生產l-半胱氨酸的細菌以及生產l-半胱氨酸的方法

專利名稱：生產l-半胱氨酸的細菌以及生產l-半胱氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產L-半胱氨酸或其相關物質的方法。更具體地，本發明涉及適于生產L-半胱氨酸或其相關物質的細菌、以及使用該細菌生產L-半胱氨酸或其相關物質的方法。L-半胱氨酸及其相關物質可以在藥物、化妝品以及食品領域中使用。
背景技術：
L-半胱氨酸通常通過從例如毛發、角和羽毛等含有角蛋白質的物質中提取而獲得，或者使用微生物酶轉化前體DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸通過而獲得。此外，還計劃使用新型酶通過固定化酶方法大規模生產L-半胱氨酸。此外，還嘗試通過使用微生物的發酵來生產L-半胱氨酸。
作為具有生產L-半胱氨酸能力的微生物，已知有例如胞內絲氨酸乙酰轉移酶活性增加的棒狀桿菌型細菌(專利文獻I)。還已知一種通過并入削弱了 L-半胱氨酸反饋抑制的突變型絲氨酸乙酰轉移酶增加L-半胱氨酸生產能力的技術(專利文獻2至4)。此外，作為通過抑制起分解L-半胱氨酸作用的系統來提高L-半胱氨酸生產能力的微生物，已知削弱或缺失了胱硫醚-β-裂合酶(專利文獻2)、色氨酸酶(專利文獻5)或O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B (專利文獻6)的活性的棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬(Escherichia)細菌。此外，已知編碼YdeD蛋白的ydeD基因參與了 L-半胱氨酸途徑代謝產物的分泌(非專利文獻I)。此外，還已知通過增加mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex 基因、bmr 基因或 qacA 基因(專利文獻 7),或 emrAB、emrKY、yo jIH、acrEF、bcr 或 cusA基因的表達來提高L-半胱氨酸生產能力(專利文獻8)的技術，這些基因座/基因編碼適于從細胞分泌細胞毒性物質的蛋白質。此外，作為L-半胱氨酸生產細菌，還已知cysB基因編碼的半胱氨酸調節子的正向轉錄調控因子的活性增加的大腸桿菌(Escherichia coli)(專利文獻9).此外，還已知削弱了絲氨酸反饋抑制的編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA，并且提出通過將該突變型serA用于通過大腸桿菌進行的L-半胱氨酸生產(專利文獻10和 11)。盡管yciW作為編碼預測的氧化還原酶的基因登錄入數據庫EcoCyc (非專利文獻2)，但是其實際功能是未知的，并且其與L-半胱氨酸生產的關系也未知曉。此外，盡管已經報道了通過消除硫源(非專利文獻3)、糠醛(非專利文獻4)和氧化性應激(非專利文獻5)來上調yciW基因，但是在所有這些文獻中僅將其作為在微陣列實驗中顯示出表達變化的大量基因中的一員，并且尚未提示其與L-半胱氨酸生產的關系。現有技術參考專利文獻專利文獻I :日本特開2002-233384號公報專利文獻2 :日本特開平11-155571號公報
專利文獻3 :美國專利申請公開20050112731專利文獻4 :美國專利6，218，168專利文獻5 :日本特開2003-169668號公報專利文獻6 :日本特開2005-245311號公報專利文獻7 :美國專利5，972，663專利文獻8 :日本特開2005-287333號公報專利文獻9 :國際專利公開W001/27307專利文獻10 :美國專利5，856，148專利文獻11 :美國專利申請公開20050009162非專利文獻非專利文獻I :Dabler 等，Mol. Microbiol. ,36，1101-1112(2000)非專利文獻2 BioCyc 主頁，Escherichia coli K-12-substr. MG1655 Gene yciff[2009 年 10 月 14 日檢索]，網絡超鏈接〈http //biocyc. org/ECOLI/NEff-IMAGE type=GENE&object=G6640>非專利文獻3 Gyaneshwar, P.等，J. Bacteriol. , 187 1074-1090 (2005)非專利文獻4 :Elliot N. , Miller, E. N.,等，Appl. Envir. Microbiol.，10. 1128-/AEM. 01187-09(2009)非專利文獻5 :Wang, S.，等，Appl. Envir. Microbiol.，10. 1128/AEM. 00914-09(2009)

發明內容
發明所要解決的問題本發明的目的是通過開發提高細菌的L-半胱氨酸生產能力的新型技術，提供一種生產L-半胱氨酸的細菌以及一種生產L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質的混合物的方法。解決問題的手段本發明的發明人為了解決上述問題進行了各種研究，結果發現通過修飾細菌從而降低yciW基因編碼的蛋白質的活性可以提高細菌的L-半胱氨酸生產能力，從而完成了本發明。SP，本發明可以如下實施。(I) 一種屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細菌,其具有L-半胱氨酸生產能力，并且經過修飾從而降低了 yciW基因編碼的蛋白質的活性。(2)如上所述的細菌，其中所述蛋白質的活性是通過降低yciW基因的表達量或通過破壞所述基因而降低的。(3)如上所述的細菌，其中所述蛋白質為下述㈧或⑶中限定的蛋白質
