專利名稱：具有提高的生產丁醇能力的重組微生物和使用其生產丁醇的方法
技術領域：
本發明涉及具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，和使用其生產丁醇的方法。更具體來說，本發明涉及生產丁醇的能力通過操縱它們的代謝網絡而提高的重組微生物和使用其生產丁醇的方法。
背景技術：
近來油價上升引發了對替代燃料如生物燃料的越來越多的興趣。而且，對具有比乙醇更優異的物理性質的汽油替代品-丁醇有越來越多的興趣，因此對生產溶劑如丁醇作為代謝產物的梭菌種(Clostridium sp.)菌株也有越來越多的興趣。、已知梭菌種的微生物是革蘭氏陽性、嚴格厭氧的形成芽孢的細菌，并且主要產生乙酸和丁酸作為發酵產物。其中，一些菌株引發丙酮-丁醇-乙醇發酵(下文稱作ABE發酵)，該發酵除上述有機酸外還產生丙酮、丁醇和乙醇。實際上，在20世紀早期，作為這樣的菌株之一的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)被用于大量地生產丙酮和丁醇。這種大規模生產持續到1960年代和1970年代，但除了在一些國家外，這種生產都中斷了，因為由原油產生的丙酮和丁醇由于化學工藝的發展而變得廉價，以及難以供應底物。至今仍利用梭菌種菌株進行的生物丁醇生產產生以下問題。首先，與基于酵母的生物乙醇生產相比，其表現出顯著低的收率和生產效率。其次，梭菌種菌株除產生作為生物燃料的非常有價值的丁醇外，還產生副產物，包括丙酮、乙酸和丁酸，這提高了它們的分離成本。在產生溶劑的梭菌種菌株中，如同一般的微生物發酵，有機酸的產生在指數生長期發生。這個階段被稱為產酸階段。隨著靜止期到來，細胞代謝轉變為產溶劑階段，在此階段有機酸被再吸收并且產生溶劑如丙酮(或異丙醇)、丁醇和乙醇。這可以解釋如下。隨著靜止期到來，PH值降低，因此未解離有機酸的濃度增加。在這些酸中，未解離的丁酸表現出高細胞毒性。通過有機酸的這一再吸收以及轉化為溶劑，細胞獲得時間而形成可以在嚴酷環境下長期存活的芽孢。在野生型菌株中，發酵后以約為3:6:1的質量比產生丙酮、丁醇和乙醇，并且還產生痕量的乙酸、丁酸和乙偶姻。已知葡萄糖用作底物時，在最終濃度約10g/L時以約為20-25% 的質量收率生產丁醇(Lee 等人，Biotechnol. Bioeng.，101 (2) : 209-228，2008)。當采用這種野生型菌株生產丁醇時，存在產量及產率低以及難于從其它代謝產物中分離出丁醇的問題，因此增加了生產成本。為此，近年來，致力于基于基因工程知識和工具，利用按需操縱代謝路徑的代謝工程途徑來制作改進的菌株。對于丙醇丁醇梭菌，其產生代謝產物的路徑已長期為人所知，并且其基因組已被測序，且其相應的基因被全部鑒定(Nolling等人，J. Bacteriol. 2001)。丁醇生產中問題最大的代謝物是丙酮。如果使用氣提進行溶劑分離，那么丙酮和丁醇作為混合物被分離，因為不像有機酸，它們都容易蒸發，因此需要額外的分離過程。乙酰乙酰-CoA通過CoA移轉酶和乙酰乙酸脫羧酶轉化成丙酮。這些酶分別由基因CtfAB和adc表達。所以，通過刪除一種或多種這些基因，丙酮在溶劑中的濃度可以被降低。根據最近的報道，發現刪除adc可以降低丙酮濃度，確實可以降低丙酮比例(Jiang等人，Metab.Eng.，11(4-5):284-291，2009)。而且，在梭菌種的情況下，有這樣的例子，其中通過單交換插入質粒刪除表達磷酸轉乙酰酶的基因Pta(磷酸轉乙酰酶為乙酸生產路徑的酶)和表達丁酸激酶的基因buk (Green 等人，Microbiology. 142:2079-2086,1996)。但是,有報道，當刪除編碼丁酸激酶的基因buk時，丁醇濃度增加至約16g/l，但是當刪除編碼磷酸轉乙酰酶的pta基因時，丁醇的濃度為9. 9g/l，表明丁醇的濃度和丁醇的選擇性沒有實質的增長。W02008/052973公開了其中丁酸生產路徑和乙酸生產路徑被阻斷的菌株，以及其中丁酸生產路徑、丙酮生產路徑和乙酸生產路徑被阻斷的菌株。但是，必須阻斷丁酸生產路徑，因此，當僅刪除乙酸生產路徑時，無法確定產生丁醇的能力是否增加。