鈉生產中的副產物的CO2的產生；以及直接來自天然二氧化碳泉，其由石灰石或白云石與酸化水的反應產生。產乙酸菌例如熱醋穆爾氏菌、C. Iiungdahlii和C. carboxidivorans可以在許多碳源中生長，其中碳源的范圍從己糖到一氧化碳。己糖如葡萄糖首先經Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)糖降解代謝為丙酮酸,其然后經丙酮酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(PFOR)轉化為乙酰輔酶A。乙酰輔酶A可用于修建生物質前體，或可轉換為乙酸，其經乙酸激酶和磷酸乙酸轉移酶產生能量。葡萄糖至乙酸的全部轉換、能量和還原當量是
C6H1206+4ADP+4Pi — 2CH3C00H+2C02+4ATP+8 [H]產乙酸菌甚至在葡萄糖至乙酸的轉化中得到更多的能量，同時還通過Wood-Ljungdahl途徑將釋放的CO2進一步轉化為乙酸來維持氧化還原反應平衡2C02+8[H]+n ADP+n Pi — CH3C00H+n ATP上述公式中的系數n表示該轉化是產生能量的，許多產乙酸菌可以通過Wood-Ljungdahl途徑在有CO2的情況下生長，甚至不存在葡萄糖，只要存在氫以供應必需的
還原當量。2C02+4H2+n ADP+n Pi — CH3C00H+2H20+n ATP如附圖I所描述的Wood-Ljungdahl途徑與Na+或H+離子梯度的建立相偶聯，其可以經Na+或H+依賴ATP合酶產生ATP，各自在產乙酸菌中Muller V.能量守恒。Appl EnvironMicrobiol 69:6345-6353(2003)。基于這些已知的轉化，產乙酸菌還能夠利用CO作為唯一的碳和能量來源。特別地，CO可以被氧化產生還原當量和CO2，或直接同化到乙酰輔酶A中，其隨后轉化為生物質或乙酸。4C0+2H20 — CH3C00H+2C02但是，當存在足夠的氫以滿足還原當量的需求量，甚至可以達到更高的乙酸產率。2C0+2H2 — CH3COOH根據圖I，經乙酰輔酶的乙酸生產生成I個ATP分子，而從乙酰輔酶A的乙醇生產不生成ATP且需要2個還原當量。因此，可以得出結論，在沒有乙酸產生時，從合成氣中生產乙醇不會產生足夠的能量用于細胞生長。但是，在某些條件下，Clostridium Ijungdahlii主要從合成氣中生產乙醇(Klasson等人，Fuel 72. 12:1673-1678 (1993))，這表明一些相結合的途徑確實產生足夠的能量來支持細胞生長。2C02+6H2 — CH3CH20H+3H206C0+3H20 — CH3CH20H+4C022C0+4H2 — CH3CH20H+H20產氫細菌如深紅紅螺菌也可以在CO和水轉化為氫的過程中產生能量(參見附圖I) (Simpma 等人，Critical Reviews in Biotechnology, 26. 1:41-65 (2006))。中心機制是能量轉換氫化酶(ECH)和CO脫氫酶的協調活動。CO脫氫酶提供來自CO的電子，然后電子被ECH用于將質子還原成H2,它們的活動與能量產生的質子轉為相偶聯。最終的結果是通過水煤氣變換反應產生的能量。本文公開的用于從合成氣中生物合成生產1，3-BD0的方法包含可持續生產實踐，其利用可再生原料，降低能量強度和減低溫室氣體排放。此外，生物基-1，3-BD0的脫水是在小型終端使用的設備中生產丁醇的可再生途徑，其中不需要可燃的和活性化學品的運輸。如本文所用的，提到本發明的微生物有機體或微生物時使用的術語“非天然存在”意指微生物有機體有至少一個的遺傳改變，其在相關物種的天然存在菌株(包括相關物種的野生型菌株)中通常找不到。遺傳改變包括，例如，引入編碼代謝性多肽的可表達核酸的修飾、其他核酸添加、核酸刪除和/或微生物的遺傳物質的其他功能破壞。這樣的修飾包括，例如，它的編碼區域和功能性片段，對于相關物種的異源、同源或既有異源又有同源的多肽。其他修飾包括，例如，非編碼調節區域，其中修飾改變基因或操縱子的表達。示例性 的代謝性多肽包括1，3- 丁二醇生物合成途徑在內的酶或蛋白。代謝性修飾是指一種生化反應，其改變它的天然存在狀態。因此，非天然存在微生物可以具有對其編碼代謝性多肽的核酸或功能片段的遺傳修飾。本文公開了示例性的代謝性修飾。如本文所用的，提到微生物有機體時使用的術語“分離”意指一個有機體，其至少缺少自然界中找到的相關微生物有機體的一個組分。該術語包括這樣的微生物，其刪除了自然環境中找到的這種微生物中一些或所有組分。該術語還包括這樣的微生物有機體，其刪除了非天然存在的環境中找到的這種微生物中一些或所有組分。因此，分離的微生物是部分或完全地與那些在自然界或那些生長、儲藏或生存在非天然存在的環境中找到的其他物質相分離。分離的微生物的具體例子包括部分純的微生物、基本上純的微生物和培養在非天然存在的培養基中的微生物。如本文所用的，術語“微生物(microbial)”、“微生物有機體(microbialorganism)”或“微生物(microorganism)”意指任何以顯微細胞存在的有機體,其包括在古細菌、細菌或真核的范圍內。因此，該術語包含具有顯微大小的原核或真核細胞或有機體，并且包括細菌、古細菌和真細菌的所有物種，以及真核微生物如酵母和真菌。該術語還包括細胞培養的任何物種，其可以培養用于生物化學品的生產。如本文所用的，術語“CoA”或“輔酶A”意指一種有機輔因子或輔基(酶的非蛋白部分)，它的存在是許多酶(脫輔基酶)的活性所必需的，以形成活化的酶系統。在某些縮合酶中，輔酶A在乙酰或其他酰基轉移以及脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及其他乙酰化中發揮作用。如本文所用的，提到培養或生長條件時使用的術語“基本上厭氧”意指液體培養基中的溶解氧的量少于約10%的飽和度。這個術語也包括液體或固體培養的密封室中維持少于約1%氧的大氣壓。本文所用的“外源”意指相關分子或相關活性引入到宿主微生物中。可以引入分子,例如,將編碼核酸引入到宿主遺傳物質中，如通過整合到宿主染色體或非染色體遺傳物質如質粒中。因此，提到編碼核酸的表達時使用的該術語是指編碼核酸以可表達形式引入到微生物中。在提到生物合成活性時使用，該術語是指一種引入到宿主相關有機體中的活性。來源可以是，例如，同源或異源的編碼核酸，其在被引入到宿主微生物后表達相關活性。因此，術語“內源”是指存在在宿主中的相關分子或活性。類似地，當在提到表達編碼核酸時使用時，該術語是指微生物內含的編碼核酸的表達。術語“異源”是指分子或活性來自除相關物種以外的來源，而“同源”是指分子或活性來自宿主微生物。相應地，本發明的編碼核酸的外源性表達可以利用異源或同源編碼核酸的任一個或兩者。可以理解地，當微生物中包含超過一個外源核酸時，該超過一個外源核酸是指如上文詳述的相關編碼核酸或生物合成活性。進一步可以理解地，正如本文所述的，這種超過一個的外源核酸可以在分離核酸分子、多順反子核酸分子或其結合上被引入到宿主微生物，并仍被認為是超過一個的外源核酸。例如，如本文所描述的，一個微生物可以被加工成表達兩個或更多的編碼期望途徑的酶或蛋白的外源核酸。在兩個編碼期望活性的外源核酸引入到宿主微生物的情況下，我們可以理解這兩個外源核酸可作為單個核酸引入，例如，在一個單個質粒上，或在分離的質粒上，可以整合到宿主染色體的單個位置或多個位置，并仍 被認為是兩個外源核酸。類似地，我們可以理解超過兩個外源核酸可以任何期望的組合引入到宿主微生物中，例如，在單個質粒上，在分離的質粒上，可整合到宿主染色體的單個位置或多個位置，并仍被認為是超過兩個外源核酸，例如三個外源核酸。因此，相關外源核酸或生物合成活性的數量是指編碼核酸的數量或生物合成活性的數量，而不是引入到宿主微生物中的分離核酸的數量。本發明的非天然存在的微生物可包括穩定的遺傳改變，其是指微生物可培養超過5代而不丟失該改變。通常，穩定的遺傳改變包括維持超過10代的修飾，特別地，穩定的修飾可維持超過約25代，更特別地，穩定的遺傳修飾可以超過50代，包括無限期。本領域技術人員可以理解，包括本文示例性的代謝修飾的遺傳改變的描述是與下列有機體相關，合適的宿主有機體例如大腸桿菌E. coli和它們相關的代謝反應或者作為期望遺傳物質如期望代謝途徑的基因的合適來源的有機體。但是，由于品種多樣的有機體的完整的基因組序列和基因組領域的高水平，本領域技術人員能夠很容易把本文所提供的教導和指導應用到基本上所有的其他有機體上。例如，本文示例性的大腸桿菌E. coli代謝改變可以容易地應用到其他物種中，通過摻合來自引用物種以外的物種的相同或相似的編碼核酸。這樣的遺傳改變包括，例如，物種同源性的遺傳改變，一般地，以及特別地，同源、旁系或非同源的基因替換。同源體是不同的有機體中以垂直族系(vertical descent)相關聯且具有基本上相同或同一功能的基因。例如，因為環氧化物的水解酶的生物學功能，鼠環氧化物水解酶和人環氧化物水解酶可以被認為是同源體。當例如基因共有足量的序列相似性以表明它們是同源的時候，基因以垂直族系相關聯；或者基因以進化自共同的祖先相關聯。基因也可以被認為是同源，如果它們共享三維結構但不必要序列相似性，有足夠的量以表明它們自共同祖先進化至基礎序列相似性不同的程度。同源的基因可以編碼序列相似性約25%至100%氨基酸序列同一性的蛋白。編碼共享氨基酸相似性少于25%的蛋白的基因也可以被認為是由垂直族系產生的，如果它們的三維結構也表現出相似性。酶的絲氨酸蛋白酶家族的成員，包括組織型纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶，被認為是由共同祖先的垂直族系產生的。
