通過酵母生產(chǎn)非酵母的甾醇的制作方法

專利名稱：通過酵母生產(chǎn)非酵母的甾醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在酵母中例如Saccharomyces cerevisiae中生產(chǎn)甾醇,所述甾醇包括7-脫氫膽固醇、25-羥基-7-脫氫膽固醇和25-羥基麥角留醇。本發(fā)明還涉及在酵母中催化酵母留醇、膽留_7，24-二烯醇和膽留-5，7，24-三烯醇的24位置上的雙鍵還原；催化麥角甾醇、7-脫氫膽固醇、膽留-8-烯醇和膽留-7-烯醇的25位置上的羥基化的多種酶。本發(fā)明還涉及編碼膽固醇C25-羥化酶和留醇Λ 24-還原酶的多種核酸以及它們用來生產(chǎn)并羥基化7-脫氫膽固醇或麥角留醇的用途。本發(fā)明還涉及這樣產(chǎn)生的酵母菌株和制造這些甾醇的方法，所述方法包括培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞和收獲產(chǎn)生的留醇(多種)的步驟。
背景技術(shù)：
酵母中的留醇途徑包括許多步驟。酵母留醇途徑的圖表在

圖14中列出且下面參考它討論現(xiàn)有技術(shù)。US 5，460, 949 (Amoco)教導(dǎo)了用于增加角鯊烯和三烯醇在酵母中中累積的方法和組合物。該方法包括在其中基因ERG5和ERG6被失活的菌株中HMGl (調(diào)節(jié)該途徑的單一的最重要的酶)的截短和過表達(dá)。ERG5和ERG6編碼兩種酶活性，所述兩種酶活性區(qū)別麥角甾醇(酵母和真菌的主要留醇)生物合成與膽固醇生物合成。這些菌株優(yōu)選地累積膽甾_5，7，24-三烯醇，其通常是膽固醇生物合成的中間產(chǎn)物。W003/064650 (Lang等人)(US2006/0240508)公開了在酵母中生產(chǎn)7-脫氫膽固醇和/或生物合成中間產(chǎn)物或隨后的產(chǎn)物的方法。這里，來自小鼠和人的C-8留醇異構(gòu)酶、C-5甾醇去飽和酶和甾醇Λ 24-還原酶的基因在其中ERG5和ERG6被失活并且HMGl基因被截短并過表達(dá)的酵母菌株中表達(dá)。這些酵母能合成7-脫氫膽固醇。W003/064652 (Lang 等人)(US2006/0088903)公開了通過增加羊毛甾醇-C14-脫甲基酶活性(ERGll)，在轉(zhuǎn)基因的酵母中生產(chǎn)酵母留醇和/或生物合成中間產(chǎn)物和/或其隨后的產(chǎn)物的方法。WO 2005/121315(Aventis)教導(dǎo)了膽固醇-生產(chǎn)酵母菌株及其用途。來自Arabidopsis thaliana的甾醇Δ 7還原酶基因和人甾醇Δ 24-還原酶基因被引進(jìn)其中ERG6被失活和在一些情況下ERG5被失活的酵母宿主菌株中。新菌株能生產(chǎn)與其他中間產(chǎn)物混合的膽固醇。US 6，562，609 (Russel等人)教導(dǎo)了經(jīng)分離人和小鼠膽固醇C25-羥化酶和基因?，F(xiàn)有技術(shù)關(guān)于使用轉(zhuǎn)基因的酵母生產(chǎn)25-羥基維生素原D3或25-羥基維生素原D2沒有記載。發(fā)明詳沭 根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，膽固醇C25-羥化酶(其底物通常是膽固醇)可對(duì)7-脫氫膽固醇和麥角留醇起作用，以分別生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇和25-羥基麥角甾醇。因而，本發(fā)明的一個(gè)方面是使用脊椎動(dòng)物膽固醇C25-羥化酶來羥基化7-脫氫膽固醇或麥角留醇以分別生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇(也被稱為25-羥基維生素原D3)或25-羥基麥角留醇(也被稱為25-羥基維生素原D2)。膽固醇C25-羥化酶不是天然存在于酵母中的酶；事實(shí)上酵母通常不具有使可能在酵母中存在的7-脫氫膽固醇的側(cè)鏈羥基化的能力。但是，根據(jù)本發(fā)明，可制得遺傳改良的酵母，通過下述方法將膽留_5，7，24-三烯醇轉(zhuǎn)化為25-羥基-7-脫氫膽固醇(25-羥基維生素原D3)提供具有編碼膽固醇C25-羥化酶的核酸的酵母并在使得酵母羥基化7-脫氫膽固醇的條件下培養(yǎng)酵母，借以生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇(25-羥基維生素原D3)。