使用二維cDNA文庫的基因表達(dá)解析方法

專利名稱：使用二維cDNA文庫的基因表達(dá)解析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因表達(dá)解析方法。具體而言，涉及由樣品所含的核酸制備CDNA文庫、解析樣品中的基因表達(dá)譜的方法。
背景技術(shù)：
在基因表達(dá)解析中使用如下方法由細(xì)胞群之中取出mRNA，制備互補鏈cDNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等擴(kuò)增該拷貝數(shù)后，使用DNA探針陣列(DNA芯片)，在對應(yīng)的探針位置捕獲靶標(biāo)，檢測熒光。但是，使用PCR擴(kuò)增、DNA芯片的方法定量分析精度低，期待一種精 度高的基因表達(dá)譜分析方法。隨著人類基因組解析的完成，定量研究基因表達(dá)的要求越來越強(qiáng)烈，最近則期待由I個細(xì)胞提取mRNA并進(jìn)行定量分析的方法。定量性好的分析方法是定量PCR，其為如下的方法準(zhǔn)備具有與靶標(biāo)相同的DNA序列的標(biāo)準(zhǔn)試樣，在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熒光探針監(jiān)視擴(kuò)增的進(jìn)行情況并進(jìn)行比較，從而進(jìn)行定量分析。就靶標(biāo)而言，在I個細(xì)胞的情況下，存在的mRNA數(shù)量原本就少，難以進(jìn)行定量分析。此外，為了進(jìn)行多個基因表達(dá)的定量分析，需要將試樣分開，分別獨立地進(jìn)行定量分析。當(dāng)作為對象的基因數(shù)量眾多、含有表達(dá)量少的基因的情況下，還存在由于分開試樣而無法測定的情況。在這樣的狀況下，發(fā)明人等考慮了如下的方法制備將全部mRNA轉(zhuǎn)變成cDNA并將其保持在珠子上的cDNA文庫(含有全部cDNA的cDNA集合體)，并用于定量分析(專利文獻(xiàn)I)。在此，通過重復(fù)利用cDNA文庫，可以去除試樣分開所致的微量表達(dá)基因的計測誤差，能夠準(zhǔn)確計測I個細(xì)胞中所含的多個基因的表達(dá)量。但是，對于活體組織而言，現(xiàn)狀是只存在由多個細(xì)胞取出mRNA并解析的技術(shù)。保持活體組織的二維形狀的形態(tài)下的基因表達(dá)解析，是使用熒光探針監(jiān)視I或2個左右的mRNA來進(jìn)行的?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2007 - 319028號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題對再生醫(yī)療、使用基因的診斷、或生命現(xiàn)象的基本理解而言，不僅重視組織的平均的基因表達(dá)量，而且重視對構(gòu)成組織的每I個細(xì)胞中的基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。為此，希望取出每I個細(xì)胞進(jìn)行解析同時在保持組織的二維信息的形態(tài)下定量監(jiān)視各種基因的表達(dá)量，但現(xiàn)狀卻是沒有較好的方法。在對象基因為I或2個的情況下，能夠利用使用了熒光探針的標(biāo)記觀測組織中的基因表達(dá)，但不可能觀察多個基因的表達(dá)量。通常認(rèn)為，理想的是，在形成二維或三維的結(jié)構(gòu)體的活體組織中，若能在I個細(xì)胞水平下在保持細(xì)胞的位置信息的形態(tài)下計測活動的基因(mRNA)，則能夠詳細(xì)地獲知包括細(xì)胞間的相互作用在內(nèi)的活體內(nèi)發(fā)生的各種現(xiàn)象，對生命科學(xué)領(lǐng)域、尤其是醫(yī)療或藥物開發(fā)領(lǐng)域影響較大。這樣就要求由多個細(xì)胞的平均的信息獲得I個細(xì)胞的信息，掌握生命活動，進(jìn)而并非僅對I個細(xì)胞而是對多個細(xì)胞群中每I個細(xì)胞進(jìn)行分析。解決問題的手段 本發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果開發(fā)了一種方法，其在保持活體組織內(nèi)的二維細(xì)胞分布信息的形態(tài)下，由mRNA制備cDNA文庫，以I個細(xì)胞水平的位置分辨能力，對任意的或作為對象的所有位置的基因表達(dá)量進(jìn)行分析。即，發(fā)現(xiàn)通過制備對應(yīng)于二維地擴(kuò)展的組織內(nèi)的各細(xì)胞或細(xì)胞的部位的cDNA文庫薄片，并將其用于基因表達(dá)解析，能夠解決上述問題。具體而言，本發(fā)明包含以下的(I) (27)。(I) 一種基因表達(dá)譜的解析方法，其特征在于，包括(a)使樣品中的待測核酸與二維地分布且固定在支持體上的核酸探針雜交的步驟，(b)合成具有與待測核酸的序列互補的序列的cDNA，在該支持體上制備二維cDNA文庫的步驟，(C)使用二維cDNA文庫，檢測樣品中的基因表達(dá)的步驟。(2)根據(jù)(I)所述的方法，樣品含有多個細(xì)胞，對每個細(xì)胞解析基因表達(dá)譜。(3)根據(jù)(I)或(2)所述的方法，樣品含有多個細(xì)胞，解析每個細(xì)胞的基因表達(dá)譜，比較細(xì)胞間的基因表達(dá)譜。(4)根據(jù)(I) (3)中任意一項所述的方法，樣品為活體組織樣品，在保存構(gòu)成活體組織樣品的細(xì)胞的二維位置信息的狀態(tài)下，制備二維cDNA文庫。(5)根據(jù)(I) (3)中任意一項所述的方法，樣品為活體組織樣品，在保存構(gòu)成活體組織樣品的細(xì)胞的內(nèi)部的二維位置信息的狀態(tài)下，制備二維cDNA文庫。(6)根據(jù)(4)或(5)所述的方法，活體組織樣品為組織切片樣品，通過使該組織切片樣品中的待測核酸移動到支持體，使其與核酸探針雜交。(7)根據(jù)(6)所述的方法，待測核酸向支持體的移動是通過電泳進(jìn)行的。(8)根據(jù)(I) (7)中任意一項所述的方法，樣品為二維地保持有各個細(xì)胞的陣列。(9)根據(jù)(I) (8)中任意一項所述的方法，待測核酸選自由信使RNA (mRNA)、非編碼RNA (ncRNA)和DNA、以及它們的片段組成的組。(10)根據(jù)(9)所述的方法，待測核酸為mRNA，核酸探針為含有多聚T序列的DNA探針。(11)根據(jù)(I) (10)中任意一項所述的方法，支持體為選自薄片、膜、凝膠薄膜、毛細(xì)管板和珠子組成的組中的至少I種。(12)根據(jù)(I) (11)中任意一項所述的方法，支持體具有二維地劃分而成的多個微細(xì)空間。(13)根據(jù)(12)所述的方法，微細(xì)空間的間隔比細(xì)胞的尺寸更小。(14)根據(jù)(12)或(13)所述的方法，二維cDNA文庫是cDNA被保持在支持體的二維地劃分而成的多個微細(xì)空間中的文庫。(15)根據(jù)(I) (14)中任意一項所述的方法，還包含如下步驟使保持在二維cDNA文庫中的cDNA移動至第2支持體，并使其與二維地分布且固定在第2支持體上的、具有與該cDNA或其片段互補的序列的核酸探針雜交，從而制備第2 二維cDNA文庫。(16)根據(jù)(I) (15)中任意一項所述的方法，還包含如下步驟生成與保持在二維cDNA文庫中的cDNA對應(yīng)的核酸片段，在保持有二維cDNA文庫的二維位置信息的狀態(tài)下，使該核酸片段移動至第2支持體，從而制備第2 二維cDNA文庫。(17)根據(jù)(16)所述的方法，與cDNA對應(yīng)的核酸片段含有cDNA的互補序列。(18)根據(jù)(16)所述的方法，與 cDNA對應(yīng)的核酸片段含有cDNA的互補序列和與cDNA的序列沒有關(guān)聯(lián)的已知序列。(19)根據(jù)(I) (18)中任意一項所述的方法，使對檢測對象的基因為特異性的標(biāo)記核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，基于其標(biāo)記檢測基因表達(dá)。(20)根據(jù)(19)所述的方法，標(biāo)記為熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。(21)根據(jù)(I) (18)中任意一項所述的方法，使對檢測對象的基因為特異性的核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，進(jìn)行該核酸探針中所含的核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)，基于其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測基因表達(dá)。(22)根據(jù)(21)所述的方法，擴(kuò)增反應(yīng)為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。(23)根據(jù)(I) (18)中任意一項所述的方法，使對檢測對象的基因為特異性的核酸鎖式探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交,通過連接反應(yīng)使已雜交的鎖式探針形成環(huán)狀的探針，以該環(huán)狀探針為模板，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)，基于其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測基因表達(dá)。(24)根據(jù)(21) (23)中任意一項所述的方法，利用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。(25)根據(jù)(I) (24)中任意一項所述的方法，重復(fù)使用二維cDNA文庫，進(jìn)行基因表達(dá)的檢測步驟。(26)根據(jù)(I) (25)中任意一項所述的方法，還包含如下步驟比較二維cDNA文庫的基因表達(dá)的檢測結(jié)果和樣品的二維位置信息，獲得樣品中的特定的位置和基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)。(27) —種分子譜的解析方法，其特征在于，其為樣品中所含的分子譜的解析方法，包括(a)使樣品中的待測分子與二維地分布且固定在支持體上的抗體或適體結(jié)合的步驟，(b)利用鄰位連接法，形成對待測分子和抗體的結(jié)合或者待測分子和適體的結(jié)合為特異性的環(huán)探針的步驟，(c)使用上述環(huán)探針或以環(huán)探針為模板而生成的核酸片段，制備二維cDNA文庫的步驟，(d)使用二維cDNA文庫，檢測樣品中的分子的存在的步驟。(28)根據(jù)(27)所述的方法，分子為蛋白質(zhì)。發(fā)明效果本發(fā)明提供一種基因表達(dá)譜的解析方法。本發(fā)明的方法可以將樣品中的基因的表達(dá)與其二維位置信息一起進(jìn)行解析。此外，就本發(fā)明的方法而言，可以將樣品中表達(dá)的基因全部轉(zhuǎn)變成cDNA而制成cDNA文庫，因此能夠簡單且高效地進(jìn)行基因表達(dá)的檢測。因此，本發(fā)明在細(xì)胞功能解析、活體組 織的解析、疾病診斷、藥物開發(fā)等領(lǐng)域中是有用的。尤其是，通過將本發(fā)明用于累積至今的病理切片等，可以進(jìn)行各種疾病的闡明、診斷方法的建立、或藥物開發(fā)等。


圖I是在細(xì)孔陣列薄片中制備二維cDNA文庫的方法的概略圖。圖2是cDNA文庫的制備中使用的反應(yīng)槽的一個例子。圖3是滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)的概略。圖4表不祀標(biāo)序列(序列號I)的一個例子。圖5表不鎖式探針的序列(序列號2)的一個例子。圖6表不共通DNA探針I(yè)的序列(序列號3)的一個例子。圖7表不共通DNA探針I(yè)I的序列(序列號4)的一個例子。圖8是用于進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定的反應(yīng)槽的一個例子。圖9是用于進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定的光學(xué)系統(tǒng)的一個例子。圖10是用于進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定的共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的一個例子。圖11是由組織切片樣品制備cDNA文庫的方法的一個例子。圖12是用于進(jìn)行熒光測定的光學(xué)系統(tǒng)的一個例子。圖13是用于進(jìn)行熒光測定的光學(xué)系統(tǒng)的其它例子。圖14是用于進(jìn)行熒光測定的反應(yīng)槽和光學(xué)系統(tǒng)的一個例子。圖15表示在使環(huán)探針移動至其它檢測用凝膠膜進(jìn)行RCA反應(yīng)時的、細(xì)孔陣列薄片和凝膠膜的剖面。圖16是進(jìn)行熒光測定時的滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)的概略。圖17是用于進(jìn)行熒光測定的基于瞬逝激發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)的一個例子。圖18是在膜中制備cDNA文庫的方法的一個例子。圖19是在珠子上制備cDNA文庫的方法的一個例子。圖20是在珠子上制備cDNA文庫的方法其它例子。圖21是為檢測cDNA文庫中的靶標(biāo)cDNA而使用的探針設(shè)計的一個例子。圖22是用于通過電位計測來測定基因表達(dá)的方法的一個例子。圖23是用于利用鄰位連接法將檢測對象的分子固定在cDNA文庫中進(jìn)行定量的方法的一個例子。圖24是對基因表達(dá)進(jìn)行熒光檢測時的流程圖。圖25是對基因表達(dá)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測時的流程圖。圖26表示進(jìn)行熒光測定時的熒光像的例子和獲得的數(shù)據(jù)例子。膜膜膜