另外，W02008/052973公開了基于buk或ptb的刪除的各種基因組合的刪除，但其實例示出的僅為通過刪除buk基因獲得的已知的結果，并且該專利文件公開了涉及刪除各種基因組合的實例。換言之，該專利文件總體上僅提出了基于buk或ptb刪除的可能的各種基因組合的刪除，并沒有提供科學實驗基礎，但這不可能確定這些刪除能否有助于實際丁醇生產中濃度、收率、選擇性等的提高。所以，根據迄今為止的報道，沒有證據顯示pta刪除有助于提高丁醇的濃度和產量。此外，因為沒有關于Pta刪除的信息，所以不清楚在刪除了 pta的突變菌株中刪除buk會有預期的結果。而且，如果參與丁酸生產的buk基因和參與乙酸生產pta基因都被刪除，可以預期將不會產生丁酸或乙酸，因此丁醇的收率將提高(W02008/052973)，但這不是令人期待的結果(參見以下詳細說明)。由此，本發明人發現，當在梭菌種的微生物中刪除編碼將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的基因時，丁醇的選擇性和收率提高，表明該微生物生產丁醇的能力提高，從而完成了本發明。另外，本發明人構建出這樣的微生物，其通過在刪除了Pta的突變菌株中刪除buk基因，高濃度、高收率和高選擇性地生產丁醇，該突變菌株中具有改進的丁醇選擇性和收率并擴增了醛/醇脫氫酶,并發現,該構建的微生物能夠高濃度、高收率和高選擇性地生產丁醇，從而完成了本發明。而且，本發明人構建了這樣的菌株，其通過在刪除了 pta和buk且擴增了醛/醇脫氫酶的突變菌株中刪除編碼丁酸激酶的bukll基因，高濃度、高收率和高選擇性地生產丁醇，且不會顯著產生有機酸，并已證實該菌株生產丁醇的能力，從而完成了本發明。此外，本發明人構建了這樣的菌株，其通過在刪除了 pta、buk和bukll且擴增了醛/醇脫氫酶的突變菌株中刪除編碼CoA移轉酶(CoAT)的CtfB基因，高濃度、高收率和選擇 性地生產丁醇，且不會顯著產生有機酸，并且證實了該菌株生產丁醇的能力，從而完成了本發明
發明內容
本發明的目的是提供以高效率選擇性地生產丁醇，同時減少副產物的產生的重組微生物，以及該重組微生物的制備方法。本發明的另一目的是提供使用所述重組微生物生產丁醇的方法。為了實現以上目的，本發明提供了用于制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，該方法包括，在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，刪除將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的編碼基因。本發明還提供具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，編碼將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的基因被刪除。本發明還提供具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在梭菌種的微生物中，編碼磷酸轉乙酰化酶的基因(eutD或pta)或編碼乙酸激酶的基因(askA或ackA)被刪除。本發明還提供重組微生物丙醇丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC824 A eutD、丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 AeutD Abuk PptbAdh、丙醇丁醇梭菌 ATCC 824AeutD Abuk PthlAdh*、丙醇丁醇梭菌ATCC 824 AeutDAbuk AbukII PthlAdh*和丙醇丁醇梭菌ATCC 824 AeutD Abuk AbukII A ctfBPthlAdh*，它們都具有提高的生產丁醇的能力。本發明還提供生產丁醇的方法，包括以下步驟培養所述重組微生物以生產丁醇；和從培養基回收生產出的丁醇。本發明的其它特征和實施方式將從隨后的詳細的說明書以及所附權利要求而更明顯。