同源體包括基因或它們編碼的基因產物，其經過，例如進化，在結構或全部的活性上已有差異。例如，一個物種編碼一種顯示兩個功能的基因產物且該功能在第二種物種中已經分成不同的基因，那么這3種基因和它們的相關產物被認為是同源體。關于生物化學的產物的生產，本領域技術人員可以理解，選擇引入或是破壞含代謝活性的同源基因是為了非天然存在的微生物的構建。同源體顯示可分離活性的一個例子是在兩個或更多物種之間或在單個物種內，不同的活性已被分成不同的基因產物。一個具體的例子是彈性蛋白酶蛋白酶解和纖維蛋白溶酶原蛋白酶解的分離，絲氨酸蛋白酶的兩種類型，成為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶這兩種不同的分子。第二個例子是支原體5’ -3’核酸外切酶和果蠅Drosophila DNA聚合酶III活性。來自第一個物種的DNA聚合酶可被認為是來自第二個物種的核酸外切酶或聚合酶中的一個或兩者的同源體，反之亦然。相反地，旁系體是這樣的同源體，其與例如進化趨異后的復制有關，具有相似或共同但不完全相同的功能。旁系體可以起源于或衍生自例如相同的物種或來自不同的物種。例如，微粒體的環氧化物水解酶(環氧化物水解I)和可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)可被認為是旁系體，因為它們表示兩種不同的酶，共同進化自共同的祖先，它們催化不同的反應并在相同物種中具有不同的功能。旁系體是這樣的蛋白，其來自相同物種且 彼此之間具有顯著的序列相似性以表明它們是同源，或通過共同進化自共同的祖先而相關聯。旁系蛋白家族的成員包括HipA同源體、熒光素酶基因、肽酶和其他。非同源基因替換是來自一種物種的非同源基因能替換為不同物種中的相關功能基因。替換包括，例如，相比于所述不同物種中的相關功能，能夠執行基本上相同或相似的功能的起源物種。盡管通常地，非同源基因替換可以鑒別為與編碼相關功能的已知基因結構上相關，然而較低的結構相關性但是功能相似的基因及其對應的基因產物將仍落入本文所用的該術語的含義之內。功能相似性要求，例如，在非同源基因產物的活性位點或結合區域上至少一些結構相似性，相比于編碼要替換的功能的基因。因此，非同源基因包括，例如，旁系或不相關基因。因此，在鑒別和構建本發明的具有1，3_ 丁二醇生物合成能力的非天然存在的微生物時，本領域技術人員可以理解將本文提供的教導和指導應用于具體的物種，其中代謝修飾的鑒別可包括同源體的確認和包含或失活。就存在于編碼催化相似或基本上相似代謝反應的酶的相關微生物中的旁系和/或非同源基因替換而言，本領域技術人員還可以利用這些進化相關基因。同源、旁系和非同源基因替換可以用本領域技術人員已知的方法來測定。例如，兩個多肽的核酸或氨基酸序列的檢測將顯示比較序列之間的序列同一性和相似性。基于這些相似性，本領域技術人員可以確定該相似性是否高到足以表明蛋白是通過進化自共同的祖先而相關聯的。本領域技術人員已知的算法，如Align、BLAST、Clustal W和其他比較并測定未加工序列相似性或同一性，還測定序列中間隙的存在或重要性，其可以指定一個比重或得分。這些算法也是本領域已知的，并類似地用于測定核苷酸序列相似性或同一性。測定相關性的足夠相似性的參數基于計算統計學相似性的公知方法來計算，或者在隨機多肽中找到相似配對的機會，以及測定配對的顯著性。如果需要的話，兩個或更多序列的計算機比較還可以通過本領域技術人員肉眼來優化。相關基因產物或蛋白可期望具有高相似性，例如，25%至100%的序列同一性。不相關蛋白可以具有這樣的同一性，其基本上與被期望偶然發生的一樣(約5%)，如果掃描足夠大的數據庫。5%至24%之間的序列可能或可能不代表足夠的同源性來得出比較序列是相關的結論。基于數據庫的大小測定這樣的配對的顯著性的其他統計學分析可以用來測定這些序列的相關性。使用BLAST算法來確定兩個或更多序列的相關性的示例性參數，例如，可以如下設置。簡而言之，氨基酸序列比對可以用BLASTP版本2. 0.8(1999年I月5日)和以下參數來進行矩陣0 BL0SUM62 ;間隙開放11 ;間隙延伸1 ；x_dropoff :50 ;期望:10. 0 ;字長3;過濾開。核酸序列比對可以用BLASTN版本2. 0.6 (1998年9月16日)和以下參數進行配對1 ;錯配-2 ;間隙開放5 ;間隙延伸2 ；x_dropoff :50 ;期望10. 0 ； 11 ;過濾關。本領域技術人員知道可以對上述參數進行哪些修改以增加或減少例如比較的嚴緊性，以及確定兩個或多個序列的相關性。在一些實施方式中，本發明提供具有1，3_ 丁二醇(1，3-BD0)途徑的非天然存在微生物，其包括至少一個編碼足量表達以產生1，3-BD0的1，3-BD0途徑酶或蛋白的外源性核酸。1，3-BD0途徑包括甲醇甲基轉移酶(MtaB)、類咕啉蛋白(MtaC)、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)、類咕啉鐵-硫 蛋白(AcsD)、鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)、鐵氧化還原蛋白(0rf7)、乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)、一氧化碳脫氫酶(AcsA)、氫化酶(Hyd)、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4_羥基，2- 丁酮還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)、3-羥基丁酰輔酶A轉移酶、3-羥基丁酰輔酶A水解酶、3-羥基丁酰輔酶A合成酶、3-羥基丁酸脫氫酶、3-羥基丁還原酶、乙酰乙酰輔酶A轉移酶、乙酰乙酰輔酶A水解酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶、或乙酰乙酸還原酶。在一些實施方式中，1，3_BD0途徑酶是選自以下的一組酶A:1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，13) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和14) 4-羥基，2- 丁酮還原酶；B:l)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB),12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，13) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和14)3-羥基丁醛還原酶；C :1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9)—氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，13)3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)，和14) 3-羥基丁醛還原酶；D :1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，和13)3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成);E 1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9) —氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶,11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)，和14)4-羥基，2- 丁酮還原酶；F:l)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB),12)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，13)乙酰乙酸還原酶，14) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和15)3-羥基丁醛還原酶；G 1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，
3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，13)乙酰乙酸還原酶，14) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和15) 4-羥基，2-丁酮還原酶；H:1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，