具體實施例方式以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本申請要求2009年12月4日提出的日本專利申請第2009-276883號的優(yōu)先權(quán)，包括上述專利申請的說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。本發(fā)明涉及的基因表達(dá)譜的解析方法包括以下步驟(a)使樣品中的待測核酸與二維地分布且固定在支持體上的核酸探針雜交的步驟，
(b)合成具有與待測核酸的序列互補的序列的cDNA、在該支持體上制備二維cDNA文庫的步驟，(c)使用二維cDNA文庫，檢測樣品中的基因表達(dá)的步驟。本發(fā)明中，“基因表達(dá)譜的解析”是指對樣品(細(xì)胞、組織切片等)中的基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析、對樣品中的基因的表達(dá)分布進(jìn)行分析、獲得樣品中的特定的位置和基因表達(dá)量的相關(guān)數(shù)據(jù)。就樣品而言，只要是來自于欲解析基因表達(dá)譜的活體的樣品即可，沒有特別限定，可以使用細(xì)胞樣品、組織樣品、液體樣品等任意樣品。具體而言，可以列舉出由I個細(xì)胞構(gòu)成的樣品、含有多個細(xì)胞的樣品、組織切片樣品、二維地保持有多個的各個細(xì)胞的陣列形態(tài)的樣品等。此外，作為樣品來源的活體也沒有特別限定，可以使用來自于脊椎動物(例如哺乳類、鳥類、爬行類、魚類、兩棲類等)、無脊椎動物(例如昆蟲、線蟲、甲殼類等)、原生生物、植物、真菌、細(xì)菌、病毒等任意活體的樣品。就本發(fā)明的方法而言，可以是例如樣品含有多個細(xì)胞，對每個細(xì)胞解析基因表達(dá)譜。此外，可以是例如樣品含有多個細(xì)胞，解析每個細(xì)胞的基因表達(dá)譜，比較細(xì)胞間的基因表達(dá)譜。就本發(fā)明的方法而言，優(yōu)選的是，例如樣品為活體組織樣品，在保存構(gòu)成活體組織樣品的細(xì)胞的二維位置信息的狀態(tài)下，制備二維cDNA文庫。或者優(yōu)選樣品為活體組織樣品，在保存構(gòu)成活體組織樣品的細(xì)胞的內(nèi)部的二維位置信息的狀態(tài)下，制備二維cDNA文庫。作為活體組織樣品，可以使用組織切片樣品，通過使該組織切片樣品中的待測核酸移動到支持體，使其與核酸探針雜交。該待測核酸向支持體的移動可以通過例如電泳來進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，作為待測核酸，可以使用信使RNA(mRNA)、非編碼RNA(ncRNA)和DNA、以及它們的片段。例如、可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法提取樣品中所含的核酸而制備待測核酸。例如，使用蛋白酶K之類的蛋白水解酶、硫氰酸胍 鹽酸胍這些離液序列高的(CHA0TR0PIC)鹽、Tween和SDS這些表面活性劑、或市售的細(xì)胞溶解用試劑溶解細(xì)胞，使其中所含的核酸即DNA和RNA溶出。使用mRNA作為待測核酸時，可以在上述通過細(xì)胞溶解而溶出的核酸中，通過DNA分解酶(DNase)分解DNA，獲得僅含RNA作為核酸的試樣。此外，使用的核酸探針只要是能夠與這些待測核酸雜交并捕捉這些待測核酸的探針即可，沒有特別限定，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。例如，當(dāng)待測核酸為mRNA時，優(yōu)選使用含有多聚T序列的DNA探針作為核酸探針。含有多聚T序列的DNA探針、即寡聚(dT)可以通過常規(guī)方法合成，寡聚(dT)的聚合度只要是能夠與mRNA的聚A序列雜交、能夠?qū)RNA捕捉到固定有寡聚(dT)的支持體的聚合度即可。支持體只要是在cDNA文庫的制備中以本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的材料制備而成 的即可，沒有特別限定，例如為薄片、膜、凝膠薄膜、毛細(xì)管板、珠子、薄膜等。作為其材料，可以列舉出例如金、銀、銅、鋁、鎢、鑰、鉻、鉬、鈦、鎳等金屬；不銹鋼、耐蝕耐熱鎳基合金(Hastelloy)、鎳鉻鐵耐熱耐蝕合金(inconel)、蒙乃爾合金、硬招(duralumin)等合金；娃；玻璃、石英玻璃、熔融石英、合成石英、氧化鋁、藍(lán)寶石、陶瓷、鎂橄欖石和感光性玻璃等玻璃材料；聚酯樹脂、聚苯乙烯、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂(丙烯腈-苯乙烯-丁二烯樹脂)、尼龍、丙烯酸樹脂、氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚氨酯樹脂、甲基戊烯樹脂、酚樹脂、密胺樹脂、環(huán)氧樹脂和氯乙烯樹脂等塑料；瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚乙烯醇、硝基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖。例如使用薄片作為支持體時，可以由例如氧化鋁、玻璃等制備薄片。此外，使用凝膠薄膜作為支持體時，例如可以使用丙烯酰胺凝膠、明膠、修飾聚乙二醇、修飾聚乙烯吡咯烷酮、水凝膠等制備凝膠薄膜。使用膜作為支持體時，例如可以使用醋酸纖維素、硝基纖維素或這些的混合膜、尼龍膜等。使用珠子作為支持體時，可以由樹脂材料(聚苯乙烯等)、氧化物(玻璃等)、金屬(鐵等)、瓊脂糖凝膠、和這些的組合等制備珠子在此，為了能夠在保持二維位置信息的狀態(tài)下在二維cDNA文庫中保持cDNA，優(yōu)選支持體具有二維地劃分而成的多個微細(xì)空間。例如，通過在薄片、凝膠薄膜、毛細(xì)管板上設(shè)置細(xì)孔或在如槽等劃分而成的空間中鋪設(shè)珠子，從而能夠設(shè)定這樣的多個微細(xì)空間。這樣的支持體中的微細(xì)空間的間隔優(yōu)選比細(xì)胞的尺寸更小。核酸探針向支持體的固定可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中公知的任意方法進(jìn)行。例如，可以利用共價鍵、離子鍵、物理吸附、生物學(xué)結(jié)合(例如生物素與親和素或鏈霉親和素的結(jié)合、抗原和抗體的結(jié)合等)，將核酸探針固定在支持體的表面、細(xì)孔內(nèi)部、膜的纖維等上。此外還可以介由間隔序列將核酸探針固定在支持體上。介由共價鍵進(jìn)行的核酸探針向支持體的固定，例如可以通過向核酸探針導(dǎo)入官能團(tuán)且在支持體表面導(dǎo)入與該官能團(tuán)具有反應(yīng)性的官能團(tuán)、使兩者反應(yīng)而實施。例如，可以在核酸探針中導(dǎo)入氨基，在支持體中導(dǎo)入活性酯基、環(huán)氧基、醛基、碳二亞胺基、異硫氰酸酯基或異氰酸酯基，從而形成共價鍵。此外，還可以在核酸探針中導(dǎo)入巰基，在支持體中導(dǎo)入活性酯基、馬來酰亞胺基或二硫基。作為在支持體的表面導(dǎo)入官能團(tuán)的方法之一，可以列舉出通過具有期望官能團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑處理支持體的方法。作為偶聯(lián)劑的例子，可以使用Y _氛基丙基二乙氧基娃燒、N-β -(氛基乙基)-Y _氛基丙基二甲氧基娃燒、N-β -(氛基乙基)-β_氨基丙基甲基二甲氧基硅烷等。作為在支持體中導(dǎo)入成為結(jié)合部位的官能團(tuán)的其它方法，可以列舉出等離子體處理。此外，作為通過物理吸附將核酸探針固定在支持體上的方法，可以列舉出利用核酸探針的電荷使其靜電結(jié)合到用聚陽離子(聚賴氨酸、聚烯丙胺、聚乙烯亞胺等)進(jìn)行了表面處理的支持體上的方法等。另外，為了避免其它物質(zhì)(核酸、蛋白質(zhì)等)吸附到支持體上，優(yōu)選對支持體進(jìn)行表面涂布。為了使使樣品中的待測核酸與固定在支持體上的核酸探針雜交，如上所述地提取樣品中的待測核酸，使其與支持體接觸。此時，例如還可以使用如下方法利用核酸的負(fù)電性，對含有待測核酸的樣品和支持體施加電場，通過電泳使待測核酸移動到固定在支持體上的核酸探針附近。雜交反應(yīng)可以通過在樣品中孵育固定有核酸探針的支持體和含有待測核酸的樣品而實施。優(yōu)選該用于雜交的孵育在溫度70°C下在平穩(wěn)的攪拌下進(jìn)行5分鐘左右，然后以O(shè). rc/秒左右緩慢地將溫度降低至室溫。此外，優(yōu)選在雜交反應(yīng)后由支持體洗滌并除去非結(jié)合成分。使待測核酸和核酸探針雜交后，合成具有與待測核酸或其部分序列互補的序列的cDNA。該互補鏈合成可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。例如，在待測核酸為mRNA或ncRNA時，例如可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。此外，在待測核酸為DNA時，例如可以使用聚合酶通過復(fù)制反應(yīng)合成cDNA。合成反應(yīng)之后，使用例如RNase分解除去待測核酸。其結(jié)果是，在支持體上構(gòu)建了由與待測核酸對應(yīng)的cDNA構(gòu)成的二維cDNA文庫。就制備的二維cDNA文庫而言，優(yōu)選的是cDNA保持在支持體的二維地劃分而成的多個微細(xì)空間中。cDNA合成之后，通過對二維cDNA文庫(支持體)實施洗滌、除去的操作，可以除去殘留試劑、例如細(xì)胞溶解試劑和DNA分解酶，可以不妨礙此后基因表達(dá)的檢測步驟的實施。此外，任選地，通過使上述那樣制備的二維cDNA文庫中含有的cDNA移動、或通過生成與二維cDNA文庫中含有的cDNA對應(yīng)的核酸片段，可以將原二維cDNA文庫中含有的cDNA的信息轉(zhuǎn)移至其它二維cDNA文庫。例如，作為使保持在二維cDNA文庫中的cDNA移動至第2支持體的方法，可以使具有與該cDNA或其片段互補的序列的核酸探針二維地分布、固定到第2支持體上，使固定在該第2支持體的核酸探針和保持在原二維cDNA文庫中的cDNA雜交，從而制備第2 二維cDNA文庫。此外，例如在生成與二維cDNA文庫中所含的cDNA對應(yīng)的核酸片段的情況下，可以生成含有該cDNA的互補序列的核酸片段；或與對該cDNA為特異性的核酸探針雜交并將該核酸探針用作核酸片段；或生成含有cDNA的互補序列和與cDNA的序列沒有關(guān)聯(lián)的已知序列的核酸片段。在保持二維cDNA文庫的二維位置信息的狀態(tài)下，使如此生成的核酸片段移動至第2支持體，制備第2 二維cDNA文庫。如上述那樣制備的二維cDNA文庫(也包括第2 二維cDNA文庫)可以在各操作后進(jìn)行洗滌從而重復(fù)使用，可以使用相同的二維cDNA文庫進(jìn)行多次后述的基因表達(dá)的檢測步驟。接著，使用如上述那樣制備的二維cDNA文庫(也包括第2 二維cDNA文庫)檢測樣品中的基因表達(dá)。在本發(fā)明中，“檢測”包含有無基因表達(dá)的檢測、和其表達(dá)量的定量檢測這兩方面。作為用于檢測基因表達(dá)的I個方法，存在如下方法使對檢測對象的基因為特異性的標(biāo)記核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，基于其標(biāo)記檢測基因表達(dá)。就這樣的檢測中使用的核酸探針而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)計。