圖I是丙醇丁醇梭菌菌株的代謝網絡。圖2是根據本發明的一種實施方式制備的基因缺失的載體(pCACKO)的基因圖譜。圖3是根據本發明的一種實施方式制備的質粒PlMPlPbAdhEl的基因圖譜。
具體實施例方式在本發明中，在圖I中所示的丙醇丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的代謝網絡中刪除乙酸合成路徑，并檢驗重組菌株生產丁醇的能力是否提高。在本發明的一個實例中，通過從丙醇丁醇梭菌ATCC 824刪除編碼磷酸轉乙酰化酶的基因來構建重組微生物，所述編碼磷酸轉乙酰化酶的基因參與乙酰CoA到乙酸的轉化，并且確認了該重組微生物生產丁醇的能力提高。在一方面，本發明涉及用于制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，該方法包括在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，刪除將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的編碼基因，以及本發明涉及通過所述方法制備的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物。如本文所使用的，術語“生物合成路徑”是指包括由細胞中的特定代謝物合成目的化合物的路徑，而不只限于通過相關過程(糖酵解)提供的碳來合成目的化合物的路徑。如本文所使用的，術語“刪除”是指包括突變、替換或刪除目的基因的一部分，或將、一個或多個堿基引入該基因，或引入抑制目的酶的表達或活性從而抑制該酶活性的基因、酶或化學物質。因此，刪除特定基因的方法不限于任何特定方法，只要該特定目的基因的活性以及由該基因編碼的酶的活性被常規方法抑制，所述常規方法包括通過反義RNA的表達抑制、同源重組、通過各種重組酶U重組酶等)表達的同源重組、以及利用逆轉錄酶和RNA的特定序列插入。在本發明中，“具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑”不僅指菌株原本具有該生物合成路徑，而且還指外源基因通過包括重組和基因組重排在內的技術被引入。在本發明中，具有乙酰Cok和丁酰Cok生物合成路徑的宿主微生物可生產選自丙酮、乙醇、丁醇和異丙醇中的一種或多種。在本發明中，宿主微生物可源自梭菌種，但不限于此，只要其具有編碼參與乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的酶的基因。梭菌種微生物的實例包括丙醇丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、丁基梭菌(Clostridium butylicum)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、酪丁基梭菌(Clostridium tyrobutylicum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)等。在本發明中，僅示例了丙醇丁醇梭菌ATCC 824作為來自梭菌種的宿主微生物，但丙醇丁醇梭菌 M5、1NYG、4NYG、5NYG 和 DGl (Stim-Herndon, K. P.等人，Biotechnol. /Food Microbiol. ,2:11，1996)，丙醇丁醇梭菌 ATCC 824IV 型、M3、M5、2_BB R、2_BB D、Rif B12、Rif DIO、Rif F7 和丙醇丁醇梭菌 ATCC 860 (Clark, S. W.等人，Appl. Environ.Microbiol.，55:970，1989)也可用于本發明。在本發明中，將乙酰CoA轉化成乙酸的酶可為磷酸轉乙酰化酶或乙酸激酶，編碼磷酸轉乙酰化酶的基因可為eutD或pta,并且編碼乙酸激酶的基因可為askA或ackA。在本發明中，刪除基因的方法沒有特別限定，只要抑制由目的基因編碼的酶的活性。