0037](A)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質，(B)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列但包含一個或數個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述細菌中的活性降低時導致L-半胱氨酸生產能力改善的蛋白質。
(4)如上所述的細菌，其中所述yciW基因為下述(a)或(b)中限定的DNA (a)包含核苷酸序列SEQ ID NO :I中第301至1428位的核苷酸序列的DNA，(b)能夠與核苷酸序列SEQ ID NO 1中第301至1428位的核苷酸序列的互補序列或由所述核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，并且編碼在所述細菌中的活性降低時導致L-半胱氨酸生產能力改善的蛋白質的DNA。(5)如上所述的細菌，其還具有下述特性中的至少一種i)經過修飾從而提高了絲氨酸乙酰轉移酶活性，ii)經過修飾從而提高了 ydeD基因的表達，iii)經過修飾從而提高了 3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。(6)如上所述的細菌,其為埃希氏菌屬(Escherichia)的細菌。(7)如上所述的細菌,其為大腸桿菌(Escherichia coli)。(8) 一種L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物質的混合物的生產方法，該方法包括在培養基中培養上述細菌，并從所述培養基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質的混合物。(9)如上所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的衍生物為噻唑烷衍生物。發明效果根據本發明可以提高細菌的L-半胱氨酸生產能力。此外，根據本發明可以高效地制備L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質的混合物。本發明的
具體實施例方式〈1>本發明的細菌本發明的細菌為屬于腸桿菌科的細菌，其具有L-半胱氨酸生產能力，并且經過了修飾從而降低了 yciW基因編碼的蛋白質的活性。L-半胱氨酸生產能力在本文中是指，當在培養基中培養本發明的細菌時，該細菌在培養基中或細菌的細胞中生成L-半胱氨酸，并且積累達到可以從該培養基中或者該細胞中回收的量的能力。具有L-半胱氨酸生產能力的細菌是指，與野生株或者親本株相比可以在培養基中生產并積累更大量的L-半胱氨酸的細菌，優選可以在培養基中能夠生產并積累O. 05g/L以上、更優選O. lg/L以上、特別優選O. 2g/L以上的量的L-半胱氨酸的細菌。通過所述細菌生產的一部分L-半胱氨酸可以通過二硫鍵(disulfide bond)的形成在培養基轉化成L-胱氨酸。此外，S-磺基半胱氨酸可以如下文所述通過培養基中所含的L-半胱氨酸與硫代硫酸鹽的反應生成(Szczepkowski T. ff. , Nature, vol. 182(1958))。此外，在細菌細胞中生成的L-半胱氨酸可以與存在于細胞中的酮或醛如丙酮酸縮合，從而經由作為中間體的硫代半縮醛(hemithioketal)生成噻唑烷衍生物(參見日本特許第2992010號)。這些噻唑烷衍生物和硫代半縮醛可以作為平衡的混合物存在。因此，L-半胱氨酸生產能力并不局限于在培養基或細胞中僅積累L-半胱氨酸的能力，而是也包括在培養基中積累除了 L-半胱氨酸之外的L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物如S-磺基半胱氨酸、噻唑烷衍生物或硫代半縮醛或前述物質的混合物的能力。此外，L-半胱氨酸用作Y -谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸等的生物合成中的 起始原料。因此，通過使用除了具有生產L-半胱氨酸的能力之外還具有生產任何上述化合物的能力的細菌可以制備這些化合物。因此，L-半胱氨酸生產能力還包括經由L-半胱氨酸積累待生產的其他化合物的能力。具有L-半胱氨酸生產能力的細菌可以本來具有L-半胱氨酸生產能力，或者其可以通過用誘變或重組DNA技術修飾細菌，如下文所述的細菌，從而使該細菌獲得L-半胱氨酸生產能力而獲得。在本發明中，如果沒有具體說明，術語L-半胱氨酸可用于指還原型L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述那樣的衍生物、或者前述物質的混合物。