此外，使用的標(biāo)記也可以使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的任意的標(biāo)記，可以列舉例如熒光標(biāo)記(Cy3、異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)等)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(熒光素等)、酶標(biāo)記(過氧化酶、β 一半乳糖苷酶、堿性磷酸酶等)、放射性標(biāo)記(氚、碘125等)。此外，作為其它的方法，存在如下方法使對檢測對象的基因為特異性的核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，對該核酸探針中所含的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，基于其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測基因表達(dá)。作為這樣的擴(kuò)增反應(yīng)，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的任意方法，可以列舉例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(NucleicAcid Sequence-Based Amplification, NASBA)法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)法。此外,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)采用的擴(kuò)增反應(yīng)適當(dāng)設(shè)計所使用的核酸探針。例如，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)作為作為擴(kuò)增反應(yīng)時，可以使對檢測對象的基因為特異性的核酸鎖式探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，通過連接反應(yīng)使已雜交的鎖式探針形成環(huán)狀的探針，以該環(huán)狀探針為模板，進(jìn)行RCA反應(yīng)，基于其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測基因表達(dá)。此外，上述擴(kuò)增反應(yīng)還可以包含在cDNA末端導(dǎo)入重復(fù)序列的程序。
這樣的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的任意方法來檢測。例如，可以給擴(kuò)增反應(yīng)中使用的底物(堿基)添加標(biāo)記，基于其標(biāo)記檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。或者，通過使用能夠與獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的標(biāo)記核酸探針，基于結(jié)合了的核酸探針的標(biāo)記檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。使用的標(biāo)記與上述相同。基于標(biāo)記的檢測可以使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法和儀器來進(jìn)行。例如，熒光標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可以使用適當(dāng)?shù)墓饧ぐl(fā)器進(jìn)行激發(fā)，使用對放出的熒光進(jìn)行計數(shù)的光學(xué)系統(tǒng)、熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀等進(jìn)行檢測和定量。此外，使用酶標(biāo)記時，加入由于酶作用而分解、顯色的底物，通過光學(xué)方式對底物的分解量進(jìn)行測定，從而檢測和定量。使用放射性標(biāo)記時，通過閃爍計數(shù)器等測定放射性標(biāo)記發(fā)出的放射線量。在本發(fā)明的方法中，可以利用熒光或化學(xué)發(fā)光，對獲得的光信號的發(fā)出位置進(jìn)行計數(shù)，從而對基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。此夕卜，作為具體例子，可以基于來自于I個待測核酸的CDNA，如上所述地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入或固定于I μ以下的微細(xì)的反應(yīng)槽中，對熒光或化學(xué)發(fā)光的發(fā)光點進(jìn)行計數(shù)，從而對基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。此外，作為其它的基因表達(dá)檢測方法，還可以使用如下方法使對檢測對象的基因為特異性的核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，接著僅使該核酸探針與固定在電極上的、對該核酸探針為特異性的第2核酸探針雜交，計測基于該雜交的電極的電位變化。在本發(fā)明中，通過比較如上述那樣獲得的二維cDNA文庫中的基因表達(dá)的檢測結(jié)果和樣品的二維位置信息，還能夠獲得樣品中的特定的位置和基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)。這樣的樣品的二維位置信息為例如細(xì)胞樣品或組織切片樣品的顯微鏡像、通過其它標(biāo)記法獲得的熒光像或化學(xué)發(fā)光像等。此外，本發(fā)明的樣品中所含的分子譜的解析方法，包括以下步驟(a)使樣品中的待測分子與二維地分布且固定在支持體上的抗體或適體結(jié)合的步驟，(b)利用鄰位連接法，形成對待測分子和抗體的結(jié)合或者待測分子和適體的結(jié)合為特異性的環(huán)探針的步驟，(C)使用上述環(huán)探針或以環(huán)探針為模板而生成的核酸片段，制備二維cDNA文庫的步驟，(d)使用二維cDNA文庫，檢測樣品中的分子的存在的步驟。代替上述的使樣品中的待測核酸與核酸探針雜交，該方法使樣品中的待測分子與能夠和該待測分子特異性結(jié)合的配體(抗體或適體等)結(jié)合，通過鄰位連接法形成環(huán)探針，從而制備二維cDNA文庫。在本發(fā)明中，作為檢測對象的分子可以列舉出蛋白質(zhì)、肽核酸、高分子(聚合物)、低分子等任意的分子。由于是利用特異性結(jié)合捕捉到支持體上，因此優(yōu)選存在著特異性結(jié)合的配體的待測分子。例如，可以選擇蛋白質(zhì)作為待測分子，選擇抗體或適體作為特異性結(jié)合的配體。使用鄰位連接法制備二維cDNA文庫的細(xì)節(jié)將在實施例8中說明。上述的本發(fā)明的方法，可以對活體組織內(nèi)全部細(xì)胞，將表達(dá)的基因或分子轉(zhuǎn)變成cDNA，在保持細(xì)胞位于組織內(nèi)的位置信息的狀態(tài)下，二維地制備cDNA文庫。因此，可以獲知關(guān)注的任意位置中的基因表達(dá)或所有位置中的基因表達(dá)，能夠使組織之中基因信息如何擴(kuò)展等迄今無法獲得的各種信息可視化。進(jìn)而，將組織切片而制成切片樣品，對各切片制備二維cDNA文庫，研究基因表達(dá)，從而還能夠獲得基因表達(dá)的三維分布信息。這些均與此前的針對少量基因的熒光檢測法不同，能夠簡便且高效地獲得非常眾多的基因的信息。此外，還能夠期待基于利用本發(fā)明獲得的基因表達(dá)譜的解析結(jié)果，獲得基因信息流向、刺激對組織的影響等眾多的新信息。
實施例以下通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。但以下實施例并不限定本發(fā)明。[實施例I]本實施例是如下的例子在細(xì)孔陣列薄片中，由薄片狀的細(xì)胞群，在保持其中所含的mRNA的位置信息的形態(tài)下，構(gòu)建二維cDNA文庫薄片并使用。以下將二維狀地形成了多個細(xì)孔的薄片稱為細(xì)孔陣列薄片，將在其上形成了 cDNA文庫的薄片稱為cDNA文庫薄片。該方法的一個例子的概念圖如圖I所示。該方法由下述程序構(gòu)成在保存細(xì)胞位置信息的狀態(tài)下的mRNA的提取和捕獲至薄片內(nèi)部的DNA探針的程序(圖I的(a));在薄片內(nèi)部利用逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA文庫的程序(圖I的(b));然后作為隨著該程序的基因表達(dá)的計測方法的一個例子，使兩端雜交到靶標(biāo)cDNA的形狀的DNA探針(鎖式探針)雜交到靶標(biāo)cDNA，使用連接反應(yīng)制備環(huán)狀的DNA探針(稱為環(huán)探針)，從而識別靶標(biāo)cDNA的存在的程序(圖I的(c));與環(huán)探針雜交，通過互補鏈合成而擴(kuò)增與環(huán)探針互補的序列，制備特定的序列串聯(lián)地連接的DNA的DNA擴(kuò)增程序(稱為RCA (Rolling Circle Amplification))(圖I的(d));使具有與串聯(lián)地連接的DNA互補的部分序列的熒光探針進(jìn)行雜交，計測熒光的程序，尤其是通過計測發(fā)光的斑點進(jìn)行基因的計數(shù)定量的程序(圖I的(e))。
首先，作為用于制備cDNA文庫的細(xì)孔陣列薄片，使用對氧化鋁進(jìn)行陽極氧化而得的細(xì)孔陣列薄片。這里，對使用了孔徑為200nm、厚度為60 μ m、直徑為25mm的薄片I的例子進(jìn)行說明，但細(xì)孔陣列的薄片的形狀并非限定于此。就這樣的薄片而言，可以通過陽極氧化而自己制作，也可以獲得孔徑為20nm 200nm的薄片的市售品。此外，作為細(xì)孔陣列薄片，還可以使用由多孔玻璃構(gòu)成的整個薄片(monolith sheet)、將毛細(xì)管捆扎切斷而得的毛細(xì)管板、尼龍膜、或凝膠薄膜等。形成于薄片I中的細(xì)孔2貫通了薄片I的厚度方向，細(xì)孔彼此完全獨立。其表面為親水性，蛋白質(zhì)對表面的吸附極少，可以高效進(jìn)行酶反應(yīng)。首先，對細(xì)孔陣列薄片的表面進(jìn)行硅烷偶聯(lián)處理，將DNA探針7固定在細(xì)孔表面。被固定的探針以平均30 IOOnm2中為一個的比例固定在表面，因此在I個孔中固定有4 10X IO6個DNA探針。接著，為了防止表面吸附，用表面涂布劑涂布表面。該表面涂布可以與探針固定同時進(jìn)行。作為探針，使用的是含有25mer以上的多聚T序列的DNA探針。該探針密度為能夠100%捕獲通過該空間的mRNA的DNA探針密度。接著，由細(xì)胞群提取mRNA，在細(xì)孔陣列薄片中制備cDNA文庫。如圖I的(a)所示那樣，將含有用于破壞細(xì)胞膜的裂解液(例如表面活性劑)的凝膠設(shè)置在細(xì)孔陣列薄片的上部。這里，3為樣品的細(xì)胞群(細(xì)胞薄片)，4為含有裂解液的凝膠。接著，使細(xì)胞薄片的上部與含有電解質(zhì)的溶液接觸。當(dāng)然也可以是細(xì)胞直接接觸電解質(zhì)，但也可以通過凝膠等使其接觸。另一方面，細(xì)胞薄片的下部也通過細(xì)孔而與含有電解質(zhì)的溶液接觸，使得能夠?qū)?xì)胞薄片的上下方向外加電場。帶負(fù)電的mRNA5通過細(xì)孔6并向下部電泳，在細(xì)孔6中被DNA探針7捕獲。如圖I的(a)的8所示那樣在細(xì)孔6中捕獲mRNA后，除掉樣品(細(xì)胞薄片)3和凝膠薄片4，較好的方式是，使用由于溫度而發(fā)生相變的凝膠即低融點瓊脂糖凝膠作為凝膠材料，通過升高溫度將其洗去，來進(jìn)行該操作。
