對辛伐他汀合成表現出改善性質的LovD突變體的制作方法

專利名稱：對辛伐他汀合成表現出改善性質的LovD突變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于生物合成化合物如辛伐他汀的方法和材料，包括利用微生物宿主的過程。
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背景技術：
辛伐他汀是可分離自土曲霉(Aspergillus terreus)發酵液的天然產物洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降膽固醇藥，能顯著降低成人的心臟病風險。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司(Merck Co.)分別作為美降之(Mevacor)和舒降之(Zocor)銷售。辛伐他汀是洛伐他汀的更強效衍生物，并在2005年是美國第二暢銷藥物，單在美國就有45億美元的預期銷售。土曲霉(A. terreus)中用于洛伐他汀生物合成的基因簇(參見例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999，284，1368-1372 ;和 C. R. Hutchinson, J.等，AntonieVan Leeuwenhoek 2000，78，287-295)此前已有描述(參見例如，美國專利號6，391，583，其內容通過引用納入本文)。在所述基因簇中編碼的是46kD的蛋白質LovD，該蛋白最初鑒定為酯酶同系物。洛伐他汀生物合成的直接前體紅麴素J(Monacolin J)由上游巨合酶(megasynthase)LovB 組裝(參見例如，L. Hendrickson, C. R.等，Chem.Biol. 1999，6，429-439)，(該酶也稱為洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯酰基還原酶LovC和CYP450氧化酶。五碳單元側鏈由LovF (洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通過乙酰-CoA和丙二酰-CoA之間的縮合合成。縮合的二酮由單獨LovF結構域進行甲基化和還原性修飾產生共價連接于LovF酰基載體蛋白(ACP)結構域的磷酸泛酰巰基乙胺臂上的a-S-甲基丁酰基硫酯(參見例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000, 78，287-295),隨后從紅麴素J生成洛伐他汀。在土曲霉中滅活LovD或LovF導致前體紅麴素J的積累(參見例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000，78，287-295)。一旦制得洛伐他汀，例如在土曲霉宿主中經發酵制得，可從洛伐他汀生成辛伐他汀。目前，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀經土曲霉宿主的發酵獲得。純化該化合物后，如下進行半合成1)2-甲基丁酯側臂可在堿的存在下水解產生中間體紅麴素J;2)將游離酸內酯化；3)將C13處的醇官能團用保護基團(例如，叔丁基二甲基硅烷基)保護；4)將顯露的CS醇用酰基底物如2- 二甲基丁酰氯酯化產生C13保護形式的辛伐他汀；以及5)將C13 OH去保護產生辛伐他汀。此前已描述辛伐他汀的各種多步合成(參見例如，PCT WO 2005/066150和美國申請號20050080275與20040068123，其內容通過引用納入本文)。例如，廣泛采用的方法始于洛伐他汀中CS酯的水解產生三醇紅麴素J，然后選擇性硅烷化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并使C13醇去保護產生辛伐他汀(參見例如，ff. F. Hoffman,等，J. Med.Chem. 1986，29，849-852)。已研究用脂肪酶和酯酶來酶促轉化作為化學衍生的替代(參見例如，PCT WO 2005/040107, PCT WO 94/26920 和 T. G. Schimmel 等，Appl. Environ. Microbiol. 1997,63, 1307-1311，其內容通過引用納入本文)。但是，區域選擇性酯化的要求總是涉及其它醇基團的保護且常引起總體得率降低。因此，能選擇性酰化紅麴素J的CS的特異性試劑對于辛伐他汀和其它他汀類似物的有效合成很重要。上述方案的變形常見，但是大多數過程總是涉及首先分離洛伐他汀，水解甲基丁酯側鏈，保護游離醇，與酰基底物反應，以及去保護。盡管涉及的化學轉化相對簡單，但它們低效且涉及多個步驟，并因此造成目前制備辛伐他汀的高成本(每顆藥3美元)。為此，非常需要能促進高成本效率制備辛伐他汀和相關化合物的方法和材料。