4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9)一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，13) 3-羥基丁酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，14) 3-羥基丁酸還原酶，和15) 3-羥基丁醛還原酶；1 1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，13) 3-羥基丁酸脫氫酶，14) 3-羥基丁酸還原酶，和15) 3-羥基丁醛還原酶。非天然存在的微生物可以包括2個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在一些實施方式中，3個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸,在其他實施方式中，4個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，5個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，6個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，7個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，8個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，9個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，10個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，11個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，12個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，13個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，14個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，15個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，還在其他實施方式中。這些至少一個外源核酸的任一個可以是異源核酸，并且可以構建該非天然存在的微生物用于培養在基本上厭氧培養基中。這樣的微生物可以使用選自以下的碳原料1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2，3 )甲醇、CO、CO2和H2，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣，5 )甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣，6) —種或多種碳水化合物，7)甲醇和一種或多種碳水化合物，和8)甲醇。示例性碳水化合物包括，但不局限于，葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖和甘油。在一些實施方式中，本發明提供一種非天然存在的微生物，包含具有1，3_ 丁二醇(1，3-BD0)途徑的微生物，所述途徑包含至少一個編碼足量表達以產生1，3-BD0的1，3-BD0途徑酶或蛋白的外源性核酸，所述1，3-BD0途徑包含甲酸脫氫酶，甲酰四氫葉酸合成酶，次甲基四氫葉酸酯環水解酶，亞甲基四氫葉酸脫氫酶，亞甲基四氫葉酸還原酶，甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),鐵氧化還原蛋白(0rf7),乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), —氧化碳脫氫酶 (AcsA)，氫化酶(Hyd)，乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，3-羥基丁醛還原酶，乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)，3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，4-羥基，2- 丁酮還原酶，乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)，3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)，3-羥基丁酰輔酶A轉移酶，3-羥基丁酰輔酶A水解酶，3-羥基丁酰輔酶A合成酶，3-羥基丁酸脫氫酶，3-羥基丁酸還原酶，乙酰乙酰輔酶A轉移酶，乙酰乙酰輔酶A水解酶，乙酰乙酰輔酶A合成酶，或乙酰乙酸還原酶。在一些實施方式中，1，3_BD0途徑酶選自下列酶的一組:A:l)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD),8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),9)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，15) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和16) 4-羥基，2-丁酮還原酶；B:1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，9)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，11)一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB), 14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，15)3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和16)3-羥基丁醛還原酶；C
I)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 9)鐵氧化還原蛋白(0rf7),10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，15) 3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)，和16)3-羥基丁醛還原酶；D 1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶,5)亞甲基四氫葉酸還原酶,6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，9)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，12)氫化酶(Hyd)，13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)，和15) 4-羥基，2- 丁酮還原酶；E : I)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD),8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),9)鐵氧化還原蛋白(OrfT), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，和15) 3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)；F 1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯cyclo水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 9)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶， 15)乙酰乙酸還原酶，16) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和17) 3-羥基丁醛還原酶；G :1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD),8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),9)鐵氧化還原蛋白(0rf7),10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，15)乙酰乙酸還原酶，16) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和17) 4-羥基，2- 丁酮還原酶；H :1)甲酸脫氫酶，
2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 8)鎳-蛋白裝配蛋白(Acs&CooC),9)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，15) 3-羥基丁酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，16) 3-羥基丁酸還原酶，和17) 3-羥基丁醛還原酶；1 1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD),8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),9)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB), 14)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，15) 3-羥基丁酸脫氫酶，16) 3-羥基丁酸還原酶，和17) 3-羥基丁醛還原酶。