接著，以被細(xì)孔中的DNA探針7捕獲的mRNA8為模板合成cDNA9。該操作通過用含有逆轉(zhuǎn)錄酶和合成底物的溶液填滿細(xì)孔部6并緩慢升溫至50°C進(jìn)行50分鐘左右互補鏈合成反應(yīng)而實施。反應(yīng)完成后，使RNase通過細(xì)孔6而流入，將mRNA8分解除去。接著，使含有堿變性劑的液體和洗滌液通過細(xì)孔6流入，除去殘存物和分解物。通過至此為止的程序，在細(xì)孔6內(nèi)構(gòu)建了反映了組織樣品中的細(xì)胞位置的、如圖I的(b)所示的cDNA文庫。予以說明，每I個細(xì)胞的mRNA數(shù)量為約IO6個，將細(xì)胞的尺寸模擬為直徑10 μ m的圓形時，每I個細(xì)胞所使用的細(xì)孔數(shù)量為2500左右。S卩，當(dāng)I個細(xì)胞中表達(dá)的mRNA數(shù)量為1000拷貝以下時，平均I個細(xì)孔內(nèi)能夠為I拷貝的cDNA。多于上述時，對于同一 mRNA種類而言，在I個細(xì)孔中將生成多個拷貝的cDNA。當(dāng)減小細(xì)孔的尺寸時，還能夠使每I個細(xì)孔中各種mRNA為I拷貝以下。(此外，處理每I個細(xì)胞，當(dāng)增大每I個細(xì)胞的cDNA文庫制備區(qū)域時，還能夠使每I個細(xì)胞為I拷貝以下)。各細(xì)孔中平均生成400個各種cDNA。當(dāng)然，通過分解并計測I個細(xì)胞所對應(yīng)的平均2500個細(xì)孔中哪個細(xì)孔中固定有mRNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，從而還能夠計測細(xì)胞內(nèi)的mRNA分布。接著，計測生成的CDNA9。例如，可以利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，對作為靶標(biāo)的cDNA的每個種類制作探針10，將其依次導(dǎo)入細(xì)孔6中，通過熒光檢測或化學(xué)發(fā)光檢測進(jìn)行計測。在本實施例中，公開了使用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和化學(xué)發(fā)光檢測的例子。作為其它方法，還可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、依賴核酸序列的擴(kuò)增法(NASBA)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(LAMP)等擴(kuò)增方法。將使用RCA的情形制成流程圖示于圖24和圖25中。圖24為熒光檢測的情形，圖25為化學(xué)發(fā)光檢測的情形。如圖24所示，在進(jìn)行熒光檢測時，包括如下方法使環(huán)探針從cDNA文庫薄片移入其它檢測薄片，然后進(jìn)行RCA擴(kuò)增，進(jìn)行檢測、定量的方法；不進(jìn)行RCA擴(kuò)增而檢測熒光的方法；以及使用cDNA文庫薄片直接檢測、定量的方法。此時，包括進(jìn)行RCA擴(kuò)增的方法和不進(jìn)行RCA擴(kuò)增的方法。另一方面，在檢測化學(xué)發(fā)光時，如圖25所示，包括如下方法使環(huán)探針從cDNA文庫薄片移入到檢測薄片，進(jìn)行RCA擴(kuò)增反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光檢測此時生成的焦磷酸的方法；在cDNA文庫薄片內(nèi)部進(jìn)行RCA擴(kuò)增反應(yīng)并計測發(fā)光的方法，該方法包括鎖式探針通過特異性的連接而獲得環(huán)探針、然后進(jìn)行RCA擴(kuò)增反應(yīng)的方法，以及使環(huán)探針直接與cDNA特異性雜交進(jìn)行RCA擴(kuò)增反應(yīng)的方法。準(zhǔn)備兩端雜交到各cDNA (靶標(biāo))而形成環(huán)的DNA探針。在本說明書中，將該DNA探針稱為鎖式探針，形成環(huán)后稱為環(huán)探針。在本實施例中，該探針設(shè)計成全長為110個堿基，雜交到每個欲測定基因(靶標(biāo))的部分的序列不同，但內(nèi)部具有20個堿基左右的2個共通序列(共通序列I和II)。首先，將與I號靶標(biāo)基因?qū)?yīng)的DNA探針10裝入細(xì)孔6中，使其與靶標(biāo)cDNA雜交。溶液中含有連接酶(ligase)，雜交后的探針為環(huán)狀(稱為環(huán)探針)(參照圖I的(c)))。升溫使連接酶失活，同時使環(huán)探針由靶標(biāo)CDNA9游離。使游離了的環(huán)探針10通過電泳或送液移動至在細(xì)孔內(nèi)固定了與共通序列I的部分雜交的共通探針I(yè)的其它細(xì)孔陣列薄片(也稱為“檢測用細(xì)孔陣列薄片”)，通過使其與固定在檢測用細(xì)孔陣列薄片內(nèi)的共通DNA探針I(yè)雜交而捕捉環(huán)探針10。本實施例中，制備cDNA文庫后，使用了對欲測定的基因(祀標(biāo))為特異性的DNA探針(鎖式探針)，但當(dāng)在cDNA文庫薄片中進(jìn)行RCA擴(kuò)增時，也可以不使用鎖式探針，而是從最初開始使用環(huán)狀的探針，省略連接的過程，進(jìn)行RCA擴(kuò)增。此外，本實施例中 ，為了個別地對捕獲至細(xì)孔中的DNA產(chǎn)生的信號計測化學(xué)發(fā)光，作為檢測用的細(xì)孔陣列薄片，使用的是對Si進(jìn)行陽極氧化而得的吸收可見光的材料制成的細(xì)孔陣列薄片。接著，將含有具有與共通序列II相同的序列的共通DNA探針I(yè)I、鏈取代型的DNA聚合酶、DNA合成反應(yīng)底物和含有使將焦磷酸變換成ATP的試劑、ATP和熒光素反應(yīng)得到化學(xué)發(fā)光的試劑的反應(yīng)液，在4°C下流入細(xì)孔。接著，洗掉存在于細(xì)孔內(nèi)部以外的酶，用在15°C以下為溶液、在25°C以上無流動性的凝膠即Mebiol凝膠(Mebiol Inc.)包覆薄片的兩面。由此，在抑制來自薄片以外的部分的背景發(fā)光的同時，防止注入的酶流至細(xì)孔外部。當(dāng)設(shè)定為最適合DNA互補鏈合成的溫度37°C時，與靶標(biāo)cDNA雜交了的DNA探針I(yè)開始DNA互補鏈伸長。即使繞環(huán)一周，也由于鏈取代活性而不斷生成重復(fù)序列。圖3的(a)中示意出2個共通序列I和II與cDNA雜交的部分被重復(fù)擴(kuò)增的情形。這里，圖3中的3'末端的箭頭所示的部分為與環(huán)探針雜交的部分。這是RCA的第I步驟。最初，探針I(yè)I不存在應(yīng)雜交的DNA鏈，不發(fā)生DNA互補鏈伸長反應(yīng)，當(dāng)探針I(yè)的DNA鏈伸長進(jìn)行的情況下，互補的序列被該互補鏈制作出來，因此與其雜交，開始互補鏈伸長。如圖3的(b)所示，探針I(yè)I在最初伸長的DNA互補鏈的多個位置開始伸長，在相對地為5'末端側(cè)雜交的探針?biāo)由斓纳扉L鏈，被在更靠近V末端側(cè)雜交并開始伸長的互補鏈逐漸剝離。完全剝離為單鏈的互補鏈被固定在附近的探針I(yè)捕獲，通過互補鏈伸長生成雙鏈。其結(jié)果是形成如圖3的(c)所示的狀態(tài)。實際上這樣的過程平行地重復(fù)發(fā)生。這是RCA的第2步驟。予以說明，在本實施例中從互補鏈合成的最初就加入了探針I(yè)I，但也可以首先使用探針I(yè)進(jìn)行RCA，制備長DNA合成鏈后加入上述試劑，使用探針I(yè)I進(jìn)行互補鏈合成，接著進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。反應(yīng)約45分鐘時，由約110堿基構(gòu)成的靶標(biāo)序列增加至約1000倍。另一方面，以探針I(yè)為起點生成的DNA鏈上雜交約1000個探針I(yè)I,進(jìn)行互補鏈合成,這些反應(yīng)所形成的DNA拷貝數(shù)為約500000拷貝左右。該狀態(tài)的薄片的剖面圖如圖I的(d)所示。該反應(yīng)中生成的焦磷酸分子的數(shù)量為IO8個以上。當(dāng)?shù)孜锍浞謺r，使用了這些焦磷酸的ATP生成反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng)能夠獲得每秒IO8個發(fā)光。即使考慮受光效率和檢測的量子效率等，也是能夠用致冷型CCD相機(jī)等充分檢測的量。另一方面，為了進(jìn)行熒光計測，使用固定在細(xì)孔內(nèi)的探針I(yè)進(jìn)行RCA互補鏈伸長后，將帶有熒光標(biāo)記的探針π(熒光探針)導(dǎo)入細(xì)孔內(nèi)，與RCA產(chǎn)物雜交，進(jìn)行熒光計測。帶有熒光探針的狀態(tài)如圖I的(e)所示。此外，這里，作為進(jìn)行RCA的檢測用細(xì)孔陣列薄片和在細(xì)孔內(nèi)制備cDNA的cDNA文庫薄片，使用了不同的薄片，使用cDNA文庫薄片制備的環(huán)探針轉(zhuǎn)移至檢測用的細(xì)孔陣列薄片(檢測用細(xì)孔陣列薄片)后進(jìn)行RCA，這是為了在重復(fù)使用cDNA文庫薄片時使前次測定中使用的試劑、探針類不妨礙計測。當(dāng)然，也可以在形成了 cDNA文庫的薄片的細(xì)孔內(nèi)部進(jìn)行所有的反應(yīng)和計測。接著，對向cDNA文庫薄片的細(xì)孔內(nèi)部固定DNA探針的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。薄片內(nèi)部的細(xì)孔的表面必須是高密度固 定有聚T DNA探針且同時不吸附mRNA、環(huán)探針等核酸以及連接酶和聚合酶等蛋白質(zhì)的表面。本實施例中，將用于固定DNA的硅烷偶聯(lián)劑和防止吸附的硅烷化MPC聚合物(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿聚合物)，以適當(dāng)比例同時通過共價鍵固定在細(xì)孔表面，實現(xiàn)DNA的高密度固定以及穩(wěn)定抑制核酸、蛋白質(zhì)的吸附。實際中，首先將氧化鋁制的多孔性薄片I在乙醇溶液中浸潰3分鐘后，進(jìn)行5分鐘UV03處理，用超純水洗滌3次。接著，在含有3mg/ml的平均分子量為9700 (聚合度40)的硅烷化MPC聚合物MPCa8-MPTMSia2 (MPC: 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholine)/MPTMSi : 3-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基娃燒(3-MethacryloxypropyItrimethoxysilane))(參考文獻(xiàn) I Biomaterials (《生物材料》)2009, 30，4930-4938,參考文獻(xiàn) 2 Lab Chip 2007，7，199-206)和 O. 3mg/ml 的硅烷偶聯(lián)劑 GTMSi (GTMSi :3_ 縮水甘油氧基丙基三甲氧基娃燒(3-Glycidoxypropy Itr imethoxysi lane)、信越化學(xué))、和作為酸催化劑的O. 02%醋酸的80%乙醇溶液中浸潰2小時。用乙醇洗滌后，在氮氣氛圍中干燥，在烘箱中于120°C加熱處理30分鐘。接著，為了固定DNA，在薄片上滴加500 μ L含有I μΜ的聚 T DNA 探針(01igo(dT)3QVN)、7. 5%甘油和 O. 15M NaCl 的 O. 05M 硼酸緩沖液(pH8. 5)，在加濕室內(nèi)于25V反應(yīng)2小時。最后，封閉未反應(yīng)的縮水甘油基，為了除去過量的DNA探針，用足夠量的含有IOmM Lys,O. 01% SDS和O. 15M NaCl的硼酸緩沖液(pH 8. 5)洗滌5分鐘，除去該洗滌液后，用含有O. 01% SDS和O. 3M NaCl的30mM檸檬酸鈉緩沖液(2xSSC，pH7. O)在60°C下洗滌，除去過量的DNA。由此，完成了 DNA探針的固定和表面處理。以下以細(xì)胞陣列為例進(jìn)行說明，使用組織切片樣品時也是同樣的。以實際測定時的看家基因GAPDH (GenBank登錄號NM_002046)為例進(jìn)行說明。將100萬個左右以下的細(xì)胞樣品裝入管中，加入500 μ L的I XPBS，不損傷細(xì)胞地吸取·吐出溶液進(jìn)行洗滌，然后盡量不殘留PBS地棄去溶液，加入50 μ L冷卻至4°C的I XPBS。將該樣品在薄片I上排列成陣列狀。具體而言，在具有O. I μ m細(xì)孔的60 μ m厚的薄片上，通過表面處理以30微米間隔設(shè)置帶正電的20 μ m直徑的區(qū)域。由于細(xì)胞表面帶負(fù)電，因此當(dāng)使細(xì)胞流至該表面時，以25 μ m間隔被捕獲至表面。捕獲中利用的薄片面積是直徑為25mm的圓形，因此能夠捕獲約100萬個細(xì)胞。實際使細(xì)胞流入進(jìn)行捕獲時，60%左右的位置能夠捕獲各一個細(xì)胞。圖2是用于捕獲細(xì)胞的反應(yīng)槽的一個例子。通過使用反應(yīng)槽,能夠?qū)⒓?xì)胞3—個一個地固定在直徑25mm的薄片I上，用溶液填滿細(xì)孔6的內(nèi)部。為了使薄片周圍填滿溶液，在薄片I的周邊部分設(shè)置聚丙烯制的保護(hù)環(huán)212，在其上下設(shè)置厚度為Imm的間隔物209，用在上下的內(nèi)側(cè)由濺射形成了電極的上蓋201和下蓋202夾住這些，形成用于填滿反應(yīng)溶液的上部反應(yīng)區(qū)域203和下部反應(yīng)區(qū)域204。使用固定夾具210和螺釘211，用以固定間隔物209和上下的蓋201和202。從入口 205注入緩沖液，由上部排出口 206和下部排出口207排出，用溶液填滿內(nèi)部。接著，從細(xì)胞流路(入口 205)，邊振蕩反應(yīng)槽邊使細(xì)胞群流入反應(yīng)槽內(nèi)。細(xì)胞被帶正電的部分捕獲，當(dāng)然也可以使用進(jìn)入I個細(xì)胞那樣的容器來捕獲細(xì)胞。接著，使用在由于溫度而在凝膠狀態(tài)和液體狀態(tài)間發(fā)生相變的低融點瓊脂糖凝膠(SeaPrepAgarose ;2%時，凝膠化溫度為19°C，融點為45°C)中混合有裂解液試劑的溶液，在固定了薄片上的細(xì)胞位置的狀態(tài)下破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞組織，提取mRNA。