在上述方法中，下述是優(yōu)選的，酵母已使基因ERG5和ERG6失活且所述酵母還已被提供有編碼編碼脊椎動(dòng)物留醇Λ24-還原酶的核酸，所述脊椎動(dòng)物留醇Λ24-還原酶酶已針對(duì)酵母中的表達(dá)被優(yōu)化。還已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，可制得遺傳改良的酵母，通過下述方法將麥角留醇轉(zhuǎn)化為25-羥基麥角甾醇(也稱為25-羥基維生素原D2)提供具有編碼膽固醇C25-羥化酶的核酸的酵母并在使得酵母羥基化麥角留醇的條件下培養(yǎng)酵母，借以生產(chǎn)25-羥基麥角留醇(25-羥基維生素原D2)。附圖簡(jiǎn)沭在下述圖中，使用了這些縮寫詞TDH3p是TDH3啟動(dòng)子區(qū)(來自S. cerevisiae的甘油醛_3_磷酸脫氫酶同工酶3)；Ori-pBR 是來自 E. coll 的 pBR322 的 ColEl 復(fù)制起點(diǎn)；bla是在E. coli中賦予氨芐西林抗性的β _內(nèi)酰胺酶基因；2 μ是攜帶S. cerevisiae的復(fù)制起點(diǎn)的2 μ多拷貝載體的大的片段；PGKlt是PGKl (來自S. cerevisiae的3_磷酸甘油酯激酶)的終止子區(qū)；URA3是針對(duì)尿嘧啶的S. cerevisiae URA3營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記；Bam HI.Eco RI.Hin dIII、Bgl II,Age I是指對(duì)應(yīng)的限制性酶的限制性位點(diǎn)；在載體上的位點(diǎn)的定位從唯一的Bam HI位點(diǎn)的位置I開始以括號(hào)表示。圖I :質(zhì)粒 V51TDH-S24R1 的限制性圖譜。S24R-1 是編碼來自 Rattus norvegicus的推定甾醇Λ 24-還原酶的合成基因S24R1 ；圖2 :質(zhì)粒V51TDH-S24R2的限制性圖譜。S24R-2是編碼來自Danio rerio的推定甾醇Λ 24-還原酶的合成基因S24R2。圖3 :質(zhì)粒pFLAde_S24Rl的限制性圖譜。S24R1是編碼來自R. norvegicus的推定甾醇Λ 24-還原酶的合成基因S24R1 ;ARS_CEN是S. cerevisiae的著絲粒自主復(fù)制起點(diǎn)；ADE2 是 S. cerevisiaeADE2 基因。圖4 :質(zhì)粒 V51-C25H1 的限制性圖譜。GALp 代表 GALIO-CYCI (Guarente et al.，1982)半乳糖可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子區(qū)；C25H-1是編碼來自Sus scrofa的推定膽固醇C25-羥化酶的合成基因C25H1。圖5 :質(zhì)粒 V51-C25H3 的限制性圖譜。GALp 代表 GALIO-CYCI (Guarente et al.，1982)半乳糖可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子區(qū)；C25H-3是編碼來自Canis familiar is的推定膽固醇C25-羥化酶的合成基因C25H3 ；、
用如在實(shí)施例8中描述的制得的甾醇提取物，如實(shí)施例9中描述的，記錄在UV282nm下的所有HPLC圖譜?？s寫詞
C5，7，22，24 =膽甾 5,7,22,24-四烯醇；C5，7，24 =膽甾 5，7，24-三烯醇;C5，7，22 =膽甾 5，7，22_ 三烯醇;C5，7 =膽甾5，7- 二烯醇或7_脫氫膽固醇；250H-C5, 7_Ac = 25-羥基7_脫氫膽固醇乙酸酯；250H-E5，7，22_Ac :25-羥基麥角甾醇乙酸酯；E5，7，22，24 :麥角甾 5，7，22，24-四烯醇；E5，7，22 :麥角甾5，7，22-三烯醇(麥角甾醇)。圖6 :來自表達(dá)推定甾醇C-24甾醇還原酶的菌株的甾醇提取物的HPLC洗脫圖。使用了下述菌株A ERT/V51TDH 對(duì)照；BERT/V51TDH-S24R1 ；CERT/V51TDH-S24R2 ；D :ERT/pFLAde-S24Rl。圖7 :來自表達(dá)推定膽固醇C25-羥化酶的erg6突變體的留醇提取物的HPLC洗脫圖。使用了下述菌株CERT/pFLAde-S24Rl/V51 ；DERT/pFLAde-S24Rl/V51-C25Hl ；EERT/pFLAde-S24Rl/V51-C25H3.