對本發明中使用的細菌沒有特殊限制，只要是屬于如埃希氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和摩根氏菌屬(Morganella)等的腸桿菌科，并且具有生產L-氨基酸的能力的細菌即可。具體地，可以使用按照NCBI (美國國家生物技術信息中心，National Center forBiotechnologyInformation)數據庫中使用的分類歸入腸桿菌科的細菌(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgi id=91347)。作為用于修飾的屬于腸桿菌科的親本株，期望使用特別是埃希氏菌屬細菌、腸桿菌屬細菌、泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌、腸桿菌屬細菌、或克雷伯氏菌屬細菌。盡管對于埃希氏菌屬細菌沒有特別限制，但是具體而言，可以使用Neidhardt等的著作(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of somemutant derivativesof Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table I. In F. D. Neidhardt(ed. ), Escherichiacoli and Salmonella Cellular and MoIecularBiology/Second Edition, AmericanSociety for Microbiology Press, Washington, D. C.)中記載的細菌。在這些細菌中，例如可使用大腸桿菌。大腸桿菌的具體實例包括源自原型野生型K12菌株的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)和大腸桿菌 MG1655 (ATCC 47076)等。 這些菌株可從例如美國典型培養物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive, Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America)獲得。即，對每種菌株都給予了登錄號，并且可以使用這些登錄號訂購菌株(參考http://WWW. atcc. org/)。美國典型培養物保藏中心的目錄中列出了各菌株的登錄號。腸桿菌屬細菌的實例可以包括成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等,泛菌屬細菌的實例包括Pantoeaananatis。近年來，一些成團腸桿菌根據其16S rRNA的核苷酸序列的分析等重新分類為成團泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis 或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本發明中，只要是被分類為腸桿菌科的細菌，無論是屬于腸桿菌屬或者泛菌屬中任一屬的細菌均可使用。特別地，泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸桿菌屬細菌是分類為Y-變形細菌(Y -proteobacteria)的細菌，它們在分類學上的彼此非常接近(J Gen ApplMicrobiol1997 Dec ;43 (6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology,Oct. 1997, pl061-1067)。近年來，依據DNA-DNA雜交實驗等，一些屬于腸桿菌屬的細菌被重新分類為成團泛菌(Pantoea agglomerans)或 Pantoea dispersa 等(InternationalJournal of Systematic Bacteriology, Julyl989 ；39 (3). p. 337-345) 此外，一些屬于歐文氏菌屬的細菌被重新分類為菠蘿泛菌(Pantoea ananas)或斯氏泛菌(Pantoeastewartii)(參考 InternationalJournal of Systematic Bacteriology, Jan 1993 ；43(1). p. 162-173)。
腸桿菌屬細菌的實例包括成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。具體地,可以使用歐州專利申請公開952221號說明書示例的菌株。典型的腸桿菌屬的菌株包括成團腸桿菌ATCC12287株。典型的泛菌屬細菌的菌株包括Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成團泛菌、朽1 樣泛菌(Pantoea citrea)。Pantoea ananatis 的具體實例包括Pantoea ananatis AJ13355 株、SC17 株。SC17株是以作為低PH下能夠在含L-谷氨酸和碳源的培養基中增殖的菌株從靜網縣磐田市的土壤中分離出來的菌株AJ13355(FERM BP-6614)為起始，作為粘液質低生產突變株選擇出來的菌株(美國專利第6，596，517號)。Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通產省工 業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱為產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，保藏號為FERM P-16644，并于平成11年(1999年)I月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，并給予保藏號FERMBP-6614。而且,該菌株在分離時被鑒定為成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans),并當作成團腸桿菌AJ13355進行了保藏。但是，近年來，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，其被重新分類為 Pantoea ananatis Pantoea ananatis SC17株已于平成21年(2009年)2月4日保藏于產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，并給予保藏號FERM ABP-11091。歐文氏菌屬細菌的實例包括解淀粉歐文氏菌(Erwinia amyIovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora);克雷伯氏菌屬細菌的實例包括植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。下面，對于給屬于腸桿菌科的細菌賦予L-半胱氨酸生產能力的方法，或增強這些細菌的L-半胱氨酸生產能力的方法進行描述。為了向細菌賦予L-半胱氨酸生產能力，可以使用在棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬細菌等的選育中常規使用的方法。這些方法包括獲取營養缺陷型突變株、類似物抗性菌株或代謝調節突變株，或創建L-半胱氨酸生物合成系統酶過表達的重組菌株等等(參見《7 ^ 7酸発酵》，(株)學會出版中心，1986年5月30日第一版發行，第77-100頁)。這里，在L-半胱氨酸生產細菌的選育中，可以賦予上述性質例如營養缺陷性、類似物抗性和代謝調節突變中的一種、兩種或者三種以上。此外，表達被增強的L-半胱氨酸生物合成系統酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將例如營養缺陷性、類似物抗性和代謝調節突變等性質的賦予與生物合成系統酶的增強組合進行。具有L-半胱氨酸生產能力的營養缺陷突變體菌株、L-半胱氨酸類似物抗性菌株或代謝調節突變株可如下獲得對親本菌株或野生型菌株施以常規誘變處理，例如暴露于X-射線或UV照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等處理；其后，從所得的突變株中選擇顯示營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變并且還具有L-氨基酸生產能力的菌株。通過增強L-半胱氨酸生物合成途徑的酶，或，與生成如L-絲氨酸等作為該途徑的底物的化合物相關的酶，例如，3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸乙酰轉移酶等的活性，可以提高細菌的L-半胱氨酸生產能力。因為3-磷酸甘油酸脫氫酶受到絲氨酸的反饋抑制，所以通過使細菌攜帶有編碼該反饋抑制被削弱或消除了的突變型3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA基因，可以增強該酶的酶活性。此外，絲氨酸乙酰轉移酶受到L-半胱氨酸的反饋抑制。因此，通過使細菌攜帶有編碼該反饋抑制被削弱或消除了的絲氨酸乙酰轉移酶的突變型cysE基因，可以增強該酶的酶活性。L-半胱氨酸生產能力還可以通過提高編碼YdeD蛋白的ydeD基因(Dabler 等，Mol. Microbiol.，36，1101-1112(2000))或者編碼 YfiK 蛋白的 yfiK 基因(JapanesePatent Laid-open (公開)Νο· 2004-49237)的表達而增強。本發明的一個實施方案為具有以下特性中的至少一種i)經修飾從而提高了絲氨酸乙酰轉移酶活性，ii)經修飾從而提高了 ydeD基因的表達，iii)經修飾從而提高了 3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。此外，通過增強硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統的活性，也可以提高L-半胱氨酸的生產能力。硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統的蛋白質由cysPTWAM基因簇編碼(特開2005-137369 號公報，EP1528108 號說明書)。通過提聞yeaS基因的表達,也可以提聞細囷的L-半胱;氣酸生廣能力(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)。