將250 μ L 的 4 % 低融點瓊脂糖凝膠 SeaPrep Agarose (Cambrex Bio ScienceRockland, Inc.制造)溶液、495 μ L 的溶菌液(TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit; AppliedBiosystems Inc.)和5μ L的DNase I在40°C下充分混合。接著，將薄片I的溫度設(shè)定為40C，除去反應(yīng)區(qū)域203和204的溶液后，從入口 205注入上述裂解液溶液。確認(rèn)薄片上的溶液發(fā)生凝膠化，將薄片溫度升至20°C，反應(yīng)8分鐘后，在凝膠上添加50 μ L終止液(使DNase失活的溶液)，反應(yīng)5分鐘，冷卻至4°C。接著，加入O. 5mL含有分子量為60萬、O. 03%的PEO(聚氧乙烯)和分子量100萬、O. 03%的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、O. 1% Tween 20的IOmM的Tris緩沖液(pH 8.0)。此時，將上部電極201和下部電極202間的距離設(shè)為2mm，薄片上部和下部的空隙(反應(yīng)區(qū)域203，204)被前述Tris緩沖液完全填滿。在維持薄片和溶液溫度為4°C的狀態(tài)下，將上部電極201作為陰極(GND )、下部電極202作為陽極，施加+ O. 8V共2分鐘，使帶負(fù)電荷的mRNA由細(xì)胞內(nèi)部向204的方向電泳。該過程中，大分部mRNA被固定在薄片中的細(xì)孔內(nèi)的寡dT DNA探針捕捉。但是，一 部分mRNA由于2次結(jié)構(gòu)而未被捕捉，移動至薄片下部的緩沖液中(204)中。為了使mRNA完全被寡dT DNA探針捕捉，將薄片I和溶液的溫度提高至70°C，保持5分鐘后，邊每I分鐘反轉(zhuǎn)一次施加于下部電極202的電壓的極性邊以一 O. I0C /sec冷卻至4°C (最初施加一O. 8V共I分鐘，然后按照+ O. 8V — — O. 8V的方式每分鐘重復(fù)施加10次)。接著，從入口205導(dǎo)入上述tris緩沖液，從排出口 206排出，由此邊交換薄片I上部的區(qū)域203中的溶液，邊將溶液和薄片I的溫度升高到35°C，溶解瓊脂糖凝膠，洗滌并除去非必要的細(xì)胞組織和瓊脂糖。進(jìn)而，將585 μ L的含有O. I % Tween20的IOmM的Tris緩沖液(pH=8. O)、40yL 的 IOmM dNTP、225 μ L的 5xRT 緩沖液(SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA 合成系統(tǒng)(SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA Synthesis System))、40 μ L 的 0. IM DTT、40yL 的RNaseOUT (SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA 合成系統(tǒng))和 40 μ L 的 Superscript III(逆轉(zhuǎn)錄酶SUPERSCRIPT III Cell Direct cDNA合成系統(tǒng))混和，由排出口 206和207排出填滿薄片I的溶液，立即由入口 205注入含有逆轉(zhuǎn)錄酶的上述溶液。然后，將溶液和薄片I升溫至50°C保持50分鐘，從而完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后，在85°C保持I. 5分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，冷卻至4°C后，由入口 205注入IOmL的含有RNase的含O. 1% Tween20的IOmM Tris緩沖液(pH=8. 0)，從排出口 206和207排出，由此分解RNA，同樣流入等量的堿變性劑，除去并洗滌細(xì)孔內(nèi)的殘存物和分解物，構(gòu)建了 cDNA文庫。這里，每I個細(xì)胞使用約I萬個細(xì)孔來制備cDNA文庫。細(xì)孔相對于每I個細(xì)胞的總表面積為約O. 7mm2。每IOOnm2固定了 I個以上DNA探針，因此探針總數(shù)為約7X IO9個，對捕獲每I個細(xì)胞中的mRNA (總數(shù)IO6左右)而言為足夠的量。由于核酸容易吸附在細(xì)孔內(nèi)的表面，如上所述使用MCP聚合物作為表面涂布劑包覆細(xì)孔表面，以防吸附。由以上操作，獲得來自于I個細(xì)胞的cDNA被固定在多個細(xì)孔的表面的cDNA文庫。這可以說是應(yīng)稱為I個細(xì)胞cDNA文庫薄片的文庫，與迄今為止的由多個細(xì)胞獲得的平均化的cDNA文庫截然不同。由這樣獲得的cDNA文庫薄片，對各種基因，定量計測各個基因的表達(dá)量。由于每I個細(xì)胞存在I萬個細(xì)孔，因此每I個細(xì)孔的CDNA個數(shù)平均為100個。對于I種cDNA，當(dāng)每I個細(xì)胞的cDNA拷貝數(shù)為I萬個以下時，每I個細(xì)孔平均為I個以下。為了檢測該基因，使用與每種cDNA特異性雜交的探針。
檢測方法包括利用化學(xué)發(fā)光或熒光的方法，這里對利用化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行說明。作為擴(kuò)增靶標(biāo)cDNA的目標(biāo)序列部分的方法，包括例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)。這里，使用擴(kuò)增率穩(wěn)定的滾環(huán)擴(kuò)增。靶標(biāo)序列的I例如圖4 (序列號I)所示。與該靶標(biāo)部分雜交的DNA探針(鎖式探針)如圖5 (序列號2)所示。該鎖式探針由與靶標(biāo)雜交的特異序列部分和由約22個堿基構(gòu)成的2個共通序列部分構(gòu)成。本實施例中，全長為110個堿基。DNA探針制成如下形狀兩端與靶標(biāo)雜交，通過修復(fù)酶連接酶，末端彼此結(jié)合而生成環(huán)狀的DNA (環(huán)探針)。使DNA探針流入細(xì)孔，使DNA探針(鎖式探針)與靶標(biāo)雜交，通過連接獲得環(huán)狀的DNA (環(huán)探針)。具體而言，將IOyL的2μΜ鎖式探 針、100 μ L的IOx Ampligase緩沖液(Ampligase DNA Ligase 試劑盒(Ampligase DNA Ligase Kits);EPICENTREBiotechnologies 公司)、100 μ L 的 Ampligase(Ampligase DNA Ligase 試劑盒；EPICENTREBiotechnologies 公司)、250μ L 的 BSA (10mg/mL)和 540 μ L 純水(DW)混和，由入口注入該溶液，保持50°C反應(yīng)12小時。然后升溫至80°C，保持20分鐘，從而使連接酶失活。接著，將環(huán)探針轉(zhuǎn)移至檢測用細(xì)孔陣列薄片進(jìn)行計測，在該細(xì)孔內(nèi)預(yù)先固定有與環(huán)探針中的共通部分I的序列雜交的共通DNA探針I(yè) (圖6 ;序列號3)，將環(huán)探針捕捉至細(xì)孔內(nèi)。接著，將具有與環(huán)探針中的另一個共通部分II相同的22個堿基的序列的共通DNA探針I(yè)I (圖7 ;序列號4)和具有鏈取代活性的聚合酶導(dǎo)入細(xì)孔內(nèi)，在37°C進(jìn)行45分鐘RCA反應(yīng)。為了利用RCA和化學(xué)發(fā)光進(jìn)行計測，在對不透明的Si進(jìn)行陽極氧化而得的薄片內(nèi)部固定聚T探針，與前述同樣利用MPC聚合物進(jìn)行涂布。與氧化鋁薄片同樣，設(shè)細(xì)孔的直徑為0. I μ m，直徑為25mm，厚度為100 μ m。接著，如圖8所示，在形成有環(huán)探針的薄片I的下方重疊配置固定了探針I(yè)的薄片801，組裝反應(yīng)槽。在對下蓋202的內(nèi)側(cè)的電極施加+0. 4V的狀態(tài)下，于95°C加熱I分鐘，然后以1°C /sec的速率冷卻至65°C，維持10分鐘。切斷電壓，將溫度冷卻至室溫，除去氧化鋁制的cDNA文庫薄片，僅剩在探針I(yè)上雜交了環(huán)探針的薄片801，再次組裝反應(yīng)槽。將IOOyL 的 10χφ29 發(fā)光試劑緩沖液(0. 5Μ Tricine, 0. IMMgAc, 0. IM(NH4)2SO4, 4mM DTT, 4mM D-熒光素，0. 02mM APS)、10 μ L 的游離 DNA 探針 II(0. 1μΜ)、50μ 的 IOmM dNTP、25 μ L 的 10mg/mL BSA 和 50 μ L 的 10U/μ ] cOf 合酶(NewEngland BioLabs 公司)，將 100 μ L 的耐熱性熒光素酶(4258. IGLU/mL; Kikkoman 公司)和50 μ L 的 ATP 硫酰酶(30U/mL; NewEngland BioLabs 公司)混合到 625 μ L 純水(D. W.)中，由入口 205注入。注入后立即邊不使薄片的上下產(chǎn)生壓力差邊由排出口 206和207除掉多余的試劑。接著，將冷卻至4°c的I 0χφ29發(fā)光試劑緩沖液和Mebiol凝膠的I :9混合溶液同樣地由排出口 220、221以不產(chǎn)生壓力差的方式靜靜地注入。反應(yīng)槽保持在37°C，因此Mebiol凝膠立即發(fā)生凝膠化。然后進(jìn)行20分鐘RCA反應(yīng)。接著，利用如圖9所示的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的計測。這里，使用NA為0. 8、工作距離為3. 3mm的物鏡901、成像鏡902和致冷型CCD相機(jī)903 (1000X1000像素(pixel)、像素尺寸13X13 μ m，量子效率0.9)。光學(xué)系統(tǒng)的倍率設(shè)為50倍，使焦點對準(zhǔn)薄片下側(cè)(接近下蓋202的薄片801的)表面而獲得發(fā)光像。這里，還可以使用CMOS圖像傳感器等其它攝像元件。此時分辨能力為0.5μπι，獲得幾乎臨界的分辨能力。I幀大小為O. 26mm見方，曝光時間設(shè)為3秒，將直徑25mm的計測區(qū)域分成7500個區(qū)域進(jìn)行計測。由獲得的7500張化學(xué)發(fā)光圖像提取化學(xué)發(fā)光斑點，在上面對計測區(qū)域作圖。預(yù)先由明視野像獲得細(xì)胞在薄片上的位置，通過使其與化學(xué)發(fā)光斑點對合位置，可以確認(rèn)每一個細(xì)胞中表達(dá)了多少分子的GAPDH。這里，制備的薄片能夠重復(fù)利用，制備對需要獲知表達(dá)量的基因(靶標(biāo))為特異性的鎖式探針，與上述同樣地進(jìn)行連接反應(yīng)以后的程序，從而對該靶標(biāo)基因在各個細(xì)胞的基因的表達(dá)量進(jìn)行計數(shù)，由此能夠高精度地對其進(jìn)行確認(rèn)。即使RCA反應(yīng)的擴(kuò)增效率改變或者計測的時機(jī)變?yōu)閺腞CA反應(yīng)開始，也由于化學(xué)發(fā)光斑點的有無是在同一畫面上確定的，因此都不成為問題?；瘜W(xué)發(fā)光斑點與mRNA的分子數(shù)直接對應(yīng)，其定量誤差幾乎能夠抑制至遵守泊松分布的測定誤差。本實施例中，使用與GAPDH (GenBank登錄號NM_0 02046)特異性雜交的鎖式探針(序列號2)進(jìn)行序列特異性RCA擴(kuò)增反應(yīng)后，通過化學(xué)發(fā)光斑點的計數(shù)進(jìn)行定量，由于cDNA保持著原來的狀態(tài)，因此進(jìn)行GAPDH的定量評價后，通過導(dǎo)入其它基因的特異性的探針并同樣處理，能夠測定基因表達(dá)分布、解析基因表達(dá)譜。即，通過重復(fù)利用cDNA文庫，能夠?qū)λ斜匦璺N類的基因進(jìn)行高精度的表達(dá)分布測定。本實施例中，為了抑制來自薄片內(nèi)以外的區(qū)域的背景發(fā)光，使用Mebiol凝膠排除薄片內(nèi)部以外的部分的區(qū)域的酶，從而進(jìn)行控制，在細(xì)胞數(shù)量少，計測區(qū)域狹窄的情況下，還可以不使用Mebiol凝膠，而是使用如圖10所示的共聚焦光學(xué)系統(tǒng)來抑制背景的影響。