標(biāo)準(zhǔn)物為A,膽甾5,7-二烯醇(7-脫氫膽固醇,購自Sigma-Aldrich, St. Louis,MO 63103，USA) ;B，25_羥基7-脫氫膽固醇乙酸酯(如實(shí)施例9中描述的制備)。圖8 :來自表達(dá)推定膽固醇C25-羥化酶的erg6突變體菌株的單峰的UV光譜。針對(duì)下述峰，如實(shí)施例9中描述的在HPLC期間使用PDA檢測(cè)器在線測(cè)定在205和300nm之間UV光譜A :在11. 8min下的7_脫氫膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物峰(圖7，譜圖A)；B :在8. 5min下的25-羥基7_脫氫膽固醇乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)物峰(圖7譜圖B);C :在 8. 5min 下的 ERT/pFLAde-S24Rl/V51_C25Hl 峰(圖 7，譜圖 D)。圖9 :來自表達(dá)推定膽固醇C25-輕化酶的erg6突變體菌株的單峰的質(zhì)譜圖。對(duì)下述峰，如實(shí)施例9中描述的,在HPLC期間,用MicroMass ZQ檢測(cè)器,在線測(cè)定來自m/z =350至450的質(zhì)量碎裂譜圖A : 11. 8min下的7_脫氫膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物峰(圖7，譜圖A)；B :在8. 5min下的25-羥基7_脫氫膽固醇乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)物峰(圖7，譜圖B);C :在 8. 5min 下的 ERT/pFLAde-S24Rl/V51_C25Hl 峰(圖 7，譜圖 D)。圖10 :來自表達(dá)推定膽固醇C25-羥化酶的ERG6野生型菌株的留醇提取物的HPLC洗脫圖。使用了下述菌株B W303/V51 ；
CW303/V51-C25H1 ；DW303/V51-C25H3o標(biāo)準(zhǔn)物為A，麥角甾醇(麥角甾5，7，22-三烯醇)，購自Sigma-Aldrich，St. Louis, MO 63103，USA。圖11 :來自表達(dá)推定膽固醇C25-羥化酶的ERG6野生型菌株的單峰的UV光譜。針對(duì)下述峰，如實(shí)施例9中描述的，在HPLC期間，用PDA檢測(cè)器，在線測(cè)定在205和300nm之間的UV光譜 A :在11. 9min下的麥角留醇標(biāo)準(zhǔn)物峰(圖10，譜圖A)；B :在 10. Omin 下的 W303/V51-C25H1 峰(圖 10，譜圖 C)；C :在 8. 7min 下的 W303/V51-C25H1 峰(圖 10，譜圖 C) ·圖12 :來自表達(dá)推定膽固醇C25-羥化酶的ERG6野生型菌株的單峰的質(zhì)譜圖。針對(duì)下述峰，如實(shí)施例9中描述的，在HPLC期間，用MicroMass ZQ檢測(cè)器從m/z = 350至450測(cè)定質(zhì)量碎裂譜圖A :在11. 9min下的麥角留醇標(biāo)準(zhǔn)物峰(圖10，譜圖A)；B :在 10. Omin 下的 W303/V51-C25H1 峰(圖 10，譜圖 C)；C :在 8. 7min 下的 W303/V51-C25H1 峰(圖 10，譜圖 C) ·圖13 :較之其中ERG6被失活的酵母(膽甾-型甾醇)，野生型酵母(麥角型甾醇)的甾醇生物合成途徑的晚期部分。酶以斜體字突出顯示。實(shí)箭頭代表在野生型酵母中發(fā)現(xiàn)的酶反應(yīng)。虛箭頭對(duì)應(yīng)通過異源活性(推定的留醇Λ24-還原酶，推定的膽固醇C25-羥化酶)催化的步驟，對(duì)應(yīng)的酶加下劃線。圖14 :是酵母甾醇途徑圖。圖15 :是通過10種不同的25-羥化酶基因?qū)?-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為25-羥基-7-脫氫膽固醇(HyDHC)的比較。