非天然存在的微生物可包括2個各自編碼一個1，3-BD0途徑的外源核酸，在一些實施方式中，3個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，4個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，5個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，6個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，7個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，8個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，9個各自編碼一個1，3-BD0途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，10個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，11個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，12個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，13個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，14個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，15個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，16個各自編碼一個1，3-BDO途徑酶的外源核酸，在其他實施方式中，和17個外源核酸，還在其他實施方案中。這些至少一個外源核酸的任一個可以是異源核酸，并且可以構建該非天然存在的微生物用于培養在基本上厭氧培養基中。這樣的微生物可以使用選自以下的碳原料l)CO，2)CO2和H2, 3) CO、CO2和H2,4)包含CO和H2的合成氣，5)包含CO、CO2和H2的合成氣，6) —種或多種碳水化合物。示例性碳水化合物包括，但不局限于，葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖和甘油。在一個其他的實施方式中，本發明提供具有1，3_ 丁二醇途徑的非天然存在的微 生物，其中非天然存在的微生物包含至少一個編碼酶或蛋白的外源性核酸，其將底物轉化成產物，該轉化選自以下二氧化碳到FOR，FOR到10FTHF，10FTHF至METHF，METHF至MLTHF，MLTHF 至 5MTHF，甲醇至 CH3-MtaC, CH3-MtaC 至 5MTHF，5MTHF 至 CFeSp-CH3, CFeSp-CH3 至乙酰輔酶A，乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A，乙酰乙酰輔酶A至3-羥基丁基輔酶A，3-羥基丁基輔酶A至3-羥基丁醛，3-羥基丁醛至1，3-BD0, 3-羥基丁基輔酶A至1，3-BD0,乙酰乙酰輔酶A至4-輕基-2- 丁酮，乙酰乙酰輔酶A至3-氧丁醒(3-oxobutryaldehyde), 3_氧丁醛至4-羥基-2- 丁酮，4-羥基-2- 丁酮至1，3-BD0, 3-氧丁醛至3-羥基丁醛，乙酰乙酰輔酶A至乙酰乙酸，乙酰乙酸至3-氧代丁醛，乙酰乙酸至3-羥基丁酸，3-羥基丁酰輔酶A至3-羥基丁酸，和3-羥基丁酸至3-羥基丁醛。本領域技術人員可以理解，這些僅僅是示例，且基于本文的教導，本文公開的任何適合生產想要產物的底物-產物對和可用于將底物轉化為產物的恰當的活性可以容易地被本領域技術人員所確定。因此，本發明提供包含至少一個編碼酶或蛋白的外源性核酸的非天然存在的微生物，其中酶或蛋白轉化底物和1，3_ 丁二醇途徑的產物，例如附圖4和5顯示的那些。當本文通常描述為包含1，3- 丁二醇途徑的微生物時，可以理解地，本發明還提供包含至少一個外源性核酸的非天然存在的微生物，所述外源性核酸編碼足量表達以產生1，3-丁二醇途徑的中間產物的1，3-丁二醇途徑酶或蛋白。例如，如本文所公開的，I, 3-丁二醇途徑示例在附圖4和5。因此，除了包含產生1，3- 丁二醇的1，3- 丁二醇途徑的微生物夕卜，本發明還提供包含至少一個編碼1，3-丁二醇途徑酶的外源核酸的非天然存在的微生物，其中微生物產生1，3- 丁二醇途徑中間產物，例如，乙酰輔酶A，乙酰乙酰輔酶A，乙酰乙酸，3-羥基丁基輔酶A，3-羥基丁酸，3-氧代丁醛，4-羥基-2- 丁酮，和3-羥基丁醛。可以理解地，本文公開的任一途徑，如實施例和示例性附圖中的描述的，包括附圖4和5的途徑，可以用于產生非天然存在的微生物，其生產任何途徑的中間產物或產物，按照期望的。如本文公開的,這樣的生產中間產物的微生物可以與其他表達下游途徑酶生產想要產物的微生物結合使用。但是，可以理解地，生產1，3-丁二醇途徑中間產物的非天然存在的微生物可以用于生產中間產物作為期望的產物。因此，本發明的非天然存在的有機體可以用于生產，例如，乙酰乙酸，3-羥基丁酸，3-氧代丁醛，3-羥基丁醛，或4-羥基-2- 丁酮。因此，這些中間產物的任何一個可以利用附圖4和5所示的途徑在分離的有機體中產生。在一些實施方式中，本文描述的非天然存在的有機體具有如附圖4所示的3個能力1)功能性甲基轉移酶系統，提供從甲醇和THF中生產5-甲基-四氫葉酸(Me-THF)，2)結合CO、輔酶A和Me-THF的甲基以形成乙酰輔酶A的能力，和3)從乙酰輔酶A合成1，3- 丁二醇的能力。后者可以通過碳水化合物經糖酵解產生丙酮酸而得到促進。糖酵解是一個厭氧代謝途徑，其可在所有活的有機體細胞的細胞質中找到。這個過程將一分子葡萄糖轉化為2分子丙酮酸，同時提供2個凈分子ATP 葡萄糖+2NAD++2PJ2ADP — 2 丙酮酸 +2NADH+2ATP+2H++2H2O這種非天然存在的有機體可以“固定(fix)”外源性CO和/或CO2和甲醇的碳以 合成乙酰輔酶A、細胞量和產物。值得注意的是,相比于利用全部的Wood-Ljungdahl途徑，執行從甲醇和合成氣形成乙酰輔酶A的途徑是能量有利的。例如，合成氣到乙酸的直接轉化是能量中立過程(參見附圖I和2)。特別地，由甲酰基-THF合酶形成甲酰基-THF的過程中消耗一個ATP分子，而經乙酸激酶生產乙酸的過程產生I個ATP分子。本文公開的途徑圍繞著ATP消耗，通過保證甲基分支產物甲基-THF的甲基是從甲醇而不是CO2中得到。這保證了乙酸形成有正ATP產率，其可以幫助支持細胞生長和維持。被加工成具有這些能力并具有(糖)回補(anapleurosis)能力的宿主微生物(例如大腸桿菌)在存在合適的外部電子受體如硝酸的情況下可以在甲醇和合成氣生產的乙酰輔酶A中生長。電子受體用于接受來自經琥珀酸脫氫酶形成的還原醌的電子。添加外部電子受體的另一個好處是，用于細胞生長、維持和產物形成的額外能量可由乙酰輔酶A的呼吸來產生。在一些實施方式中，另一個非天然存在的微生物具有丙酮酸鐵氧還原蛋白氧化還原酶(PFOR)或其他促進丙酮酸轉化到乙酰輔酶A的酶或反之亦然進入菌株以促進生物量母體的合成，在缺少外部電子受體的情況下。該非天然存在的有機體的另一特征是從分子氫中提取還原當量的能力。這能使還原產物例如乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、4-羥丁酸、3-羥丙酸、乳酸、己二酸、甲基丙烯酸和丙烯酸具有高的產率。本發明描述的有機體可以從下列物質中生產乙酰輔酶A、細胞量和目標化學制品，更特定地是1，3-BD0，所述物質是1)甲醇和CO，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、C0、C02和H2,4)甲醇和包含CO和仏的合成氣，5)甲醇和包含C0、C02和仏的合成氣，6)—種或多種碳水化合物，7)甲醇和一種或多種碳水化合物，和8)甲醇。示例性的碳水化合物包括，但不限于，葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖和甘油。成功地將這些途徑加工到一個有機體中包含鑒別一組恰當的酶，克隆它們的相應的基因到生產宿主，優化這些基因的穩定性和表達，優化發酵條件，以及分析發酵后的產物形成。下面描述了催化途徑的各步驟的許多酶，所述途徑使用合成氣和甲醇轉化成乙酰輔酶A，以及進一步轉化成至1，3-丁二醇。為了加工生產宿主用于合成氣和甲醇的利用，一個或多個編碼這些途徑的酶的外源DNA序列可以在微生物中表達。如附圖4所示的外來宿主中的改良的Wood-Ljungdahl途徑的表達包含引入一組甲基轉移酶來利用甲醇提供的碳和氫以及CO和/或CO2提供的碳。名稱為MtaA、MtaB和MtaC的這3個甲基轉移酶蛋白的復合體執行期望的甲醇甲基轉移酶活性(Sauer等人，Eur.J. Biochem.243. 3:670-677(1997) ;Naidu 和 Ragsdale，J. Bacteriol. 183. 11:3276-3281 (2001) ；Tallant 和 Krzycki,J. Biol. Chem. 276. 6:4485-4493(2001) ；Tallant 和 Krzycki,J.Bacteriol. 179. 22:6902-6911(1997) ；Tallant 和 Krzycki, J.Bacteriol. 178. 5:1295-130I (1996) ；Ragsdale, S. ff.，Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39. 3:165-195 (2004))。MtaB是一種鋅蛋白，其催化甲基從甲醇轉移到MtaC，一種類咕啉蛋白。編碼MtaB和MtaC的示例性基因可以在產甲烷古細菌例如巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinabarkeri) (Maeder 等人，J. Bacteriol. 188. 22:7922-7931 (2006))和醋酸甲烷八疊球菌(Methanosarcina acetivorans) (Galagan 等人，Genome Res. 12/4:532-542 (2002))以及產乙酸菌熱醋穆爾氏菌(Das等人，Proteins 67. 1:167-176 (2007))中找到。通常地MtaB和MtaC基因在染色體上彼此靠近，因為它們的活性是緊密地相互依賴。在巴氏甲烷八疊球菌、醋酸甲烷八疊球菌和熱醋穆爾氏菌中的各種MtaB和MtaC的編碼基因的蛋白序列可以通過它們下列的GenBank登記號來鑒定