L-半胱氨酸生產細菌的實例可以列舉出、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，如用編碼反饋抑制抗性的絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)的多種cysE等位基因轉化的大腸桿菌JM15菌株(美國專利第6，218，168號)；具有編碼適于分泌細胞毒性物質的蛋白質的過表達基因的大腸桿菌W3110菌株(美國專利第5，972，663號)；半胱氨酸脫巰基酶(cysteinedesulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(日本特開平11-155571號公報)；和由cysB基因編碼的半胱氨酸調節子的正向轉錄調控因子活性增加的大腸桿菌W3110菌株(W001/27307);含ydeD基因，突變型cysE基因和突變型serA5基因的具有質粒pACYC_DES的大腸桿菌(日本特開2005-137369號公報(美國專利公開申請20050124049 (Al)、歐洲專利公開1528108(A1)))等。pACYC_DES為通過將上述三種基因插入pACYC184所得到的質粒，每個基因的表達通過PompA啟動子調控。作為具有大腸桿菌的半胱氨酸脫巰基酶活性的蛋白質，已知胱硫醚-裂合酶(metC 產物，日本特開平 11-155571 號公報，Chandra 等，Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 產物，日本特開 2003-169668 號公報，Austin Newton 等,J. Biol.Chem·，240(1965) 1211-1218))、O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B(cysM基因產物，日本特開2005-245311號公報)和maH基因產物(日本特開2005-245311)。通過降低這些蛋白質的活性提高了 L-半胱氨酸生產能力。在本發明中，L-半胱氨酸生產細菌優選具有對反饋抑制有抗性的突變型SAT。作為衍生自大腸桿菌的且對反饋抑制有抗性的突變型SAT，具體已知用谷氨酸殘基取代第256位的甲硫氨酸的突變型SAT(日本特開平11-155571號公報)、用異亮氨酸殘基取代第256位的甲硫氨酸殘基的突變型SAT (Denk, D. and Boeck, A. , J. generalMicrobiol.，133，515-525 (1987))、在第97位氨基酸殘基至第273位氨基酸殘基的區域具有突變或者缺失從第227位的氨基酸殘基開始的C端區域的突變型SAT(國際專利公開TO97/15673，美國專利6，218，168)、對應于野生型SAT第89至96位的氨基酸序列含有一個或多個突變并且對L-半胱氨酸的反饋抑制脫敏的突變型SAT(美國專利公開申請20050112731 (Al))、SAT第95和96位的Val殘基和Asp殘基分別用Arg殘基和Pro殘基取代的突變型SAT (突變型基因的名稱CysE5，W02005/007841)、在第167位的蘇氨酸殘基用丙氨酸殘基取代的突變(美國專利公開6，218，168，美國專利公開申請20050112731 (Al))，
坐坐寸寸οSAT基因不限于大腸桿菌的基因，而是可以使用編碼具有SAT活性的蛋白質的任何基因。已知對L-半胱氨酸的反饋抑制脫敏的擬南芥(Arabidopsisthaliana)的SAT同工酶不敏感，也可以使用編碼該同工酶的基因(FEMS Microbiol.Lett.，179，453-459(1999))。如果將編碼突變型SAT的基因引入細菌中，則賦予了 L-半胱氨酸生產能力。為了將基因引入細菌中，可以使用各種用于常見蛋白表達的載體。這種載體的實例包括 pUC 19、pUC 18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSFIOIO、pBR322、pACYC 184、pMW219 等。為了將重組載體引入細菌中，可以使用常用于細菌轉化的方法，如D.A.Morrison的方法(Methods in Enzymology, 68，326 (1979)),用氯化I丐處理受體細胞以增加細胞對DNA 的滲透性的方法(MandeI, M. and Higa, A.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))，和基于電穿孔的方法。此外，蛋白質如SAT的活性還可以通過增加編碼該蛋白質的基因的拷貝數來增力口。基因的拷貝數可以通過使用如上所述的載體將該基因引入細菌中來增加，或者通過將該基因的多個拷貝引入細菌的染色體DNA中來增加。通過同源重組使用在染色體DNA上以多個拷貝數存在的序列作為靶標引入基因的多個拷貝。在轉座子末端存在的重復DNA或倒置的重復可以用作染色體DNA上以多個拷貝數存在的序列。或者，如在特開平2-109985號公報中記載的，可以通過將多個拷貝的基因納入轉座子并將其轉移而引入染色體DNA中。