含有如在實(shí)施例2中描述的經(jīng)優(yōu)化的來自豬的25-羥化酶的S. cerevisiae菌株Ecab HY (具有SEQ. ID. NO :26的基因的的整合構(gòu)建體)、Ecab opt2. O (具有SEQ. ID. NO 25的基因的整合構(gòu)建體)、Ptro opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 19的基因的整合構(gòu)建體)、Ptro HY(具有SEQ. ID. NO :20的基因的整合構(gòu)建體)、ConHyD HY(具有的SEQ. ID. NO 31的基因的整合構(gòu)建體)、ConHyD opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 30的基因的整合構(gòu)建體)、Rnor HY (具有SEQ. ID. NO 23的基因的整合構(gòu)建體)、Rnor opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 22的基因的整合構(gòu)建體)、Sscr HY (具有SEQ. ID. NO 28的基因的整合構(gòu)建體)、Sscr opt 2. O (具有SEQ. ID. NO 27的基因的整合構(gòu)建體)和Scr Pompon,如實(shí)施例20中描述的進(jìn)行培養(yǎng)。甾醇從細(xì)胞球團(tuán)中分離出并且總甾醇的HyDHC含量、HyDHC比例以及7-DHC向HyDHC的轉(zhuǎn)化與通過整合25-羥化酶C25H1獲得的值比較。所有的新羥化酶基因被表達(dá)并且所述基因的基因產(chǎn)物能將7-DHC羥基化為HyDHC。定義說明書和權(quán)利要求通篇中，應(yīng)用了下述定義“酵母”指Saccharomyces cerevisiae,以及適于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的其他酵母,例如 Schizosaccharomyces spp.、Pichia spp、Klyuveromyces spp.、Hansenula spp.和Yarrowia Iipolytica0雜交的“標(biāo)準(zhǔn)條件”在本發(fā)明的上下文中表示下述條件，所述條件通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員用于檢測(cè)特異性雜交信號(hào)并且描述于例如Sambrook et al. , " MolecularCloning" , second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989,New York(其通過引用被并入本文)中?！皣?yán)格雜交條件”的例子是在下述溶液中于42°C下過夜孵育(例如15個(gè)小時(shí))后在O. Ix SSC中于約65°C下洗滌雜交支持物，所述溶液含有50%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7·6)、5χ Denhardt; s溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml經(jīng)變性、剪切的鮭精DNA。如本領(lǐng)域中已知的，術(shù)語“ ％同一性”表示多肽或多核苷酸序列之間的相關(guān)程度，視情況而定，如通過此類序列的字符串(strings)之間的匹配測(cè)定的?！巴恍浴笨梢酝ㄟ^已知方法容易地確定，例如，使用下述參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分8，缺口延伸罰分2(缺省參數(shù))用程序 BESTFIT (GCG Wiscon sin Package, version 10. 2, Accelrys Inc. , 9685 ScrantonRoad, San Diego, CA 92121—3752，USA)來確定。“功能性”酶表示在典型的酵母培養(yǎng)條件下，酶在酵母內(nèi)實(shí)現(xiàn)期望的活性。例如，"功能性膽固醇C25-羥化酶"表示酵母細(xì)胞體內(nèi)，膽固醇C25-羥化酶將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為25-羥基-7-脫氫膽固醇?！肮δ苄浴焙怂嵝蛄斜硎竞怂嵝蛄邪ū匾男蛄?除了編碼多肽的那些外)，以便酵母以一定的濃度表達(dá)多肽至它發(fā)揮作用的地方。此類序列可包括啟動(dòng)子、終止序列，增強(qiáng)子等等。3曰固醇25-羥化酶本發(fā)明的一個(gè)方面因而是在酵母細(xì)胞中生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇或25-羥基麥角留醇的方法，所述方法包括使7-脫氫膽固醇或麥角留醇與膽固醇C25-羥化酶接觸并獲得25-羥基-7-脫氫膽固醇或25-羥基麥角留醇。