在一種實施方式中，在通過雙交換進行同源重組的方法中，將抗生素抗性基因插入具有目的基因的堿基序列的基因片段中以使該基因片段失活，之后將失活的基因片段引入微生物菌株中使得在染色體中的目的基因和失活的基因片段之間發生雙交換重組，由此在微生物的染色體中的目的基因失活。在另一種實施方式中，在利用逆轉錄酶和RNA插入特定序列的方法中，在目的基因中發現逆轉錄酶結合位點，之后，通過逆轉錄酶和在RNA轉錄位點表達的RNA的復合物，將部分RNA插入目的基因中，由此可以抑制目的酶的活性，從而使目的基因失活，該RNA轉錄位點被與結合位點相鄰的序列所替代。在本發明的一個實例中，構建了磷酸轉乙酰化酶的編碼基因(eutD)被刪除的重組微生物，并證實，所構建的重組微生物具有提高的生產丁醇的能力。在本發明的另一實例中，通過以下方式構建重組微生物(A)在磷酸轉乙酰化酶 的編碼基因(eutD)被刪除的重組微生物中，刪除分別編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的磷酸轉乙酰化酶和丁酸激酶的基因(Ptb)或基因(buk/bukll)，和(B)擴增該重組微生物中的醛/醇脫氫酶，證實了所構建的重組微生物具有提高的生產丁醇的能力和降低的生產丙酮、丁酸和乙酸的能力。此外，構建了其中(C)編碼CoA移轉酶(CoAT)的CtfA或CtfB被刪除的重組微生物，并證實了所構建的重組微生物具有高濃度、高收率和高選擇性地生產丁醇而基本不產生有機酸的能力。因此，在本發明中，制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法包括在分別編碼將乙酰CoA轉化成乙酸的磷酸轉乙酰化酶和乙酸激酶的eutD(pta)和ack基因中的一種或多種被刪除的微生物菌株中，刪除選自以下的一種或多種基因(a)編碼分別將乙酸和丁酸轉化成乙酰CoA和丁酰CoA、并將乙酰乙酰CoA轉化成乙酰乙酸的酶的基因，(b)編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的磷酸轉乙酰化酶的基因，和(C)編碼丁酸激酶的基因；以及擴增該菌株中的醛/醇脫氫酶。 分別將乙酸和丁酸轉化成乙酰CoA和丁酰CoA、并將乙酰乙酰CoA轉化成乙酰乙酸的酶是CoA移轉酶，并且編碼CoA移轉酶的基因是CtfAB或atoDA。編碼將丁酰Cok轉化成丁酸的磷酸轉乙酰化酶的基因是ptb。編碼丁酸激酶的基因是選自buk和buk II的一種或多種。編碼醛/醇脫氫酶的基因是adhEl或adhE2，該基因的實例還包括其突變體。具體來說，該突變體優選含有在由adhEl編碼的蛋白質(SEQ ID N0:51)的氨基酸殘基450-650中的一個或多個突變。在本發明的再一實例中，通過在其中編碼磷酸轉乙酰化酶的基因(eutD)被刪除的重組微生物中刪除編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的酶的基因(buk和/或bukll)來構建重組微生物，以及，通過在該重組微生物進一步刪除編碼CoA移轉酶的CtfA或CtfB來構建重組微生物。此外，通過將編碼乙醛/乙醛脫氫酶的基因(adhEl)引入所構建的重組微生物中來構建重組微生物。證實了所構建的重組微生物具有提高的生產丁醇的能力和降低的生產丙酮的能力。因此，本發明涉及制備重組微生物的方法，該方法包括在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，刪除編碼轉化乙酰CoA的酶的基因和編碼將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的基因，然后在該宿主微生物中引入或擴增選自編碼I)乙醇脫氫酶、2)乙醛脫氫酶、和3)乙醛/乙醛脫氫酶的基因的一種或多種基因，并且本發明涉及由上述方法制備的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物。編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的酶的基因可為編碼磷酸轉乙酰化酶的基因(ptb)或編碼丁酸激酶的基因(buk、bukll)。