在圖10中，1001為狹縫，能夠?qū)方向的景深控制至O. 01 μ m以下。1002可以使用雪崩光電二極管(APD)或光電倍增管(PMT)中任意一種。此外，光學(xué)系統(tǒng)還可以與圖8同樣地在薄片表面固定化學(xué)發(fā)光所必需的酶(熒光素酶和ATP硫酰酶)，而不使用Mebiol凝膠。固定酶的方法存在多種，這里，在固定探針I(yè)的方法中，與探針I(yè)同時混合鏈霉親和素進(jìn)行反應(yīng)。通過鏈霉親和素表面的氨基和硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)而固定鏈霉親和素。在該狀態(tài)下，混合生物素化熒光素酶和生物素化ATP硫酰酶并在室溫下反應(yīng)30分鐘，則完成熒光素酶和ATP硫酰酶向表面的固定。之后，若省略Mebiol凝膠的注入工序而進(jìn)行RCA反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光計測，則可以與前述同樣進(jìn)行化學(xué)發(fā)光計測?？梢允褂脽晒膺M(jìn)行計測，其細(xì)節(jié)如實施例2所述。此外，可以使用將毛細(xì)管捆扎拉伸切斷而成的毛細(xì)管板來代替通過鋁、硅的陽極氧化而得的薄片，而應(yīng)用完全相同的方法。但是，市售的毛細(xì)管板的細(xì)孔的直徑最小為Ium0因此分辨能力為1/10，在對mRNA分子計數(shù)時，每一個細(xì)胞能夠計測的最大分子數(shù)為100個。這樣的情況下，通過階段性改變化學(xué)發(fā)光量的強(qiáng)度可以擴(kuò)大定量分析范圍。使用毛細(xì)管板時最佳的計測方法如下所示。就使用的毛細(xì)管板而言，使用了細(xì)孔徑為6 μ m、形成有細(xì)孔的區(qū)域的直徑為20mm、外徑為25mm、厚度為I. Omm的浜松光子學(xué)公司制產(chǎn)品。細(xì)孔的內(nèi)壁與前述同樣地在硅烷偶聯(lián)處理的同時進(jìn)行防止吸附的表面處理，在細(xì)孔的內(nèi)壁固定含有polyT序列的寡聚DNA，與膜的情況同樣地制備cDNA文庫薄片。此時，由于形成于毛細(xì)管板的細(xì)孔的直徑大，因此緩和了分辨能力的降低，因此還可以在毛細(xì)管板的內(nèi)部，在直徑I μ m的涂布鏈霉親和素的磁珠上固定含有POlyT序列的寡聚DNA，將該珠子塞進(jìn)毛細(xì)管板上的細(xì)孔內(nèi)部，捕捉cDNA，同樣地制備cDNA文庫。[實施例2]本實施例的概要如圖11所示。這是由組織切片樣品1101在細(xì)孔陣列薄片中構(gòu)建二維cDNA文庫薄片來使用的例子。將凍結(jié)的組織切片按照5 20 μ m左右的厚度利用切片機(jī)制成膜狀的樣品，如圖11所示那樣在氧化鋁制的細(xì)孔陣列薄片I上放置組織切片樣品1101，立即用含有裂解液的低融點瓊脂糖包覆組織切片樣品。瓊脂糖溶液在35°C保持溶液的狀態(tài)，將薄片I冷卻至4°C則立即凝膠化，然后設(shè)置在如圖2所示的反應(yīng)槽內(nèi)，與實施例I同樣地提取mRNA。使用在低融點瓊脂糖凝膠(SeaPrep Agarose ;2%時的凝膠化溫度為19°C、融點為45°C)中混合了裂解液試劑的溶液，在薄片狀的細(xì)胞切片樣品中的細(xì)胞的位置固定的狀態(tài)下，破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞組織提取mRNA。這種情況下也能夠進(jìn)行化學(xué)發(fā)光計測，本實施例中則對熒光計測進(jìn)行詳細(xì)說明。將mRNA固定在薄片內(nèi)后，制備與實施例I同樣地能夠重復(fù)利用的cDNA文庫薄片。然后，既可以用對基因(靶標(biāo))為特異性的熒光探針標(biāo)記該薄片中的cDNA，洗滌后直接進(jìn)行熒光計測；也可以使熒光探針與使用RCA、PCR等化學(xué)擴(kuò)增法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后進(jìn)行熒光計測。此外，既可以如實施例I所示那樣移動(轉(zhuǎn)移)到其它薄片后進(jìn)行熒光計測，也可以進(jìn)行化學(xué)擴(kuò)增后測定。這里詳細(xì)記載了由cDNA文庫導(dǎo)入對基因為特異性的鎖式探針、將環(huán)探針移動到其它薄片中后進(jìn)行RCA擴(kuò)增并計測熒光的例子。S卩，在cDNA文庫薄片內(nèi)部進(jìn)行基因特異性連接，由鎖式探針制備環(huán)探針。接著，通過電泳使該環(huán)探針移動至其它薄片。這里，用于計測熒光的第2細(xì)孔陣列薄片使用的是氧化鋁制的透明薄片。熒光計測通常靈敏度高，因此在RCA反應(yīng)時不使用探針I(yè)I，在進(jìn)行RCA后將與熒光標(biāo)記的探針I(yè)I同樣的序列導(dǎo)入細(xì)孔內(nèi)，從而導(dǎo)入熒光探針，通過如圖12所示的光學(xué)系統(tǒng)得到熒光像。使用該像對熒光斑點進(jìn)行計數(shù)，從而進(jìn)行mRNA分子數(shù)的計數(shù)。這里，1201為激發(fā)器，熒光體設(shè)為Cy3，因此激發(fā)器的激發(fā)波長設(shè)為532nm、輸出水平設(shè)為20mW。此外，使用與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光的嵌入劑(SYTOX Green,POPO 3)來代替使用帶有熒光體的探針I(yè)I，也能夠同樣地進(jìn)行mRNA分子計數(shù)。激發(fā)器輸出是光束直徑為Imm的準(zhǔn)直光，利用激光擴(kuò)束器1202將其放大至5倍。1203為NA是O. 8、工作距離是3. 6mm、焦距是3. 6mm的物鏡，使焦點對準(zhǔn)薄片最下面，在倍率50倍下利用致冷型CXD相機(jī)1206得到熒光像。這里，1204是分色鏡，1205是成像鏡，1207是用于阻斷激發(fā)光的帶通濾光片。I幀的圖像尺寸為O. 26mm見方，曝光時間為10msec、用70秒掃描了薄片最下面整體。接著,沿著z方向僅移動I μ m,按照焦點對準(zhǔn)薄片內(nèi)部的方式同樣進(jìn)行掃描，獲得薄片整體的圖像需要80分鐘。面內(nèi)的分辨能力為O. 5 μ m，因此直徑IOym的每I個細(xì)胞能夠計數(shù)的mRNA的最大數(shù)量為約20000。此外，在分辨能力O. 5 μ m下還能夠獲得細(xì)胞內(nèi)的mRNA分布。氧化鋁制的折射率較大，為I. 76，多晶性導(dǎo)致光散射較大。因此RCA反應(yīng)不會以足夠的效率充分發(fā)生，當(dāng)對RCA產(chǎn)物的每I分子的熒光體數(shù)量少的分子計測熒光時，有時無法視為熒光斑點進(jìn)行計測。因此，也可以不沿著z方向移動物鏡的焦點位置，而是將帶熒光 體的RCA產(chǎn)物移動至薄片下面然后使焦點對準(zhǔn)薄片最下面來拍攝，僅在xy方向掃描載物臺而能夠獲得薄片整體的熒光像。為了移動RCA產(chǎn)物，可以將溫度升高至80°C左右并對下蓋側(cè)的電極施加+ O. 4V左右的電壓，但這里，對該電極施加一 O. 4V，使得由上至下產(chǎn)生每秒10 μ m的壓力流，從而RCA產(chǎn)物移動至薄片最下面附近，利用這種方式得到熒光像。圖26中示出此時得到的熒光像例子和得到的數(shù)據(jù)例子。2601表示由一次攝像CXD相機(jī)獲得的圖像。其中的白點2602對應(yīng)于來自熒光探針與RCA反應(yīng)后的DNA結(jié)合而成的分子的突光斑點。一個一個的該點對應(yīng)于細(xì)胞中的一分子mRNA,通過對該突光斑點計數(shù),可以對對應(yīng)于特定基因的mRNA的分子數(shù)進(jìn)行計數(shù)。沿著XYZ方向(2604)掃描取得這樣的多個圖像(2603)。該XYZ方向與圖12的1210所示的XYZ方向一致。被計測的熒光斑點分別對應(yīng)于XYZ坐標(biāo)，Z方向為由于電泳而移動的方向，因此與cDNA文庫薄片上的細(xì)胞位置對應(yīng)，所以不考慮Z坐標(biāo)，而是通過與事先取得的為哪個細(xì)胞中的mRNA的顯微鏡像對應(yīng)而確定。利用這樣的數(shù)據(jù)的相關(guān)，可以獲得如表2605這樣的數(shù)據(jù)組。
接著，在需要提高熒光斑點的分辨能力、計測細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布的情況下，可以使用如圖13所不的光學(xué)系統(tǒng)。由激發(fā)器發(fā)射的光被激光擴(kuò)束器1202由Imm放大至5mm,利用NA為20. 9、工作距離為1mm、焦距為3. 6mm的物鏡1203，將激光斑點在薄片內(nèi)部匯聚至Iym左右。利用同一物鏡1203對位于薄片的細(xì)孔內(nèi)部的熒光體(Cy3)發(fā)出的熒光進(jìn)行聚光，通過分色鏡1204，阻斷激發(fā)光后，利用成像鏡1205成像，在成像面通過直徑50 μ m的針孔1301，構(gòu)成共聚焦光學(xué)系統(tǒng)。光檢測器1302使用了光電倍增管，也可以利用APD。這種情況下，得到了方向的光學(xué)系統(tǒng)的分辨能力5nm，但由于利用了 IOnm間距的z方向驅(qū)動機(jī)構(gòu)，因此計測整體的分辨能力為10nm。XY方向的光學(xué)系統(tǒng)的分辨能力為0.4μπι，因此使用60 μ m厚度時，假設(shè)細(xì)胞中最大表達(dá)量為10000，則幾乎可以以光學(xué)系統(tǒng)的分辨能力對基因表達(dá)量進(jìn)行定量。這種情況下還能夠獲得細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)外的mRNA分布。在前面的記載中，由細(xì)孔陣列薄片中制備的cDNA文庫，在同一薄片中進(jìn)行RCA擴(kuò)增，在薄片內(nèi)部與熒光探針雜交并進(jìn)行熒光計測，或者使環(huán)探針通過電泳移動至檢測薄片后進(jìn)行RCA擴(kuò)增，與熒光探針雜交并進(jìn)行熒光計測。還可以使環(huán)探針移動至凝膠膜來代替移動至檢測薄片，而進(jìn)行熒光計測。接著，對這種情況進(jìn)行說明。在細(xì)孔陣列薄片中制備cDNA文庫，完成cDNA文庫薄片后，制備如圖14所示的、在下蓋202之上形成膜狀的凝膠1401并在其上密合帶有細(xì)孔的cDNA文庫薄片I而成的反應(yīng)槽。接著，在cDNA文庫薄片內(nèi)，序列特異性地由鎖式探針形成環(huán)探針，使環(huán)探針通過電泳移動至凝膠膜。移動了的環(huán)探針被共通探針I(yè)捕捉，注入具有與環(huán)探針雜交的序列的熒光探針后，通過電泳被誘導(dǎo)至凝膠膜，從而完成熒光計測準(zhǔn)備，也可以在RCA反應(yīng)后同樣地添加熒光探針。下面詳細(xì)記載這種情況。這里，就使用的凝膠而言，可以使用任意的凝膠材料，既可以使用例如丙烯酰胺凝膠、明膠、修飾聚乙二醇、修飾聚乙烯吡咯烷酮、修飾聚乙二醇，也可以使用其它水凝膠。但是，凝膠的材料必需是在從cDNA分離環(huán)探針而進(jìn)行電泳的條件下保持凝膠狀態(tài)的材料。例如，在實施例I的條件下，在95°C必需保持凝膠狀態(tài)。這里，將O. 5mL的含有2 % AWP (東洋合成)和10mg/mL的鏈霉親和素的50mMTricine緩沖液(pH7. 5)滴加到下蓋202上，以1500rpm旋轉(zhuǎn)涂布后，照射含有波長302nm的紫外光(2mW/cm2)2分鐘使其凝膠化。由此，形成厚度為10 μ m左右的含有鏈霉親和素固定化位點的凝膠膜1401。再將500yL的5'末端經(jīng)生物素修飾的探針I(yè)的I μ M溶液按照包覆膜的方式滴加到凝膠膜1401上，邊防止干燥邊在室溫下反應(yīng)2小時，然后用足夠量的緩沖液洗滌凝膠膜，從而完成與環(huán)探針雜交的探針向凝膠膜1401的固定。將帶有凝膠膜1401的下蓋202安裝到反應(yīng)槽中，在其上密合cDNA文庫薄片1，安裝上蓋201，然后由入口 205將ImL的50mM Tricine緩沖液(pH7. 5)注入反應(yīng)槽內(nèi)，脫氣。接著，為了在該薄片內(nèi)與前述同樣制備環(huán)探針，由入口 205注入含有鎖式探針和連接酶的試劑，在實施例I所述的條件下反應(yīng)。為了使環(huán)探針通過電泳移動至凝膠膜中，在對下蓋202的內(nèi)側(cè)的電極施加+ O. 4V的狀態(tài)下于95°C加熱I分鐘，然后以I °C /sec的速率冷卻到65°C，維持10分鐘。結(jié)果獲得的凝膠膜和薄片剖面的狀態(tài)模式的示于圖15。1501為用于通過生物素親和素結(jié)合來固定探針I(yè) (1502)的鏈霉親和素，其與AWP聚合物通過紫外線照射引起的鏈霉親和素上的伯胺和AWP聚合物上的疊氮基的反應(yīng)而共價結(jié)合。因電泳而移動過來的環(huán)探針1503因與高密度固定的探針I(yè) (1502)雜交而被固定。