生產從L-半胱氨酸作為起始材料生物合成的化合物如Y -谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的能力，還可以通過提高目標化合物的生物合成途徑的酶的活性或者通過減少從目標化合物的生物合成途徑分支出的途徑的酶或分解目標化合物的酶的活性而賦予或得到提高。例如，通過提高Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或通過降低谷胱甘肽合成酶活性可以提高生產Y-谷氨酰半胱氨酸的能力。此外，可以通過提高Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性來賦予或提高生產谷胱甘肽的能力。此外，通過使用對谷胱甘肽的反饋抑制有抗性的突變型Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶，可以提高生產Y -谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的能力。在Li等(Yin Li, Gongyuan Wei, Jian Chen, Appl.Microbiol. Biotechnol. ,66 :233-242(2004))的綜述中詳細記載了谷胱甘肽的生產。 生產L-甲硫氨酸的能力可以通過賦予L-蘇氨酸營養缺陷性或正亮氨酸抗性而賦予或提高(日本特開2000-139471號)。在大腸桿菌中，L-蘇氨酸的生物合成中涉及的酶的基因作為蘇氨酸操縱子(thrABC)存在，并且喪失了 L-高絲氨酸生物和下述化合物合成能力的L-蘇氨酸營養缺陷型菌株可以通過例如缺失thrBC部分而獲得。在正亮氨酸抗性菌株中，削弱了 S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，并且賦予或提高了生產L-甲硫氨酸的能力。在大腸桿菌中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因編碼的。生產L-甲硫氨酸的能力還可以通過缺失甲硫氨酸阻抑物或通過提高L-甲硫氨酸生物合成中涉及的酶如高絲氨酸轉琥珀酰基酶、胱硫醚Y-合成酶和天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II的活性而賦予或提高(特開2000-139471)。在大腸桿菌中，甲硫氨酸阻抑物是由metj基因編碼的，高絲氨酸轉琥珀酰基酶是由metA基因編碼的，胱硫醚Y -合成酶是由metB基因編碼的，天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II是由metL基因編碼的。此外，通過使用對L-甲硫氨酸的反饋抑制有抗性的突變型高絲氨酸轉琥珀酰基酶，還可以賦予或提高生產L-甲硫氨酸的能力(特開2000-139471號、US20090029424)。由于經由L-半胱氨酸作為中間體生物合成L-甲硫氨酸，生產L-甲硫氨酸的能力還可以通過提高生產L-半胱氨酸的能力得以提高(特開2000-139471號，US20080311632)。因此，對于賦予或提高生產L-甲硫氨酸的能力，賦予或增強生產L-半胱氨酸的能力也是有效的。L-甲硫氨酸生產菌和用于構建它們的親本株的具體實例包括如下的大腸桿菌，如AJl1539(NRRL B-12399),AJl1540(NRRL B-12400),AJl1541(NRRL B-I240I),AJl1542(NRRLB-12402)(英國專利2075055)，對作為L-甲硫氨酸類似物的正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125，俄羅斯專利 2209248)，和 73 菌株(VKPM B-8126，俄羅斯專利 2215782)。此外，作為L-甲硫氨酸生產菌或用于構建該菌的親本株，也可以使用源自大腸桿菌 W3110 的 AJ13425(FERM P-16808，特開 2000-139471 號)。AJ13425 是一種 L-蘇氨酸營養缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻抑物，削弱了胞內S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，且提高了胞內高絲氨酸轉琥珀酰基酶活性、胱硫醚Y-合成酶活性和天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II活性。AJ13425已于1998年5月14日保藏于通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6，日本)，并給予保藏號FERM P-16808。由于胱硫醚和高半胱氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途徑的中間體，部分使用上述用于提高生產L-甲硫氨酸能力的方法用于提高生產這些物質的能力是有效的。作為具體的提高生產胱硫醚能力的方法，已知有使用甲硫氨酸-營養缺陷型菌株(日本特愿2003-010654)的方法和將半胱氨酸(或用于其生物合成的原料)和/或高絲氨酸(或用于其生物合成的原料)添加至發酵培養物的方法(日本特開2005-168422)。由于通過使用胱硫醚作為前體生產了高半胱氨酸，因此上述用于提高生產胱硫醚能力的方法對于提高生產高半胱氨酸的能力也是有效的。