蛋白~ GenBank ID GI號有機體
MtaBl YP—304299 73668284 巴氏甲烷八疊球菌~
MtaCl YP—304298 73668283 巴氏甲烷八疊球菌~
MtaB2 YP—307082 73671067 巴氏甲烷八疊球菌~
MtaC2 YP—307081 73671066 巴氏甲烷八疊球菌~
MtaB3 YP—304612 73668597 巴氏甲烷八疊球菌~
MtaC3 YP—304611 73668596 巴氏甲烷八疊球菌~
MtaBl NP—615421 20089346 醋酸甲烷八疊球菌~
MtaBl NP—615422 20089347 醋酸甲烷八疊球菌~
MtaB2 NP—619254 20093179 醋酸甲烷八疊球菌~
MtaC2 NP—619253 20093178 醋酸甲烷八疊球菌~
MtaB3 NP—616549 20090474 醋酸甲烷八疊球菌~
MtaC3 NP—616550 20090475 醋酸甲烷八疊球菌~
權利要求
1.一種非天然存在的微生物有機體，包含具有1，3- 丁二醇(1，3-BD0)途徑的微生物有機體，該途徑包含至少一個外源性核酸，該外源性核酸編碼足量表達以產生1，3-BD0的I,3-BD0途徑酶或蛋白，所述1，3-BD0途徑包含甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸酯環水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(Ac sE)、類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)、鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)、鐵氧化還原蛋白(0rf7)、乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)、一氧化碳脫氫酶(AcsA)、氫化酶(Hyd),乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3-羥基丁醛還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)、3-氧代丁醛還原酶(醛還原)、4_羥基，2- 丁酮還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)、3_羥基丁酰輔酶A轉移酶、3-羥基丁酰輔酶A水解酶、3-羥基丁酰輔酶A合成酶、3-羥基丁酸脫氫酶、3-羥基丁酸還原酶、乙酰乙酰輔酶A轉移酶、乙酰乙酰輔酶A水解酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶或乙酰乙酸還原酶； 其中所述1，3-BD0途徑酶選自下列的一組酶:A :1) 3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成),2)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，3)甲酸脫氫酶，4)甲酰四氫葉酸合成酶，5)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，6)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，7)亞甲基四氫葉酸還原酶，8)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，9)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，10)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 11)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，12) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，13)氫化酶(Hyd)，14)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，15)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，和16) 3-羥基丁醛還原酶:1)3-羥基丁酸還原酶，2)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，3)甲酸脫氫酶,4)甲酰四氫葉酸合成酶，5)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，6)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，7)亞甲基四氫葉酸還原酶，8)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，9)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 10)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 11)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 12) 一氧化碳脫氫酶(八(^)，13)氫化酶(取(1)，14)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，15)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，16)3_羥基丁酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，和17)3-羥基丁醛還原酶；C 1)3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)，2)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，3)甲酸脫氫酶，4)甲酰四氫葉酸合成酶，5)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，6)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，7)亞甲基四氫葉酸還原酶，8)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，9)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 10)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 11)鐵氧化還原蛋白(OrfT), 12) 一氧化碳脫氫酶(八(^)，13)氫化酶(取(1)，14)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，和15)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，D:l)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶,5)亞甲基四氫葉酸還原酶,6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(Ac SE )，7 )類咕啉鐵-硫蛋白(Ac sD )，8 )鎳-蛋白裝配蛋白(Ac sF&CooC )，9)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11)一氧化碳脫氫酶(AcsA),12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB), 14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，15)3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和16)4-羥基，2- 丁酮還原酶；E :1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 9)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，15) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和16)3-羥基丁醛還原酶；F 1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶,5)亞甲基四氫葉酸還原酶,6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，9)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，12)氫化酶(Hyd)，13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)，和15) 4-羥基，2- 丁酮還原酶；G : I)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD),8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),9)鐵氧化還原蛋白(0rf7), 10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 11) 一氧化碳脫氫酶(AcsA), 12)氫化酶(Hyd), 13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB), 14)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，15)乙酰乙酸還原酶，16) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和17) 3-羥基丁醛還原酶；H:1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶， 3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6) 甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，9)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，11)一氧化碳脫氫酶(AcsA)，12)氫化酶(Hyd)，13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，15)乙酰乙酸還原酶，16) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和17) 4-羥基，2-丁酮還原酶；以及I :1)甲酸脫氫酶，2)甲酰四氫葉酸合成酶，3)次甲基四氫葉酸酯環水解酶，4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶，5)亞甲基四氫葉酸還原酶，6)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，7)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，8)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，9)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，10)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，11) 一氧化碳脫氫酶(八(^)，12)氫化酶(取(1)，13)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，14)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，15)3-羥基丁酸脫氫酶，16)3-羥基丁酸還原酶，和17)3-羥基丁醛還原酶。
2.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含兩個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
3.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含3個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
4.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含4個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
5.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含5個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
6.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含6個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
7.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含7個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
8.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含8個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
9.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含9個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
10.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含10個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
11.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含11個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
12.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含12個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
13.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含13個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
14.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含14個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
15.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含15個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
16.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含16個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
17.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含17個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
18.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述的至少一個外源性核酸是異源性核酸。
19.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述的非天然存在的微生物有機體是在基本上缺氧的培養基中。
20.權利要求I所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述的微生物有機體使用碳原料，該碳原料選自I) CO，2) COdPH2, 3) CO、CO2和H2,4)包含CO和H2的合成氣，5)包含CO、CO2和H2的合成氣，和6) —種或多種碳水化合物。
21.一種生產1，3-BD0的方法，包括權利要求I的非天然存在的微生物有機體在一定條件下培養充足的一段時間以生產1，3-BD0。
22.權利要求21所述的方法，其中所述的非天然存在的微生物有機體是在基本上缺氧的培養基中。
23.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含兩個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
24.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含3個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
25.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含4個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
26.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含5個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
27.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含6個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼I，3-BDO途徑酶。
28.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含7個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