優(yōu)選地膽固醇C25-羥化酶是來自脊椎動(dòng)物來源，更優(yōu)選地來自大鼠、豬、狗、馬、人、黑猩猩、Macaca mulata、小鼠、Gallusgallus、Xenopus laevis、Danio rerio 或 Ornithorynchus anatinus 的酶。另夕卜，可以使用這些天然酶的衍生物，即其中氨基酸序列不再與天然酶相同的那些酶，只要它們保留它們起作用的能力即可。例如，本發(fā)明包括下述酶的用途，所述酶與天然脊椎動(dòng)物C25-羥化酶共有至少90%同一性和優(yōu)選地具有至少95%同一性和更有優(yōu)選地具有至少99%同一性的那些酶，條件是衍生酶保留其功能。類似地，可被用在本發(fā)明中的核酸是編碼上述肽序列的那些和在嚴(yán)格條件下與編碼上述肽序列的那些核酸雜交的核酸。優(yōu)選地它們是經(jīng)分離的。另外，在一些實(shí)施方式中，編碼C25-羥化酶酶的核酸是已經(jīng)密碼子優(yōu)化的，以更好地適于酵母環(huán)境。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸來自豬、大鼠、狗、黑猩猩或馬并且已針對(duì)酵母經(jīng)密碼子優(yōu)化。特別優(yōu)選的核酸是這樣的核酸已經(jīng)密碼子優(yōu)化使得它們至少在酵母宿主中表達(dá)的那些以及參考核酸序列“Sscr Pompon SEQ ID NO :5”,更優(yōu)選地核酸序列比“Sscr Pompon”更好地被表達(dá)。核酸優(yōu)選地是DNAs。特別優(yōu)選的核酸是被命名為下述的那些C25H1 (基于豬羥化酶；SEQ. ID NO 5),C25H3 (基于狗羥化酶SEQ. ID. NO :8)，Ecab_HY 或 Ecab 250H_opt2. O (基于馬羥化酶SEQ ID NOS :25 和 26)，ConHYD opt 20 (SEQ ID NO :30)
Rnor HY(基于大鼠羥化酶 EQ ID NO 23)Sscr HY (SEQ ID NO 28)Sscr opt 20 (SEQ ID NO :27)Sscr Pompon (SEQ ID NO :5)本發(fā)明的另一方面是包含功能性膽固醇C25-羥化酶的酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另外方面是能將-脫氫膽固醇或麥角留醇分別轉(zhuǎn)化為25-羥基7-脫氫膽固醇或25-羥基麥角甾醇的酵母本發(fā)明的另外方面是在酵母中生產(chǎn)25-羥基7-脫氫膽固醇的方法，所述方法包括在容許羥基化反應(yīng)發(fā)生的條件下，存在7-脫氫膽固醇時(shí)，允許脊椎動(dòng)物膽固醇C25-羥化酶的表達(dá)，導(dǎo)致25-羥基7-脫氫膽固醇的生產(chǎn)。本發(fā)明的其他方面是在酵母中生產(chǎn)25-羥基麥角留醇的方法，所述方法包括在容許羥基化反應(yīng)發(fā)生的條件下，存在麥角留醇時(shí)，允許脊椎動(dòng)物膽固醇C25-羥化酶的表達(dá)，導(dǎo)致25-羥基麥角留醇的生產(chǎn)。表達(dá)載體中存在基因的多拷貝在是優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用了 2-5個(gè)拷貝。用于將任何上面提到的基因克隆進(jìn)酵母宿主的載體可以是已知用于克隆的任何類型的載體，特別是攜帶C25-羥化酶基因和相關(guān)的表達(dá)和/或整合序列(包括本領(lǐng)域中常用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)的質(zhì)粒和著絲粒質(zhì)粒，并且這些載體構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。在能生產(chǎn)7-脫氫膽固醇的酵母中，例如在US 2006/0242508中描述的酵母中，下述是優(yōu)選的基因ERG5和ERG6被失活且源自脊椎動(dòng)物的留醇Λ 24-還原酶被表達(dá)，例如在下文進(jìn)一步描述的那些。而且，在一些情況下，在此類酵母中過表達(dá)HMGl的截短版本是有優(yōu)勢(shì)的。具有失活的ERG5和ERG6且截短的HMGl基因的此類菌株已在本領(lǐng)域中描述過。