發明內容
如下文詳述，現可用LovD酰基轉移酶多肽的變體在體外或體內產生辛伐他汀和相關化合物，所述變體經工程改造以顯示促進其用于生成辛伐他汀和/或胡伐他汀(huvastatin)的性能。本文所述材料和方法設計成使得能用最少改動將現有洛伐他汀制備的發酵設施轉化為制備辛伐他汀和相關化合物。本發明的實施方式提供設計用于利用制備洛伐他汀的生物方法來制備洛伐他汀的衍生物辛伐他汀的方法和材料。本發明還提供設計用于利用制備洛伐他汀的生物方法來制備相關化合物如普伐他汀衍生物胡伐他汀的方法和材料。本發明的實施方式包括的材料和方法可用于產生辛伐他汀而無需目前用來產生該化合物的多個化學合成步驟。本發明的典型實施方式不需要第一步先純化洛伐他汀然后進一步半合成過程，而是在發酵過程中聯用LovD酰基轉移酶多肽的變體和酰基硫酯化合物來產生辛伐他汀和/或胡伐他汀的制備。本文公開的發明有多種實施方式。本發明的一種說明性實施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的變體，所述LovD多肽變體包含至少一種特定氨基酸取代，例如AlOV ；D12G ；K26E ；C40A ；C60N ；A86V ；H161Y ；A190T ；K227R ；G275S ；V334D ;V334F 和 / 或 L361M。本發明的一種相關實施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的變體，該LovD多肽的變體包含一組氨基酸取代，例如一組至少3個氨基酸的取代在C40和C60位置氨基酸殘基處的取代，和在下組氨基酸殘基位置處的另外至少一種取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334 ;或L361。LovD多肽的此類取代變體中，氨基酸取代可包括在SEQ ID NO: I所示LovD多肽上氨基酸殘基位置處未見的19種氨基酸中任一種。通常，所述取代變體與SEQID NO: I所示LovD多肽相比呈現一種或多種改變的性質，例如聚集減少；熱穩定性改善；催化活性改善值改善；可溶表達水平改善；和/或25° C下的全細胞活性改善。如上所述，本發明的某些實施方式包括氨基酸取代的特定構象。例如，本發明的一些實施方式中，LovD多肽變體包含以下各組位置的氨基酸取代氨基酸殘基位置C40、C60和A86 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、A86和A190 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、D12、A86和G275 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、D12、A86、C40、C60、A190和G275 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、D12、K26、A86、C40、C60、H161、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、A10、D12、K26、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、K26、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275、V334 和 L361 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275和V334。這些變體的具體說明性實施方式包括具有下列氨基酸取代的變體D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ；G275S 和 V334F。本發明的實施方式包括編碼本文所述取代變體的多核苷酸，例如，與編碼本文所述LovD多肽變體的多核苷酸具有至少95%-100%序列相同性的已分離多核苷酸。本發 明的相關實施方式包括含這些多核苷酸的載體(例如，包括含控制序列的表達載體，所述控制序列被轉化有所述載體的宿主細胞所識別)以及含此類載體的宿主細胞。