29.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含8個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
30.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含9個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼l，3-BDO途徑酶。
31.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含10個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
32.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含11個外源性核酸,該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
33.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含12個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
34.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含13個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
35.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含14個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
36.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含15個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
37.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含16個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
38.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體包含17個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
39.權利要求21所述的方法，其中所述至少一個外源性核酸是異源性核酸。
40.權利要求21所述的方法，其中所述微生物有機體使用碳原料，該碳原料選自l)CO，2)CO2和H2, 3) CO、CO2和H2,4)包含CO和H2的合成氣，5)包含CO、CO2和H2的合成氣，和6) 一種或多種碳水化合物。
41.一種非天然存在的微生物有機體，包含具有1，3_ 丁二醇(1，3-BD0)途徑的微生物有機體，該途徑包含至少一個外源性核酸，該外源性核酸編碼足量表達以產生1，3-BD0的1，3-BD0途徑酶或蛋白，所述1，3-BD0途徑包含甲醇甲基轉移酶(MtaB)、類咕啉蛋白(MtaC),甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)、類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)、鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)、鐵氧化還原蛋白(0rf7)、乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)、一氧化碳脫氫酶(AcsA)、氫化酶(Hyd)、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4_羥基、2- 丁酮還原酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醇形成)、3-羥基丁酰輔酶A轉移酶、3-羥基丁酰輔酶A水解酶、3-羥基丁酰輔酶A合成酶、3-羥基丁酸脫氫酶、3-羥基丁酸還原酶、乙酰乙酰輔酶A轉移酶、乙酰乙酰輔酶A水解酶、乙酰乙酰輔酶A合成酶或乙酰乙酸還原酶。
42.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述1，3-BD0途徑酶是選自下列的一組酶A:1)甲醇甲基轉移酶(1^&8)，2)類咕啉蛋白(1^&0，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9) —氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶,11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，13) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和14) 4-羥基，2-丁酮還原酶；B 1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醛形成)，13)3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和14)3-羥基丁醛還原酶；C :1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC),7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9)一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，13) 3-羥基丁酰輔酶A還原酶(醛形成)，和14) 3-羥基丁醛還原酶；D :1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD),6)鎳-蛋白裝配蛋白(Ac sF&CooC )，7 )鐵氧化還原蛋白(Or f 7 )，8 )乙酰輔酶A合酶(Ac sB&AcsC )，9 )一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，和13)3-羥基丁酰輔酶々還原酶(醇形成)出1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9) —氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(輔酶A依賴，醇形成)，和13) 4-羥基，2-丁酮還原酶；F 1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，13)乙酰乙酸還原酶，14) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，和15) 3-羥基丁醛還原酶；G:1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD)，6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9) —氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，13)乙酰乙酸還原酶，14) 3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，和15) 4-羥基，2-丁酮還原酶；H :1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE)，5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC), 7)鐵氧化還原蛋白(0rf7),8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC), 9)—氧化碳脫氫酶(AcsA), 10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A還原酶(酮還原)，13) 3-羥基丁酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，14)3-羥基丁酸還原酶，和15)3-羥基丁醛還原酶；I :1)甲醇甲基轉移酶(MtaB)，2)類咕啉蛋白(MtaC)，3)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(MtaA)，4)甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉移酶(AcsE), 5)類咕啉鐵-硫蛋白(AcsD), 6)鎳-蛋白裝配蛋白(AcsF&CooC)，7)鐵氧化還原蛋白(0rf7)，8)乙酰輔酶A合酶(AcsB&AcsC)，9) 一氧化碳脫氫酶(AcsA)，10)氫化酶，11)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)，12)乙酰乙酰輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，13)3-羥基丁酸脫氫酶，14)3-羥基丁酸還原酶，和15)3-羥基丁醛還 原酶。
43.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含兩個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