由于L-甲硫氨酸是S-腺苷甲硫氨酸的前體，對于提高生產L-腺苷甲硫氨酸的能力，部分使用上述用于提高生產L-甲硫氨酸的能力的方法是有效的。例如，生產L-腺苷甲硫氨酸的能力可以通過提高甲硫氨酸腺苷基轉移酶(歐洲專利公開0647712和1457569)或者通過提高分泌因子MdfA (美國專利7，410，789)而賦予或提高。本發明的細菌可以通過修飾這種如上所述的屬于腸桿菌科并具有L-半胱氨酸生 產能力的細菌從而降低yciW基因編碼的蛋白質(下文也稱為“YciW”)的活性而得到。或者，在修飾細菌以降低YciW蛋白的活性后，可以賦予L-半胱氨酸生產能力。術語yciW基因與ECK1282和JW5200同義。表述“降低yciW基因編碼的蛋白質的活性”表示yciW基因編碼的YciW蛋白的活性與未經修飾的菌株如野生型菌株或親本株的活性相比是降低的，并且包括活性完全喪失的情形這種降低YciW蛋白的活性的修飾通過例如降低yciW基因的表達而實現。具體地，例如，蛋白質的胞內活性可以通過缺失染色體上部分或全部的yciW基因的編碼區而降低。YciW蛋白的活性還可以通過經由修飾表達調控序列如yciW基因的啟動子和Shine-Dalgarno (SD)序列等來降低yciW基因的表達而降低。此外,基因的表達量還可以通過修飾除表達調控序列之外的非翻譯區來降低。此外，可以缺失包括在染色體上所述基因兩側的序列的整個基因。此外，這還可以通過在染色體上yciW基因的編碼區中弓I入氨基酸取代(錯義突變)、終止密碼子(無義突變)或添加或缺失一個或兩個核苷酸的移碼突變來實現(Journal of Biological Chemistry, 272 :8611-8617 (1997) ；Proceedings of theNational Academy of Sciences, USA, 955511-5515(1998) ；Journal ofBiological Chemistry, 266，20833-20839 (1991))。此外，基因的表達還可以通過操作涉及表達調控的因子來減少(涉及轉錄或翻譯調控的低分子(誘導劑、抑制劑等)、蛋白質(轉錄因子等)、核酸(sRNA 等)，等)。此外，該修飾可以為通過基于X射線或紫外照射或使用如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍等誘變劑的常規誘變所引起的修飾，只要其為降低YciW蛋白活性的修飾即可。表達調控序列的修飾是對優選一個或多個核苷酸、更優選兩個或更多個核苷酸、特別優選三個或更多個核苷酸進行的。當編碼區域缺失時，待缺失的區域可以為N端區域、內部區域或C端區域中的任意區域，或者甚至可以為整個編碼區，只要降低或缺失了 YciW蛋白的功能即可。較長區域的缺失通常可以更加確定地失活基因。此外，優選待缺失區域的上游或下游的讀碼框不相同。此外，降低YciW蛋白活性的修飾還可以通過將另一序列插入yciW基因的編碼區來實現。當將另一序列插入yciW基因的編碼區中時，該序列可以插入該基因的任何區域，并且插入較長的序列可以更確定地失活該基因。優選的是插入位點的上游或下游的讀碼框不相同。對另一序列沒有特別限定，只要選擇其插入會降低或缺失YciW蛋白的功能的序列即可，并且實例包括攜帶抗生素抗性基因的轉座子或用于生產L-半胱氨酸的基因，等等。染色體上的yciW基因可以如上文所述進行修飾，通過例如制備缺失型基因，在該缺失型基因中缺失了基因的部分序列，使得該缺失型基因不生產正常發揮功能的YciW蛋白，并且用含有該缺失型基因的DNA轉化細菌以引起該缺失型基因和染色體上的基因之間的同源重組，并由此用該缺失型基因取代染色體上的基因。由缺失型基因編碼的YciW蛋白即使得到了生產也具有不同于野生型蛋白質的構型，并由此降低或缺失了該功能。這種基于使用同源重組的基因取代的基因破壞已經確立，并存在稱為“Red-driven整合”的方法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :6640-6645 (2000))、使用線性DNA的方法如使用Red driven整合并結合衍生自λ噬菌體的切除系統的方法(Cho, Ε. H. , Gumport, R. I. , Gardner, J. F. , J. Bacteriol. , 184 :5200-5203 (2002))(參見W02005/010175)、使用含溫度敏感復制起點的質粒的方法、使用能夠接合轉移的質粒的方法、使用在宿主中不具有復制起點的自殺載體的方法(美國專利6，303，383，日本特開平05-007491 號)，等等。