所述宿主細胞可選為大腸桿菌(Escherichia coli), 土曲霉(Aspergillus terreus),紅色紅曲菌(Monascus ruber),紫紅色紅曲菌(Monascus purpureus),叢毛紅曲菌(Monascuspilosus),玻璃質紅曲菌(Monascus vitreus),軟毛紅曲菌(Monascus pubigerus),卡氏念珠菌(Candida cariosilognicola),米曲霉(Aspergillus oryzea),斯梯蒙特皮真菌(Doratomyces stemonitis)，宛氏擬青霉(Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillumcitrinum)，產黃青霉(Penicillin chrysogenum),短尾帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis),粗糖鏈抱霉(Neurospora crassa)或綠色木霉(Trichoderma viride)。本發明的相關實施方式是制備LovD多肽變體的方法，包括將轉化有LovD多肽變體編碼子的宿主細胞在適于表達多肽的條件下培養，從而產生LovD多肽變體。在本發明的某些實施方式中，LovD多肽變體可融合異源氨基酸序列，例如能促進其處理的序列(例如，多組氨酸序列)。本發明的另一實施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽變體的制備方法，其包括利用多核苷酸誘變方法產生LovD多核苷酸的突變體群；表達由所述LovD多核苷酸的突變體群所編碼的LovD多肽變體群；從而制備LovD多肽的變體。所述多核苷酸誘變方法可選為飽和誘變或易錯聚合酶鏈反應法。本發明的這些實施方式通常包括篩選所述LovD多肽變體的一個或多個成員以鑒定出與SEQ ID NO: I所示LovD多肽相比具有以下性質的變體聚集減少；熱穩定性改善；酰基轉移酶活性改善；kcat/Km值改善；可溶表達水平改善；和/或25° C下的全細胞活性改善。所述多核苷酸誘變過程可選為受控過程，從而在編碼以下氨基酸殘基位置的密碼子處產生取代突變A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 ;和/或L361。在本發明的相關實施方式中，所述多核苷酸誘變過程受控從而產生的變體包含C40A與C60N ;以及在編碼以下氨基酸殘基位置的密碼子處的其它取代突變A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 ;和 / 或 L361。本發明的另一實施方式是制備辛伐他汀的方法，其包括以下步驟混合紅麴素J ；在LovD酰基轉移酶存在下將酰基部分提供給紅麴素J的C8羥基的酰基硫酯；和SEQ IDNO: I所示LovD酰基轉移酶多肽的某變體，所述LovD酰基轉移酶多肽變體包括以下殘基位置的至少一個氨基酸取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 或 L361 ;然后允許所述LovD多肽變體利用來自酰基硫酯的酰基以區域選擇性酰化紅麴素J的CS羥基；從而制得辛伐他汀。在本發明的某些實施方式中，在發酵培養基中混合紅麴素J ;酰基硫酯和LovD多肽變體，所述培養基中存在產生所述LovD酰基轉移酶的分離生物體，其中所述分離生物體為以下至少一種土曲霉；不表達SEQ ID NO:3所示LovF多肽的土曲霉；大腸桿菌；或不表達SEQ ID N0:4所示bioH多肽的大腸桿菌。可選在此類實施方式中，酰基硫酯選自丁酰基硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基-巰基乙酸硫酯，包含中等鏈長(C3-C6)酰基部分和/或能跨越生長在發酵培養基中的大腸桿菌或土曲霉細胞的細胞膜的酰基硫酯(例如，a - 二甲基丁酰基-S-甲基-巰基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰基-S-乙基巰基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰基-S-甲基巰基乙酸酯(DMB-S-MTG)及二甲基丁酰基-S-甲 基-巰基丁酸酯(DMB-S-MMB))。在制備辛伐他汀的方法中，所述分離的生物體可以生長于至少一種以下條件溫度為25-40° C ;持續時間為至少4到至少48小時；pH為7-8 ;和/或在含LB、Fl或TB培養基的發酵基質中。