44.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含3個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
45.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含4個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
46.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含5個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
47.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含6個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
48.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含7個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
49.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含8個 外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
50.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含9個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
51.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含10個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
52.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含11個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
53.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含12個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
54.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含13個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
55.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含14個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
56.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體包含15個 外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
57.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述至少一個外源性核酸是異源性核酸。
58.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述非天然存在的微生物有機體是在基本上缺氧的培養基中。
59.權利要求41所述的非天然存在的微生物有機體，其中所述微生物有機體使用碳原料，該碳原料選自I)甲醇和C0，2)甲醇、0)2和112，3)甲醇、0)、0)2和112，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣，5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣，和6) —種或多種碳水化合物，7)甲醇和一種或多種碳水化合物，和8)甲醇。
60.—種生產1，3-BD0的方法，包含權利要求41或42所述的非天然存在的微生物有機體在一定條件下培養充足的一段時間以生產1，3-BD0。
61.權利要求60所述的方法，其中所述的非天然存在的微生物有機體是在基本上缺氧的培養基中。
62.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含兩個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
63.權利要求60所述的方法,其中所述微生物有機體包含3個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
64.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含4個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
65.權利要求60所述的方法,其中所述微生物有機體包含5個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
66.權利要求60所述的方法,其中所述微生物有機體包含6個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
67.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含7個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
68.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含8個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
69.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含9個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
70.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含10個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
71.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含11個外源性核酸,該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
72.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含12個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
73.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含13個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
74.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含14個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
75.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含15個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BD0途徑酶。
76.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含16個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
77.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體包含17個外源性核酸，該外源性核酸各自編碼1，3-BDO途徑酶。
78.權利要求60所述的方法，其中所述至少一個外源性核酸是異源性核酸。
79.權利要求60所述的方法，其中所述微生物有機體使用碳原料，該碳原料選自I)甲醇和CO，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、C0、C02和H2,4)甲醇和包含CC^PH2的合成氣，5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣,和6) —種或多種碳水化合物,7)甲醇和一種或多種碳水化合物，和8)甲醇。
全文摘要
一種具有1,3-丁二醇(1,3-BDO)途徑的非天然存在的微生物有機體，包括至少一個外源性核酸，所述外源性核酸編碼足量表達以生產1,3-BDO的1,3-BDO途徑酶或蛋白。一種用于生產1,3-BDO的方法，其包括該非天然存在的微生物在一定條件下培養充足的一段時間以生產1,3-BDO。
文檔編號C12P7/52GK102753698SQ201080063593
公開日2012年10月24日 申請日期2010年11月19日 優先權日2009年12月10日
發明者A·P·博加德, M·J·伯克, 普里蒂·法克雅 申請人:基因組股份公司