使用已知的UV光照程序，25-羥基維生素原D3或25-羥基維生素原D2可分接著分別被轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D3或D2、第一代謝產(chǎn)物和維生素D3或D2的循環(huán)形式。25-羥基維生素D3在骨形成中發(fā)揮重要作用并在商業(yè)上在家禽和其他動(dòng)物飼料中用作維生素補(bǔ)充劑，其可以商標(biāo)ROVMIX HY-D 商購自DSM Nutritional Products。25-羥基維生素D2在體內(nèi)顯示了與25-羥基維生素D3相當(dāng)?shù)淖饔貌⑶铱梢灶愃朴?5-羥基維生素D3的使用的方式使用。甾醇Λ 24-還原酶本發(fā)明的另一方面是新穎核酸，所述核酸編碼留醇△ 24-還原酶，所述酶可被酵母表達(dá)并可使選自羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、膽留_7，24-二烯醇或膽留-5，7，24-三烯醇的底物轉(zhuǎn)化為選自3 β -羥基-8-羊毛留-8-烯，4，4- 二甲基-膽甾-8-烯醇、4α-甲基-膽留-8-烯醇、膽留-8-烯醇、膽留-7-烯醇(lathosterol)和7-脫氫膽固醇的產(chǎn)物，條件是核酸序列不是人或小鼠核酸序列。優(yōu)選地，酵母細(xì)胞是其中ERG6和ERG5被失活的酵母細(xì)胞。優(yōu)選地那些核酸是針對(duì)宿主細(xì)胞經(jīng)密碼子優(yōu)化的來自脊椎動(dòng)物來源的經(jīng)修飾的DNAs，條件是所述核酸不是小鼠(mouse)的也不是人的。優(yōu)選地甾醇Δ 24-還原酶來自豬、狗、黑猩猩、Macaca mulata、小鼠，大鼠、馬、Gallus gallus、Xenopus laevis、Danio rerio或Ornithorynchus anatinus。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸是大鼠(Rattus norvegicus)或斑馬魚(Daniorerio)DNAs,且在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，它們已經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在Saccharomycescerevisiae中表達(dá)。特別優(yōu)選的核酸被命名為S24R1 (經(jīng)修飾的大鼠基因，SEQ ID NO I的核苷酸10至1563)和S24R2(經(jīng)修飾的斑馬魚基因，SEQ ID NO 3的核苷酸10至1563)。本發(fā)明另一方面是脊椎動(dòng)物核酸序列，優(yōu)選地DNA，其已經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在酵母宿主中表達(dá)并且其編碼功能性留醇△ 24-還原酶酶，使得在酵母宿主細(xì)胞內(nèi)，所述酶可使羊毛留醇轉(zhuǎn)化為3 β -羥基-8-羊毛留-8-烯，或?qū)⒍谆湍噶舸嫁D(zhuǎn)化為4，4- 二甲基-膽甾-8-烯醇；甲基酵母甾醇轉(zhuǎn)化為4α-甲基-膽甾-8-烯醇；酵母甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾-8-烯醇；膽甾-7，24- 二烯醇轉(zhuǎn)化為膽甾-7-烯醇；或膽留-5，7，24-三烯醇轉(zhuǎn)化為7-脫氫膽固醇；且編碼酶的核酸可在嚴(yán)格條件下與S24R1或S24R2雜交，條件是該脊椎動(dòng)物核酸序列不是分離自人或小鼠的核酸序列。本發(fā)明的另一方面是由上述提到的核酸序列編碼的酶。本發(fā)明的優(yōu)選的酶是如SEQ ID NO. 2和4給出的那些和展示與SEQ ID NO. 2和4至少90%和優(yōu)選地至少95%同一性的那些，其在酵母細(xì)胞環(huán)境內(nèi)還可將羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為3 β -羥基-8-羊毛甾-8-烯，二甲基酵母甾醇轉(zhuǎn)化為4，4-二甲基-膽甾-8-烯醇，甲基酵母甾醇轉(zhuǎn)化為4α-甲基-膽甾-8-烯醇，酵母甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾-8-烯醇，膽甾-7，24- 二烯醇轉(zhuǎn)化為膽甾-7-烯醇，或膽甾-5，7，24-三烯醇轉(zhuǎn)化為7-脫氫膽固醇。