所述方法可選進一步包含通過至少一個純化步驟來純化由所述方法制得的辛伐他汀，所述步驟包括裂解存在于組合物中的分離生物體的細胞；離心；沉淀辛伐他汀的游離酸形式；將辛伐他汀的游離酸形式轉化成辛伐他汀鹽；過濾；或高效液相色譜(HPLC)。在某些實施方式中，所述方法制備物質組合物，其所含紅麴素J是最初與酰基硫酯混合的紅麴素J的0%-1%，所述酰基硫酯在LovD酰基轉移酶變體的存在下將酰基部分提供給紅麴素J的CS羥基；和/或使得加入組合物的紅麴素J中至少95%轉化成辛伐他汀。可選在這些方法中，LovD多肽變體包含氨基酸取代D12G、C40A、C60N、A86V、A190T和G275S ；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ;G275S和V334F。本發明的相關實施方式是物質組合物，其包含紅麴素J ;在LovD酰基轉移酶存在下將酰基部分提供給紅麴素J的C8羥基的酰基硫酯；SEQ ID NO: I所示LovD酰基轉移酶多肽的某變體，所述LovD多肽變體包括以下氨基酸取代在氨基酸殘基位置C40和C60 ；以及以下至少一個氨基酸殘基位置A10，D12，K26，A86，A190，H161，K227，G275，V334或L361 ;以及辛伐他汀。本發明的另一實施方式是制備胡伐他汀的方法，其包括以下步驟混合經水解的普伐他汀四醇；在LovD酰基轉移酶存在下將酰基部分提供給經水解普伐他汀四醇的CS羥基的酰基硫酯；和SEQ ID NO: I所示LovD酰基轉移酶多肽的某變體，所述LovD多肽變體包括在以下氨基酸殘基位置的氨基酸取代A10 ；D12 ；K26 ；C40 ；C60 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334和/或L361 ;然后允許所述LovD多肽變體利用來自酰基硫酯的酰基來區域選擇性酰化經水解普伐他汀四醇的CS羥基；從而制得胡伐他汀。本發明的相關實施方式是物質組合物，其包含經水解的普伐他汀四醇；在LovD酰基轉移酶存在下將酰基部分提供給經水解普伐他汀四醇的C8羥基的酰基硫酯；SEQ ID NO: I所示LovD酰基轉移酶多肽的某變體，所述LovD多肽變體包括在以下氨基酸殘基位置的氨基酸取代A10，D12，K26，C40，C60，A86, A190, H161, K227, G275，V334和/或L361 ;以及胡伐他汀。可選該LovD多肽變體包含氨基酸取代D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和 G275S ;D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ；G275S 和 V334F。本發明的某些實施方式中，可將其它組分和/或方法步驟與上述的一種或多種方法和材料聯用。例如，上述方法還可包含利用高細胞密度發酵來提高用于制備辛伐他汀和/或胡伐他汀的一種或多種LovD酰基轉移酶變體的有效濃度，以及優化發酵條件或提高LovD酰基轉移酶催化效率等。很多其它組分或方法可用于提高辛伐他汀或能促進辛伐他汀和/或胡伐他汀生成的中間體或相關化合物的制備。本發明的實施方式還包括設計用于促進本發明方法的制品和/或試劑盒。此類試劑盒通常包括根據本發明所述方法使用盒中元件的說明。此類試劑盒可包含經區域化的載體用具以在封閉限制件中容納一種或多種容器用具如小瓶、管等，各容器用具包含一種待用于本方法的單獨元件。一種所述容器可包括小瓶，例如含有編碼LovD酰基轉移酶變體的質粒，所述質粒可選在微生物宿主如大腸桿菌或土曲霉中，而另一管瓶含有硫酯化合物或類似物，兩者均可添加至發酵混合物中以產生辛伐他汀和/或胡伐他汀或類似物。下面描述本發明的補充實施方式。附圖簡要說明
圖I.過量表達酰基轉移酶LovD的大腸桿菌菌株用作生物催化劑將紅麴素J (MJ)酸和DMB-S-MMP —步轉化成辛伐他汀。辛伐他汀酸形式將在低pH下自動轉化成內酯形式，而該內酯則在高PH條件下轉化成酸形式。野生型LovD的k-為0.6分鐘 ' 體內實驗顯示大腸桿菌YT2中表達的野生型LovD可在12小時內將15mM MJ酸轉化成辛伐他汀。圖2. (a) SDS-PAGE 凝膠來自大腸桿菌 BL21 (DE3) /pAW31 的 LovD 蛋白(WT) ； (b)分別為LovD蛋白(WT)和A1-A8的天然凝膠，對所有樣品DTT固定為2mM。Al相比WT具有稍低的寡聚體；A3消除了大多數寡聚體；A2、A6和A8與WT非常相似；突變體A4、A5和A7因不穩定性而顯示較少蛋白；A9因為沒有可溶性蛋白而未包括在內。該結果表明只有Cl和C3可引起分子間二硫鍵。