這里，取下cDNA文庫薄片，將100 μ L的10χφ29發(fā)光試劑緩沖液(O. 5Μ Tricine, O. IMMgAc,0. IM(NH4)2SO4, 4mM DTT)、10yL 的 5'末端磷酸化的游離 DNA 探針 II (Ο.ΙμΜ)、50 μ L 的 IOmM dNTP、25 μ L 的 10mg/mL BSA 和 50 μ L 的 IOU/ μ L φ29聚合酶(New EnglandBioLabs)混合到775μ L的IOmM DTT的D. W.中，由入口 205注入。然后將反應(yīng)槽保持在37°C，進(jìn)行60分鐘RCA反應(yīng)。此時，RCA反應(yīng)與實施例I的情況相同，但在磷酸化的探針I(yè)I起始的互補鏈合成反應(yīng)時，由于φ29聚合酶的鏈取代活性，多個互補鏈從由探針I(yè)伸長的DNA分離，但該鏈在本來環(huán)探針與探針I(yè)雜交的位置的極近處再次被探針I(yè)捕捉，起始互補鏈合成反應(yīng)。因此，凝膠中形成由多條如下的鏈構(gòu)成的熒光斑點來自I分子的環(huán)探針的一 條鏈中具有多個用于熒光探針雜交的雜交位點。RCA反應(yīng)越長、探針I(yè)I的濃度越高，此外探針I(yè)的濃度越低，則該熒光斑點尺寸越大。上述反應(yīng)條件下，斑點直徑為O. I O. 3 μ m。此外，由于相當(dāng)比例的DNA鏈為雙鏈，因此即使此后導(dǎo)入與探針I(yè)I序列相同且固定了 Cy3熒光體的熒光探針，雜交的位置(位點)也變少。為了防止由此導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度降低，可以利用λ核酸外切酶選擇性消化經(jīng)磷酸化的鏈，將雙鏈變成單鏈。S卩，如圖16的(a)所示，由于Y末端導(dǎo)入了磷酸基，該被磷酸化的鏈被λ核酸外切酶消化而單鏈化，由此如圖16的(b)所示，幾乎所有位點均能夠結(jié)合熒光探針。接著，為了附加熒光探針，在反應(yīng)槽中注入I μ M與探針I(yè)I序列相同且5'末端結(jié)合了熒光體(Cy3)的探針，對下蓋202施加+ O. 4V 5分鐘后，每分鐘重復(fù)三次一 O. 4V和+O. 4V的施加。然后將溶液交換成不含探針的50mMTricine緩沖液，對下蓋施加一 O. 4V 10分鐘，同時以lmL/min的流速使緩沖液從入口 205持續(xù)流至排出口 207。熒光計測是使用圖14所示的共聚焦光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行的。光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成與圖13相同。沿著z和xy方向掃描凝膠中而獲得，與細(xì)孔陣列薄片相比，使用凝膠時折射率分布小，熒光計測時不易受到散射光的影響。此外，熒光計測還可以使用圖17所示的瞬逝激發(fā)。為了實現(xiàn)瞬逝激發(fā)，在厚度為2mm的用石英板制成的下蓋202的中心附近形成2處直角三楞柱形的凹陷1703。波長532nm的激發(fā)光經(jīng)激光擴(kuò)束器1202放大至3倍后，能夠經(jīng)聚光鏡1702聚光至凝膠膜1401和下蓋202的上面的邊界附近。此時，通過凹陷1703折射，激光以小于上述界面的臨界角的角度入射從而進(jìn)行全反射。通過全反射，僅在上述界面附近數(shù)百nm進(jìn)行激發(fā)，僅位于該界面附近的熒光體被計測。物鏡1203與前述同樣地使用NA為O. 8、工作距離為3. 3mm的物鏡，通過除去激發(fā)光的散射光的帶通濾光片1207和成像鏡1205，使用作為拍攝元件的致冷型CXD相機(jī)1206得到熒光像。此前的例子中通過對熒光像中的熒光斑點進(jìn)行計數(shù)而進(jìn)行mRNA的定量，當(dāng)然也可以使熒光強(qiáng)度和分子數(shù)對應(yīng)而進(jìn)行定量。但是，利用對斑點進(jìn)行計數(shù)的定量不僅是不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量，而且僅設(shè)定判定分子有無的I個閾值，因此是能進(jìn)行最高精度的定量。但另一方面，該方法犧牲了空間分辨能力。即使?fàn)奚啃砸脖匦璞ＷC空間分辨能力的情況下，也可以利用強(qiáng)度和分子數(shù)的對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行定量。予以說明，選擇這樣的利用計數(shù)進(jìn)行定量或者部分使用強(qiáng)度計測均與實施例I的化學(xué)發(fā)光的情況相同。此外，為了利用瞬逝激發(fā)獲得熒光 像，還可以使用全內(nèi)角反射熒光(TotalInternal Reflection Fluorescence)專用的物鏡(例如 ΑΡΟΝ 60 X OTIRFM (奧林巴斯))。在本實施例的情況下，當(dāng)然也能夠重復(fù)利用cDNA文庫薄片。此外，所有實施例中均能夠同樣的是，將通過本法獲得的熒光像或化學(xué)發(fā)光像和由其得到的基因表達(dá)譜(基因表達(dá)分布)與事先取得的細(xì)胞的顯微鏡像重合，由此能夠獲得關(guān)于細(xì)胞的形狀和基因表達(dá)之間的相關(guān)的數(shù)據(jù)。進(jìn)而通過將利用突光原位雜交(fluorescence in situhybridiZation;FISH)法得到的圖像和利用本法得到的像重合，在測定了相同基因時，還可以有效利用本法的高精度定量而評價FISH法的定量性。當(dāng)然，用于進(jìn)行重合的像也可以是通過其它標(biāo)記法得到的熒光、化學(xué)發(fā)光像。此外，還可以使用固定了堿性磷酸酶、過氧化酶等化學(xué)發(fā)光酶的DNA探針來代替熒光標(biāo)記，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，從而進(jìn)行發(fā)光計測。[實施例3]本實施例并非是如實施例I或2那樣利用帶細(xì)孔的薄片作為cDNA文庫薄片，而是利用其它膜作為支持體制備cDNA文庫的例子。作為膜，可以利用吸附蛋白質(zhì)少的醋酸纖維素膜、硝基纖維素膜或它們的混合膜以及尼龍膜等。這里示出使用厚度為115 μ m、孔隙尺寸為0. 2 μ m、直徑為25_的醋酸纖維素制膜(Whatman公司)的例子。如圖18所示，在膜1801內(nèi)部的膜纖維1802的表面，與實施例I同樣對聚T探針1803進(jìn)行硅烷偶聯(lián)處理而將其固定。此外，同時MPC處理也同樣進(jìn)行。接著，將膜設(shè)置在與實施例I或2同樣的反應(yīng)槽中，放置組織切片樣品1101，進(jìn)行與前述同樣的處理，則能夠在膜內(nèi)保存細(xì)胞位置信息的狀態(tài)下將mRNA捕獲至膜內(nèi)的聚T探針上。然后，同樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由此能夠制備cDNA文庫膜。既可以導(dǎo)入基因特異性熒光探針，用如圖13或圖14那樣的能夠進(jìn)行單分子計測的光學(xué)系統(tǒng)對其進(jìn)行計數(shù)，由此測定基因表達(dá)分布，也可以在RCA、PCR等化學(xué)擴(kuò)增后與前述同樣進(jìn)行熒光計測。此外，也可以與實施例I和2同樣地，由cDNA文庫薄片移動至檢測薄片(其既可以使用帶細(xì)孔的薄片，也可以使用膜、凝膠膜)，然后不進(jìn)行RCA、PCR等化學(xué)擴(kuò)增，就進(jìn)行熒光計測、化學(xué)發(fā)光計測。此外，也可以在擴(kuò)增后同樣進(jìn)行計測。此外，不使用膜，而是使用薄片狀的凝膠膜、其它多孔材料也能夠進(jìn)行同樣的操作。[實施例4]本實施例是利用珠子作為支持體制備cDNA文庫的例子。該例子中，預(yù)先在面上鋪設(shè)比細(xì)胞更小的珠子，在珠子表面固定聚T探針，在其上放置組織切片，與前述實施例同樣進(jìn)行處理。此時的cDNA文庫薄片的剖面圖如圖19所示。石英制的板1903和其上面形成透明電極1902，在其上鋪設(shè)固定了聚T探針的直徑I μ m的Dynabeads (商標(biāo))磁珠1901。為了使Dynabeads (商標(biāo))磁珠1901不移動，按照一定間隔設(shè)置擋塊1904。在其上放置組織切片樣品1101，與前述同樣地破碎細(xì)胞和同時通過電泳將mRNA捕捉到珠子表面，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫薄片。就測定而言，石英板1903和透明電極1902對應(yīng)于下蓋202，因此能夠通過石英板計測熒光。此外，還能夠換成尼龍網(wǎng)等多孔質(zhì)制材料來代替石英板，將mRNA的位置信息轉(zhuǎn)移至其它薄片、膜。此外，在該例子中，珠子為I層，但也可以鋪設(shè)多層珠子。此外，珠子材料既可以是聚苯乙烯等樹脂材料、玻璃等(金屬)氧化物、金屬、瓊脂糖凝膠(Sepharose)等有機(jī)物,也可以是這些的混合物。例如,這里使用了組合聚苯乙烯和鐵的磁珠。
接著，也可以在如圖20所示那樣的收納細(xì)胞的槽的底面鋪設(shè)多個珠子并進(jìn)行同樣的處理。該例子中，2001為反應(yīng)槽，在其底面使用了固定有聚T探針的直徑為I μπι的磁珠1901。1903為石英板，1902為透明電極。這些的作用與前述相同。[實施例5]實施例I 4中，使基因特異性的鎖式探針與cDNA雜交，將基因特異性地形成的環(huán)探針轉(zhuǎn)移至其它薄片、膜、凝膠中。將基因的表達(dá)分布轉(zhuǎn)移至其它膜的方法并非僅有該方法。例如還可以在通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(例如SUPERSCRIPT II)，由mRNA合成cDNA時，在cDNA的所有末端添加CCC序列，接著在薄片內(nèi)部與識別該序列的探針雜交，將伸長反應(yīng)后的適當(dāng)長度的互補鏈轉(zhuǎn)移至其它薄片，從而將全cDNA的分布信息轉(zhuǎn)移至其它薄片。通過對全部基因表達(dá)的信息進(jìn)行序列解析，還能夠獲得分布。此時利用焦磷酸測序法還能夠轉(zhuǎn)變成除去了同聚物的序列。此外，與不形成環(huán)的基因特異性的探針雜交，如圖21所示在5'末端側(cè)添加與基因信息對應(yīng)的序列，從而能夠在非靶標(biāo)序列的序列中保持信息。圖21的2101表示薄片的細(xì)孔內(nèi)壁、膜的纖維。其表面預(yù)先固定有cDNA文庫，2102表示單鏈cDNA。DNA探針2103部分序列特異性地進(jìn)行雜交，序列特異性是基于2104的序列與cDNA的一部分序列互補。通過將與該序列對應(yīng)的已知序列配置在例如2105，能夠識別非原cDNA序列的序列并計測熒光、化學(xué)發(fā)光。此外，通過在這樣的探針中導(dǎo)入共通序列部分，能夠使引物雜交到該共通序列部分而進(jìn)行擴(kuò)增，因此能夠降低擴(kuò)增偏嗜，這與以前的實施例是同樣的。進(jìn)而，通過在2104的序列識別部分使用通用堿基，還能夠以一個序列來代表某一組序列，使一個探針與該組基因群反應(yīng)。[實施例6]上述實施例中使用了熒光、化學(xué)發(fā)光計測，還可以通過計測當(dāng)DNA接近電極表面時產(chǎn)生的、電極的電位變化來對mRNA分布進(jìn)行定量。尤其是通過利用FET的柵電極電位變化，能夠?qū)τ蒫DNA文庫薄片轉(zhuǎn)錄獲得的DNA探針進(jìn)行定量。通過使柵電極容量減小至fF左右，還能夠?qū)個元電荷的柵電極附近的移動進(jìn)行計測，因此能夠計測I分子DNA在柵電極上的雜交。圖22示出利用了電位計測的計測機(jī)器的構(gòu)成例子。I為細(xì)孔陣列薄片，設(shè)為已經(jīng)形成cDNA文庫。在該薄片的正下方配置有以幾乎密合的形態(tài)配置有多個FET的半導(dǎo)體芯片2201。FET芯片2201和薄片I之間以及薄片I內(nèi)部預(yù)先充滿電解質(zhì)溶液，此外，該溶液的電位設(shè)為受參照電極控制。芯片上形成多個FET槽2202，在槽內(nèi)部形成各個源極2203、漏極2204和柵極2205。槽尺寸設(shè)為I μ m。槽間形成有字元線(word line)和引線，能夠通過開關(guān)用FET依次計測特定的槽的源極漏極間的電流。柵電極由寬度為50nm的多晶硅配線形成，柵極一漏極和柵極一密封層(grand)容量被設(shè)計為足夠小。在柵電極上預(yù)先通過硅烷偶聯(lián)劑固定了與環(huán)狀探針2207特異性雜交的探針2206，柵電極電位由于雜交產(chǎn)生的負(fù)離子而降低，能夠有效地改變源極漏極間的電流。[實施例7]上述實施例中詳述了對mRNA的分布進(jìn)行定量的方法，對于mRNA以外的非編碼RNA(ncRNA)、基因組DNA也能夠應(yīng)用同樣的方法。