本發明還涉及制備重組微生物的方法，該方法包括在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，刪除編碼將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的基因，然后在該微生物中進一步刪除編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的酶的基因，在該微生物中進一步刪除編碼CoA移轉酶的基因，和在該微生物中擴增編碼乙醛/乙醛脫氫酶的基因，并且本發明涉及由上述方法制備的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物。編碼乙醇脫氫酶的基因可為adh，編碼乙醛脫氫酶的基因可為aid，以及編碼乙醛/乙醛脫氫酶的基因可為adhEl。adhEl基因可以各種形式擴增，從而提高微生物生產丁醇的能力。這里，所述各種形式包括利用Ptb啟動子、buk啟動子、thl啟動子或類似物控制表達的時間點和表達水平，包括利用原型啟動子，并且還包括突變adhEl。
在另一方面，本發明涉及具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在梭菌種微生物中，編碼磷酸轉乙酰化酶的基因(eutD或pta)或編碼乙酸激酶的基因(askA或ackA)被刪除。具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的實例包括丙醇丁醇梭菌ATCC824 AeutD。在再一方面，本發明涉及具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在梭菌種微生物中，編碼磷酸轉乙酰化酶的基因(eutD或pta)或編碼乙酸激酶的基因(askA或ackA)被刪除，以及在該梭菌種微生物中，選自I)編碼丁酸轉乙酰酶的基因(ptb)或編碼丁酸激酶的基因(buk和/或bukll)和2)編碼CoA移轉酶的基因(ctfAB或atoDA)的基因進一步被刪除。具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的實例包括丙醇丁醇梭菌ATCC 824 AeutD Abuk A bukll (丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 AeutD A buk)、丙醇丁醇梭菌 ATCC 824AeutD Abuk ActfB。在又一方面，本發明涉及具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在梭菌種微生物中，編碼磷酸轉乙酰化酶的基因(eutD或pta)或編碼乙酸激酶的基因(askA或ackA)被刪除，以及在該梭菌種微生物中，選自I)編碼丁酸轉乙酰酶的基因(ptb)或編碼丁酸激酶的基因(buk和/或bukll)和2) CoA移轉酶編碼的基因(ctfAB或atoDA)的基因被進一步刪除，以及其中在該重組微生物中醛/醇脫氫酶被擴增。具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的實例包括丙醇丁醇梭菌ATCC 824AeutD Abuk PptbAdh、丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 AeutD A bukPthlAdh* 和丙醇丁醇梭菌ATCC 824 AeutD Abuk AbukII ActfB PthlAdh*。在進一步的方面，本發明涉及生產丁醇的方法，包括以下步驟培養所述重組微生物以生產丁醇；和從培養基回收生產出的丁醇。在本發明中，培養重組微生物以及回收乙醇和丁醇的工藝可以利用發酵工業中已知的常規培養方法和乙醇/丁醇分離/純化方法進行。此外，丁醇和乙醇的回收通常在培養工藝完成后進行，但乙醇和丁醇還可在培養工藝期間利用氣提法(Thaddeus等人，Bioprocess Biosyst. Eng. , 27:207, 2005)或類似方法回收以提高乙醇和丁醇的生產。