圖3.基于從MJ酸和DMB-S-MMP轉化的全細胞生物催化活性(灰色柱)和野生型LovD與突變體間可溶性蛋白表達水平的比較(黑色柱)。對于全細胞活性,將LB培養物濃縮10倍以模擬高密度發酵，用15mM MJ酸和18mM DMB-S-MMP比較轉化。采用基于8小時的轉化來比較野生型LovD和突變體間的全細胞活性。野生型LovD轉化歸一化至100%，數據點為兩次的均值。對于蛋白表達水平試驗，從50ml LB培養物中表達蛋白并用Ni-NTA柱純化。通過Bradford法測定濃度。也將野生型LovD表達水平歸一化至100%。突變體的全細胞活性與可溶表達的蛋白質成比例，因此溶解度可能是影響全細胞活性的唯一原因。圖4.含第一或第三半胱氨酸改變的突變體與野生型LovD之間基于8小時轉化的全細胞LovD活性。野生型LovD轉化歸一化至100%，數據點為兩次的均值。Al顯示轉化高于其它在第一半胱氨酸位置處的突變體，而N3則在第三半胱氨酸位置中最高。Al和N3都顯示全細胞活性比野生型高 25%。圖5.辛伐他汀轉化隨著時間變化。試驗條件同前。YT2/A1N3( )結合了 Al和N3的益處，是最快的突變體，轉化在8小時內完成。YT2/A1和YT2/N3在10小時內完成反應，YT2/A1的轉化稍高于YT2/N3。YT2/pAW31是野生型，其在12小時內轉化15mM MJ酸。全細胞活性更高導致反應時間更短。與野生型相比，YT2/A1和YT2/N3都將時間縮短 20%，而YT2/A1N3將時間縮短 50%。圖6. YT2/pAW31和YT2/A1N的高細胞密度發酵。對這兩個菌株，先將細胞在37° C生長至OD6tltl約為20，然后將溫度降至25° C并添加500iU IMIPTG以誘導蛋白質表達。蛋白表達 12小時后，停止葡萄糖補料，pH調至7. 8，緩慢添加15g MJ酸和15ml DMB-S-MMP以開始轉化。用HPLC檢查轉化，一旦反應完成或恒定，即終止反應。通過下游純化方法回收辛伐他汀。添加底物后細胞密度的極大下降可通過緩慢添加底物降至最小。轉化速率最初保持恒定，隨時間延長可能LovD蛋白被滅活而緩慢下降。 圖7.由LovD催化的反應。LovD負責將MJA經a -S-甲基丁酸側鏈的酰化轉化成LVA，且還可用DMB-SMMP作為酰基供體合成SVA。圖8. LovD的晶體結構及其與EstB的關系。(A) LovD與EstB之間基于結構的序列比對。在序列上方顯示指定自LovD結構的二級結構元件。顏色從N末端處的藍色過渡到C末端處的紅色。EstB中的活性位點殘基由氨基酸下方的星號標出。⑶顯示G5’-LVA復合體的帶狀圖。(C)LovD的結構。綠色突出顯示EstB中非保守的區段。投射在活性位點周圍的5個環如同接球手手套中的手指。(D)EstB的結構。紅紫色突出顯示LovD中非保守的區段。(E) LovD和EstB結構的重疊圖。注意到LovD上缺失了 EstB中覆蓋活性位點的一 個環(殘基244_260)。圖9. LovD作為辛伐他汀合成酶的定向進化。(A)用基于瓊脂擴散的試驗在全細胞活性試驗中定量SVA的量。在點樣反應混合物前將粗糙鏈孢霉(N. crassa)包埋在瓊脂中。編號(1-8)表示添加MJA和DMB-SMMP至表達野生型LovD的大腸桿菌后的不同孵育時間2. 5，4，5. 5，7，8，9，10，12小時。(B) LovD突變體向更高全細胞活性的定向進化。共有7代LovD突變體。4代源自隨機誘變，包括Gl, G2. 1，G2. 2，G4. 1，G4. 2和G6。包括G3和G5的2代源自前代突變體的有益突變。G7通過G6在V334和L361位置的飽和誘變衍生得到。含2個氨基酸變化的所有突變體進行定點突變以確定有益或有害突變(G2. I、G4. I和G4. 2)。(X)表明突變體具有比前代降低的全細胞活性。(V )表明突變體具有比前代更高的全細胞活性。

圖10. G5突變體的結構提供對于改善催化的認識。在有改善突變體G5中存在的氨基酸變化位置，突出了其通常離活性位點距離遠。距離是從氨基酸a碳到LVA的親核性羥基(C8)。圖11. 5種LovD結構重疊的側視圖。該圖表明兩個結構域間由于G5突變和存在結合鍵而有鉸鏈旋轉。(A)可穩定鉸鏈閉合的兩個重要殘基(Val86和Leul34)顯示為球體。(B)另2個殘基(Val334和Asp320)彼此直接接觸。G6中的V334D突變可導致Asp334和Asp320間的靜電推斥，而G7中的V334F突變可導致苯基側鏈和Asp320間的空間位阻。兩者都能穩定鉸鏈的閉合。圖12.比較結合不同配體的LovD活性位點。(A)G5與底物MJA復合。(B)G5’與產物LVA復合。