本發(fā)明的另一方面是含有如上文所述的功能性核酸序列的酵母宿主，特別是包含S24R1、S24R2或在嚴(yán)格條件下與S24R1、S24R2雜交的核酸序列的酵母宿主例如S. cerevisiae,條件是核酸不是人序列也不是小鼠序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,酵母宿主已使ERG5和ERG6失活；在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，酵母宿主還過表達(dá)HMGl基因的截短版本。還本發(fā)明的另一方面是在酵母細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)3 β -羥基-8-羊毛留-8-烯、4，4- 二甲基-膽留-8-烯醇、4 α -甲基-膽留-8-烯醇、膽留-8-烯醇、膽留-I-烯醇或7_脫氫膽固醇的方法，其包括使羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、膽留_7，24-二烯醇或膽留-5,7,24-三烯醇與下述酵母接觸，所述酵母包含已經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在酵母宿主中表達(dá)并且編碼功能性留醇△ 24-還原酶酶的核酸序列，條件是該核酸序列不是人序列也不是小鼠核酸序列，且所述酵母使 羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為3 β -羥基-8-羊毛甾-8-烯，二甲基酵母甾醇轉(zhuǎn)化為4，4-二甲基-膽甾-8-烯醇，甲基酵母甾醇轉(zhuǎn)化為4 α -甲基-膽甾-8-烯醇，酵母甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾-8-烯醇，膽甾-7，24- 二烯醇轉(zhuǎn)化為膽甾-7-烯醇，或膽留-5，7，24-三烯醇轉(zhuǎn)化為7_脫氫膽固醇。在該方法中，核酸優(yōu)選地是S24R1、S24R2或在嚴(yán)格條件下與S24R1或S24R2雜交的核酸，條件是該脊椎動(dòng)物核酸序列不是人或小鼠核酸序列。
本發(fā)明的另一方面包括載體，所述載體包括質(zhì)粒，所述載體包含已經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在酵母宿主中表達(dá)且編碼功能性留醇△ 24-還原酶酶的功能性核酸序列，條件是該核酸序列不是人序列也不是小鼠核酸序列。優(yōu)選地，載體包含核酸S24R1、S24R2或在嚴(yán)格條件下與S24R1或S24R2雜交的核酸，條件是該脊椎動(dòng)物核酸序列不是人或小鼠核酸序列。載體可包含通常在質(zhì)?；蚱渌d體中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯或整合進(jìn)酵母染色體的通常的序列。某閔構(gòu)律體編碼C25-羥化酶或留醇Λ 24還原酶的本發(fā)明的所有基因構(gòu)建體，典型地是表達(dá)盒的一部分，所述表達(dá)盒典型地具有已知的啟動(dòng)子控制下的外源基因，所述啟動(dòng)子可用標(biāo)準(zhǔn)方法調(diào)節(jié)，啟動(dòng)子例如控制感興趣的基因的ADHl啟動(dòng)子、TEFl啟動(dòng)子、酵母GPD(TDH3)啟動(dòng)子、酵母HXT7啟動(dòng)子、酵母GAL1/10啟動(dòng)子或酵母PGKl啟動(dòng)子。額外地，表達(dá)盒可包含與上文所述的基因的至少一個(gè)的編碼序列可操地連接的上游和下游序列，例如終止子序列和/或其他調(diào)節(jié)元件。使用常規(guī)方法，攜帶本發(fā)明的基因構(gòu)建體的載體可被引進(jìn)酵母中。下述實(shí)施例僅是示例性的，并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本申請(qǐng)通篇引用的所有參考文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用并入本文。
實(shí)施例文獻(xiàn)全部的引用文獻(xiàn)在實(shí)施例的結(jié)尾處刊出。所有的文獻(xiàn)通過引用并入本文。:! 養(yǎng)基:表I :最低培養(yǎng)基的組成
權(quán)利要求
1.酵母，其包含膽固醇C25-羥化酶或編碼膽固醇C25-羥化酶的核酸。