換句話說，進行培養工藝，同時回收該培養工藝期間產生的乙醇和丁醇也落入本發明內。實施例下文，將參考實施例進一步詳細描述本發明。對本領域技術人員來說明顯的是，這些實施例僅為示例的目的，并不解釋為限制本發明的范圍。具體來說，在以下實施例中，丙醇丁醇梭菌ATCC 824示例作為根據本發明將基因從其中刪除的宿主菌株。但是，對本領域技術人員來說明顯的是，即使當使用了梭菌種的其它微生物或其它種的微生物時，相同的基因在具有乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主菌株中被刪除，并且所得菌株用于生產乙醇和丁醇。實施例I:包含突變IoxP位點和抗生素抗性標記的載體的構建在丙醇丁醇梭菌的情況下，紅霉素抗性基因(下文稱作Enf)主要用作載體的抗生素抗性標記物。對于通過雙交換重組進行的基因刪除，需要額外的抗生素抗性標記物以選擇其中發生了雙交換的菌株。因此，將利用丙醇丁醇梭菌的硫解酶啟動子表達氯霉素/甲砜霉素抗性標記物(下文稱作Thlr)的pSOS95-Cm用作PCR的模板。pSOS95_Cm可以通過將ATCC 824菌株的硫解酶啟動子克隆到pSOS95 (Nair和Papoutsakis, J. Bacteriol.,176:5843-5846,1994)并將氯霉素/甲砜霉素抗性基因克隆到該啟動子的下游來構建。而且，通過雙交換刪除基因后，應除去插入的抗生素抗性標記物以刪除其它基因。為此目的，將突變的IoxP序列加入PCR擴增IV時使用的引物中。而且，為了連接到載體中，將限制酶位點SphI和XbaI的序列GCATGC和TCTAGA分別加入到引物中。最終的引物序列如SEQ ID NO: I和2所示。
[SEQ ID N0S: I]:5_’ AATTGCATGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCACACGGTTTAACGACTTAATTACG-3’[SEQ ID N0S: 2]:5’-ATATTCTAGAACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCATGATTACGAATTCTATGAGTCGAC-3’使用上述模板和引物進行PCR擴增，由此獲得同時包含突變IoxP位點和Thlr的PCR產物。將由此獲得的PCR產物和pUC18質粒用Sphl/Xbal消化，然后彼此連接，由此制備載體PMBK0T2。載體pMBK0T2用于構建包含IoxP-Thr-IoxP部分和pMBK0T2的同源臂的KO盒。實施例2: pCACKO載體的構建通過同源重組進行的基因刪除通常使用不在細胞中復制的質粒進行。但是，在丙醇丁醇梭菌的情況下，已知的是，轉化比例比在大腸桿菌(E. coli)中的轉化比例低得多，并且不易于發生同源重組。為此，優選使用可復制的質粒。因此，使用實施例I中構建的pMBK0T2和可在丙醇丁醇梭菌中復制的穿梭載體pIMPl (Nair和Papoutsakis,J. Bacteriol.，176:5843-5846，1994)構建可以刪除特定基因的載體。除XmaI夕卜，pMPl中的限制酶序列是不合適的，因為它們消化pMBK0T2的IoxP-Thr-IoxP序列的內部。為此，將pMBK0T2和pMPl中都不存在的限制酶序列NcoI加入pIMPI 中。PCR 擴增利用位于 pUC18 (GenBank ID:L08752. I)的約 300 個堿基對(L08752. I的1155-1468)作為模板以及如下引物(SEQ ID N0:3和4)來進行。NcoI的堿基序列包含于SEQ ID NO:3的引物中。[SEQ IDNOS: 3]:5’-AAAACTGCAGCCATGGTCGCCAGTTAATAGTTTGCG-3’[SEQ ID N0S:4]:5，-AAAACCCGGGCGCCGCATACACTATTCTCA-3’由此獲得的PCR產物和pMPI用Ncol/Xmal消化，然后彼此連接，由此構建pCACKO載體。基于該載體，構建了刪除基因的載體。