(C) G5’與產物SVA復合。(D) 3種結構的重疊顯示構型變化，特別是在親核性絲氨酸處，與結合不同配體相關聯。虛線代表氫鍵。活性位點入口在各圖的頂部。一些參與配體結合的殘基未顯示。圖13.為了仔細研究引起全細胞活性增加的原因，鑒定并列舉了所有改良突變體的動力學參數(keat，Km)、可溶蛋白水平與熱穩定性。將LovD突變體的全細胞活性與GO比較，GO的轉化速率為I. 7mM/小時，并標準化至I。tMJA的Km于25°C在DMB-SMMP固定在2mM時獲得。$ DMB-SMMP的Km在MJA固定于2mM時獲得。§可溶蛋白的量從純化的蛋白水平測定。TTm由圓二色性測量。所有結果表示三次測定的均值土SD。圖14. LovD GO和突變體的全細胞活性。在25°C下，GO以每小時 I. 7mM的速率產生SVA。在32°C下，GO, Gl, G2. 1，G2. 2和G3未顯示任何活性。在25°C下，G7顯示活性比野生型稍高。在37°C下，只有G7保持每小時 0. 4mM SVA的殘余活性。圖15. LovD突變體的動力學特征。LovD突變體的轉換率，針對利用DMB-SMMP為底物生物合成SVA( ，藍線，keat于左y軸)，利用MB-SMMP( ■，粉線，kcat于左y軸)或LovF( ▲，紅線，表觀轉換率于右Y軸)為底物生物合成LVA。圖16. LovD G5’結合于LVA和MJA0 (A) LovD的結構，從N-末端(藍色)到C-末端(紅色)的二級結構元件，以及Lo vD 二級結構的拓撲圖(箭頭表示￠-片層，長方形表示a -螺旋)。LVA顯示為灰色棒形。(B)通向LovD活性位點的帶正電通道和帶正電脊(圈示區域)可與LovF的ACP結構域和pPant臂相互作用。(C)疏水和芳族氨基酸參與MJA結合口袋。圖17.與突變相關關鍵殘基和在結合配體后的移動(A)迭合GO-Semet、G5和G5-MJA的大結構域(殘基14-92和204-405)以表示與MJA相互作用的一些關鍵殘基的移動。自GO-Semet到G5的結構域轉動關閉Argl73的胍基和MJA的C15羧基之間的缺口，這有利于結合MJA。在G5中Phel48和Tyrl88也更靠近MJA。(B) LovD活性位點中LVA和SVA結合之間的區別。在SVA中添加額外的a-甲基通過接觸Phel48產生結構域間的鉸鏈開□。圖18就G5中有益突變提出的機制。(A) K26E突變可能通過打散螺旋A表面上成片帶正電殘基(R22、K23、K26和R28)來改善酶穩定性。該片區在GO-Semet和G5中都圈出以突出顯示。(B)G275S突變看來通過添加螺旋I上S278的氫鍵改善酶的穩定性。圖19. LovD的催化殘基和提出的LVA生物合成機制。(A)提出的參與LovD反應的殘基。(B)LovD(灰色)和EstB(紫紅色)之間活性位點殘基的迭合。(C)利用MJA和MB-LovF ACP為底物生物合成LVA。Ser76起催化親核體的作用來催化酯交換反應。Ser76和MJA (C8)的羥基被Tyrl88脫質子化，Tyrl88由Lys79穩定化。圖20. X-射線數據采集和原子精修的統計(括號內數字指數據的邊界)。
=E |I_〈I>|2/E I2，其中I是觀察的強度。兩項求和都包括所有輸入反射，對超過一種對稱等價物取平均。Rut=E If0I-IfcI I/ E |f。!，其中F。和F。分別指觀察到和計算所得結構因子。Riis類似于R工#，但基于反射的子集，該子集被保留不用于精密化以供交叉驗證(Brunger, A. T. (1992) Nature, 355，472-474)。縮寫 R. M. S.表示均方根值。
具體實施例方式本文所述或所引用的技術和過程通常已充分了解并常采用本領域技術人員的常規方法，例如，Ausubel等在威利科學出版社(Wiley Interscience Publishers) 1995年的Current Protocols in Molecular Biology (《最新分子生物學方法》)中描述的廣泛應用的分子克隆方法。適用時，除非另有說明，涉及使用市售可得的試劑盒和試劑的過程通常按生產商給出的方案和/或參數進行。除非另外定義，本文使用的所有術語、符號和其它科學術語旨在具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的相同含義。在一些情況中，本文出于清楚和/或便于引用對具有常規理解含義的術語加以限定，本文中包括此類限定不應理解為表示與本領域常規理解的顯著區別。描述適用于本文所公開發明實施方式的方法和材料的公開內容包括，例如，國際
發明者唐奕, 謝新開, 高雪 申請人:加利福尼亞大學董事會