yciW基因的轉錄量的降低可以通過比較該基因轉錄的mRNA的量與在野生型菌株或未經修飾的菌株中觀察到的量得到確認。評估mRNA量的方法的實例包括Northern雜交、RT-PCR(Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold SpringHarbor, USA, 2001),等等。YciW蛋白量的降低可以通過使用抗體的Western印跡得到確認(Molecularcloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, USA, 2001)。大腸桿菌K12菌株的yciW基因對應于在NCBI數據庫中作為GenBank登錄號NC_000913(版本 NC_000913. 2 GI :49175990)登記的基因組序列中第 1347004 至 1348131位序列的互補序列。同樣地，YciW蛋白作為GenBank登錄號NP_415803 (版本NP_415803. 2GI :90111242,基因座標簽(l0Cus_tag) =〃bl287〃)登記。含yciW基因的核苷酸序列及其上游區和下游區的300bp和由該基因編碼的氨基酸序列分別顯示為SEQ ID NOS :1和2。由于yciW基因的核苷酸序列會由于細菌所屬的屬、種或菌株而不同，所以待修飾的yciW基因可以為SEQ ID NO 1的核苷酸序列中第301至1428的核苷酸序列的變體。yciW基因的變體可以通過使用BLAST (http //blast. genome, jp/)等參照SEQ ID NO :1的核苷酸序列進行檢索。此外，yciW基因的變體包括該基因的同源物，例如，可以使用例如微生物如屬于腸桿菌科的細菌和棒狀桿菌型細菌的染色體作為模板和基于SEQ ID N0:1的核苷酸序列制備的合成寡核苷酸通過PCR擴增的基因。除了大腸桿菌外的細菌的yciW基因同源物的實例包括下列細菌的yciW基因。在表I中，同一性(%)表示由BLAST確定的大腸桿菌K12菌株的YciW蛋白和各細菌同源物之間的同一性。登錄號為NCBI數據庫的登錄號。表I
權利要求
1.一種屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細菌,其具有L-半胱氨酸生產能力，并且經過修飾從而降低了 yciW基因編碼的蛋白質的活性。
2.根據權利要求I所述的細菌，其中所述蛋白質的活性是通過降低yciW基因的表達量或通過破壞所述基因而降低的。
3.根據權利要求I或2所述的細菌，其中所述蛋白質為下述(A)或(B)中限定的蛋白質 (A)具有SEQID NO 2中所不氣基酸序列的蛋白質， (B)具有SEQID NO :2中所示氨基酸序列但包含一個或數個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述細菌中的活性降低時導致L-半胱氨酸生產能力改善的蛋白質。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的細菌，其中所述yciW基因為下述(a)或(b)中限定的DNA (a)包含核苷酸序列SEQID NO : I中第301至1428位的核苷酸序列的DNA， (b)能夠與核苷酸序列SEQID NO :1中第301至1428位的核苷酸序列的互補序列或由所述核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，并且在所述細菌中的活性降低時導致L-半胱氨酸生產能力改善的DNA。
5.根據權利要求I至4中任一項所述的細菌，其還具有下述特性中的至少ー種 i)經過修飾從而提高了絲氨酸こ酰轉移酶活性， ii)經過修飾從而提高了ydeD基因的表達， iii)經過修飾從而提高了3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。
6.根據權利要求I至5中任一項所述的細菌,其為埃希氏菌屬(Escherichia)的細菌。
7.根據權利要求6所述的細菌,其為大腸桿菌(Escherichiacoli)。
8.—種L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物、或上述物質的混合物的生產方法，該方法包括在培養基中培養根據權利要求I至7中任一項所述的細菌，并從所述培養基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質的混合物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的衍生物為噻唑烷衍生物。
全文摘要
本發明提供一種生產L-半胱氨酸的細菌以及一種使用所述細菌生產L-半胱氨酸等的方法，通過開發新的技術用于改善細菌的L-半胱氨酸生產能力。通過在培養基中培養屬于腸桿菌科的細菌，所述細菌具有L-半胱氨酸生產能力并且經過修飾從而使得由yciW基因編碼的蛋白質如以下(A)或(B)定義的蛋白質的活性降低，并且從所述培養基中收集L-半胱氨酸、L-胱氨酸、所述氨基酸的衍生物或上述物質的混合物，生產出這些化合物(A)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質，(B)具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列但包含一個或數個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加，并且在所述細菌中的活性降低時導致L-半胱氨酸生產能力改善的蛋白質。
文檔編號C12N15/09GK102639691SQ20108005419
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月26日 優先權日2009年11月30日
發明者野中源 申請人:味之素株式會社