不同點在于，在薄片的細(xì)孔內(nèi)壁、膜的纖維上固定能夠?qū)⒆鳛榻馕鰧ο蟮男蛄?ncRNA、DNA等)固定的通用探針，而不是固定聚T探針。[實施例8]本實施例中，對核酸以外的分子(例如蛋白質(zhì)或其它低分子物質(zhì))在細(xì)胞中的存在進(jìn)行解析。通過在細(xì)孔內(nèi)固定與細(xì)胞內(nèi)的欲定量的分子特異性結(jié)合的抗體、適體，形成對欲定量的分子為特異性的環(huán)探針，與上述實施例同樣地能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的存在分布進(jìn)行定量。該方法稱為鄰位連接法(Proximity Ligation Method)(參考文獻(xiàn)Malin Jarvius等人，Molecular & Cellular Proteomics (《分子細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)》)6 (9) p. 1500，2007)。圖23中示出薄片的細(xì)孔內(nèi)部的模式圖。2101表示細(xì)孔的內(nèi)壁或膜的纖維，對于與細(xì)胞內(nèi)的欲定量的分子2301結(jié)合的抗體2302，通過將把該抗體識別為抗原的二抗2303固定在細(xì)孔壁面2101上，來進(jìn)行固定，其結(jié)果是，將欲定量的分子2301固定。此外，與欲定量的分子2301形成三明治結(jié)合的另一抗體2304也與識別抗體的二抗2305結(jié)合。二抗上分別預(yù)先固定有DNA (2306和2307)，欲定量的分子2301結(jié)合到抗體2302和2304上，從而使這兩根單鏈DNA靠近。此時，在細(xì)孔內(nèi)注入兩條DNA探針2308和2309，使其與2306和2307雜交，通過連接反應(yīng)形成環(huán)探針。形成環(huán)探針后的計測法與上述實施例相同。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請的全文，均作為參考引入本說明書中。產(chǎn)業(yè)利用性本發(fā)明提供基因表達(dá)譜的解析方法。本發(fā)明的方法能夠?qū)悠分械幕虻谋磉_(dá)與其二維位置信息一起檢測出來。此外，就本發(fā)明的方法而言，能夠?qū)悠分斜磉_(dá)的基因全部轉(zhuǎn)變成cDNA制成cDNA文庫，因此能夠簡便且高效地進(jìn)行基因表達(dá)的檢測。因此，本發(fā)明在細(xì)胞機(jī)能解析、活體組織的解析、疾病診斷、藥物開發(fā)等領(lǐng)域中是有用的。附圖標(biāo)記說明I 薄片
2 細(xì)孔3 細(xì)胞4含有裂解液的凝膠5 mRNA6 細(xì)孔7 DNA 探針8被捕獲到細(xì)孔中的mRNA
9 cDMA10 探針201上蓋、上部電極202下蓋、下部電極203上部反應(yīng)區(qū)域204下部反應(yīng)區(qū)域205 入口206上部排出口207下部排出口209間隔物210固定夾具211 螺釘212保護(hù)環(huán)220上部排出口221下部排出口801 薄片901 物鏡902成像鏡903致冷型CCD相機(jī)1001 狹縫1002雪崩光電二極管(APD)或光電倍增管(PMT)1101組織切片樣品1201 激發(fā)器1202激光擴(kuò)束器1203 物鏡1204 分色鏡1205 成像鏡1206致冷型CCD相機(jī)1207帶通濾光片1210xyz 方向1301 針孔1302光檢測器1401 凝膠膜1501鏈霉親和素1502 探針 I1503 環(huán)探針1701 鏡1702 聚光 鏡1703 凹陷
1801膜1802膜纖維1803探針1901Dynabeads 磁珠1902透明電極1903板
1904 擋塊2001反應(yīng)槽2101薄片的細(xì)孔內(nèi)壁或膜的纖維2102cDNA2103DNA 探針2104與cDNA的部分序列互補的序列2105與cDNA的序列不同的已知序列2201半導(dǎo)體芯片2202FET 槽2203源極2204 漏極2205柵極2206探針2207環(huán)探針2301計測對象的分子2302抗體2303二抗2304 抗體2305二抗2306DNA2307DNA2308DNA 探針2309DNA 探針2601由一次拍攝C⑶相機(jī)獲得的圖像2602熒光斑點2603多個圖像2604 xyz 方向2605數(shù)據(jù)組序列表自由文字序列號I 4 :人工序列(合成DNA)
權(quán)利要求
1.一種基因表達(dá)譜的解析方法，其特征在于，包括 (a)使樣品中的待測核酸與二維地分布且固定在支持體上的核酸探針雜交的步驟， (b)合成具有與待測核酸的序列互補的序列的cDNA，在該支持體上制備二維cDNA文庫的步驟， (c)使用二維cDNA文庫，檢測樣品中的基因表達(dá)的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，樣品含有多個細(xì)胞，對每個細(xì)胞解析基因表達(dá)譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，樣品含有多個細(xì)胞，解析每個細(xì)胞的基因表達(dá)譜，比較細(xì)胞間的基因表達(dá)譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任意一項所述的方法，樣品為活體組織樣品，在保存有構(gòu)成活體組織樣品的細(xì)胞的二維位置信息的狀態(tài)下，制備二維cDNA文庫。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任意一項所述的方法，樣品為活體組織樣品，在保存有構(gòu)成活體組織樣品的細(xì)胞的內(nèi)部的二維位置信息的狀態(tài)下，制備二維cDNA文庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，活體組織樣品為組織切片樣品，通過使該組織切片樣品中的待測核酸移動到支持體，使其與核酸探針雜交。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，待測核酸向支持體的移動是通過電泳進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7中任意一項所述的方法，樣品為二維地保持有各個細(xì)胞的陣列。
9.根據(jù)權(quán)利要求I 8中任意一項所述的方法，待測核酸選自由信使RNA(mRNA)、非編碼RNA (ncRNA)和DNA、以及它們的片段組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，待測核酸為mRNA，核酸探針為含有多聚T序列的DNA探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求I 10中任意一項所述的方法，支持體為選自薄片、膜、凝膠薄膜、毛細(xì)管板和珠子組成的組中的至少I種。
12.根據(jù)權(quán)利要求I 11中任意一項所述的方法，支持體具有二維地劃分而成的多個微細(xì)空間。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，微細(xì)空間的間隔比細(xì)胞的尺寸小。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，二維cDNA文庫是cDNA被保持在支持體的二維地劃分而成的多個微細(xì)空間中的文庫。
15.根據(jù)權(quán)利要求I 14中任意一項所述的方法，還包含如下步驟使保持在二維cDNA文庫中的cDNA或其互補鏈拷貝移動至第2支持體，并使其與二維地分布且固定在第2支持體上的、具有與該cDNA或其互補鏈拷貝片段互補的序列的核酸探針雜交，從而制備第2二維cDNA文庫。
16.根據(jù)權(quán)利要求I 15中任意一項所述的方法，還包含如下步驟生成與保持在二維cDNA文庫中的cDNA對應(yīng)的核酸片段，在保持有二維cDNA文庫的二維位置信息的狀態(tài)下，使該核酸片段移動至第2支持體，從而制備第2 二維cDNA文庫。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，與cDNA對應(yīng)的核酸片段含有cDNA的互補序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，與cDNA對應(yīng)的核酸片段含有cDNA的互補序列和與cDNA的序列沒有關(guān)聯(lián)的已知序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求I 18中任意一項所述的方法，使對檢測對象的基因為特異性的標(biāo)記核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，基于其標(biāo)記檢測基因表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，標(biāo)記為熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
21.根據(jù)權(quán)利要求I 18中任意一項所述的方法，使對檢測對象的基因為特異性的核酸探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交，進(jìn)行該核酸探針中所含的核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)，基于其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測基因表達(dá)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，擴(kuò)增反應(yīng)為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
23.根據(jù)權(quán)利要求I 18中任意一項所述的方法，使對檢測對象的基因為特異性的核酸鎖式探針與保持在二維cDNA文庫中的cDNA雜交,通過連接反應(yīng)使已雜交的鎖式探針形成環(huán)狀的探針，以該環(huán)狀探針為模板，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)，基于其擴(kuò)增產(chǎn)物檢測基因表達(dá)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21 23中任意一項所述的方法，利用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
25.根據(jù)權(quán)利要求I 24中任意一項所述的方法，重復(fù)使用二維cDNA文庫，進(jìn)行基因表達(dá)的檢測步驟。
26.根據(jù)權(quán)利要求I 25中任意一項所述的方法，還包含如下步驟比較二維cDNA文庫的基因表達(dá)的檢測結(jié)果和樣品的二維位置信息，獲得樣品中的特定的位置和基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)。
27.一種分子譜的解析方法，其特征在于，其為樣品中所含的分子譜的解析方法，包括 (a)使樣品中的待測分子與二維地分布且固定在支持體上的抗體或適體結(jié)合的步驟， (b)利用鄰位連接法，形成對待測分子和抗體的結(jié)合或者待測分子和適體的結(jié)合為特異性的環(huán)探針的步驟， (C)使用上述環(huán)探針或以環(huán)探針為模板而生成的核酸片段，制備二維cDNA文庫的步驟， Cd)使用二維cDNA文庫，檢測樣品中的分子的存在的步驟。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，分子為蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于取出每1個細(xì)胞并解析、同時在保存組織的二維信息的形態(tài)下定量監(jiān)視各種基因的表達(dá)量的方法和/或手段。具體而言，本發(fā)明提供在保持活體組織內(nèi)的二維細(xì)胞分布信息的形態(tài)下，由mRNA制備cDNA文庫、以1個細(xì)胞水平的位置分辨能力獲得任意的或作為對象的所有位置的基因表達(dá)量的方法。更具體而言，在保持活體組織內(nèi)的二維細(xì)胞分布信息的形態(tài)下，由mRNA制備薄片狀的cDNA文庫，將其重復(fù)，用于基因表達(dá)的檢測步驟，從而能夠高精度地對多個基因計測表達(dá)分布。
文檔編號C12N15/09GK102639716SQ201080054749
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者白井正敬, 神原秀記, 谷口妃代美 申請人:株式會社日立制作所