2.膽固醇C25-羥化酶的用途，所述膽固醇C25-羥化酶用來羥基化7-脫氫膽固醇或麥角甾醇，以分別生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇或25-羥基麥角甾醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述生產(chǎn)在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的用途，其中所述酵母細(xì)胞選自由Saccharomycescerevisiae、Pichia spp、Klyuveromyces spp.、Hansenula spp. Schizosaccharomycesspec.和 Yarrowia Iipolytica 組成的組。
5.在經(jīng)遺傳改良的酵母中生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇的方法，其包括 a)使7-脫氫膽固醇與通過所述酵母生產(chǎn)的膽固醇C25-羥化酶接觸， 借以生產(chǎn)25-羥基-7-脫氫膽固醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述酵母不具有有活性的Erg5p和Erg6p酶，并且所述酵母還表達(dá)留醇Λ 24-還原酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述酵母表達(dá)HMGl的截短版本。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，還包括在步驟a)之前 使膽留_5，7，24-三烯醇與包含編碼功能性留醇Λ 24-還原酶酶的核酸序列的酵母接觸， 由此所述酵母使羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、膽留-7，24-二烯醇或膽留-5，7，24-三烯醇分別轉(zhuǎn)化為3β-羥基-8-羊毛留-8-烯，4，4_ 二甲基-膽甾-8-烯醇、4α_甲基-膽留-8-烯醇、膽留-8-烯醇、膽留-7-烯醇或7_脫氫膽固醇。
9.在經(jīng)遺傳改良的酵母中生產(chǎn)25-羥基麥角留醇(25-羥基維生素原D2)的方法，其包括 a)使通過所述酵母生產(chǎn)的麥角留醇與通過所述酵母生產(chǎn)的膽固醇C25-羥化酶接觸， 借以生產(chǎn)25-羥基麥角甾醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述酵母過表達(dá)HMGl的截短版本。
11.編碼膽固醇C25-羥化酶的經(jīng)分離的核酸。
12.包含編碼膽固醇C25-羥化酶的核酸的載體。
13.編碼留醇Λ24-還原酶的經(jīng)分離的核酸，所述酶可被酵母表達(dá)且可使羊毛留醇、二甲基酵母留醇、甲基酵母留醇、酵母留醇、膽留_7，24-二烯醇或膽留-5,7,24-三烯醇轉(zhuǎn)化為3 β -羥基-8-羊毛甾-8-烯，4，4- 二甲基-膽甾-8-烯醇、4 α -甲基-膽甾-8-烯醇、膽甾-8-烯醇、膽留-7-烯醇或7-脫氫膽固醇，條件是所述核酸序列不是人或小鼠核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及在酵母例如Saccharomyces cerevisiae中生產(chǎn)7-脫氫膽固醇、25-羥基-7-脫氫膽固醇和25-羥基麥角甾醇。本發(fā)明還涉及催化羊毛甾醇、二甲基酵母甾醇、甲基酵母甾醇、酵母甾醇、膽甾-7，24-二烯醇、或膽甾-5，7，24-三烯醇的24位置上的雙鍵還原；或催化麥角甾醇、7-脫氫膽固醇、膽甾-8-烯醇、和膽甾-7-烯醇的25位置上的羥基化的多種酶。本發(fā)明還涉及編碼膽固醇C25-羥化酶和甾醇Δ24-還原酶的多種核酸和它們用來生產(chǎn)并羥基化7-脫氫膽固醇或麥角甾醇的用途。本發(fā)明還涉及這樣產(chǎn)生的酵母菌株和制造這些甾醇的方法，所述方法包括培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞的步驟并收獲產(chǎn)生的(一種或多種)甾醇。
文檔編號(hào)C12P33/06GK102639696SQ201080055130
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者丹尼斯·波姆波, 漢斯-彼得·霍曼, 穆里爾·莫卡姆, 馬丁·萊瑪恩 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司