測試例I:利用pCACKO刪除目的基因的方法將目的基因(eutD、ctfB、buk或bukll)與甲砜霉素標記物擴增并連接到實施例2中構建的pCACKO載體中，載體被甲基化并通過電穿孔轉化到丙醇丁醇梭菌ATCC 824菌株中(Mermelstein 和 Papoutsakis, Appl. Environ. Microbiol.，59 (4) : 1077-1081,1993)。將轉化的菌株在2x YTGS培養基(16g/L bacto胰蛋白胨、10g/L bacto酵母提取物、4g/L NaCl、2g/L葡萄糖、15g/L可溶淀粉，pH 6.8)中傳代培養，同時將其鋪板在含甲砜霉素的2xYTG瓊脂(16g/L bacto胰蛋白胨、10g/L bacto酵母提取物、4g/L NaCl、5g/L葡萄糖、15g/L 瓊脂，pH 5.8)上。通過菌落PCR檢查從該板獲得的各個菌落以確認IV標記物是否成功地插入目的基因的ORF中。當基因兩側的重組都確實發生了時，在進行變性測試以確認參與溶劑生產的 pSOLl 沒有丟失(Scotcher 和 Bennett, J. Bacteriol.，187 (6) : 1930-1936，2005)后，將該菌落培養并鋪板。將所得菌株在2x YTGS培養基中傳代培養30代以上以除去所使用的pCACKO載體，之后將其鋪板在含有Th的2x YTG瓊脂上并在含有紅霉素(Em)的2xYTG瓊脂上復制。然后，選擇沒有顯示出Enf的若干菌落，然后以上述相同方式進行變性測試，最終選擇其中沒有丟失PS0L1的菌落。
測試例2:表達Cre重組酶的載體的構建在測試例I中目的基因被刪除后，制備表達Cre重組酶的載體以除去作為抗生素抗性標記物插入該基因中的甲砜霉素抗性基因。為了制作表達Cre重組酶的載體，使用pS0S95 (GenBank ID:AY187686. I)作為母體載體進行操作，pS0S95包括丙醇丁醇梭菌的硫解酶基因的啟動子。ere基因不適于使用，因為BamHI位點存在于該基因的ORF序列中。為此，利用丙醇丁醇梭菌的染色體DNA作為模板以及SEQ ID NO: 5和6的引物來擴增包含核糖體結合位點和XbaI位點的鏈。然后，將擴增的產物和PS0S95用BamHI/Narl消化，然后利用T4連接酶彼此連接，從而構建pS0S95-X載體。[SEQ ID NO:5]:5’-GCATGGATCCAGAATTTAAAAGGAGGGATTAAATCTAGAATGATAAGAAGCATGACGGGATTTG-3’[SEQ ID NO:6]:5’-GCATGGCGCCTCACTCTATATTTTGAATTTGTTCTC-3’為了擴增 ere 基因，利用 pJW168 (Palmeros 等人，Gene，247:255 264，2000))作為模板以及SEQ ID NO: 7和8的引物進行PCR擴增。然后，將擴增的產物和pS0S95_X用XbaI/NarI消化，然后利用T4連接酶彼此連接，從而構建pS0S95del-cre載體。[SEQ ID N0:7]:5’-GCAATCTAGAATGTCCAATTTACTGACCGTACA-3’[SEQ ID N0:8]:5’-GCATGGCGCCCTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3’測試例3:利用pS0S95del_cre將插入基因中的抗生素抗性標記物去除通過電穿孔法將實施例2中構建的2pS0S95del-Cre轉化到丙醇丁醇梭菌ATCC824重組菌株中，其中目的基因以與測試例I中相同的方式被刪除。將轉化的菌株在2xYTGS培養基中傳代培養3-5代，然后鋪板在2xYTG瓊脂上。隨著菌落生長，將它們復制到含有Th的2x YTG瓊脂上，并且選擇失去Thlr的菌落。然后，通過菌落PCR利用所刪除的基因的內部/外部引物檢查所選擇的菌落以基于擴增的基因的長度差異來確認IV的去除。對由此選擇的菌落進行如測試例I的變性測試，并選擇沒有失去pSOLl的菌落。經驗證的菌落以與測試例I相同的方式傳代培養，并選擇失去了 pS0S95del-Cre但沒有失去PS0L1的菌落。根據以上方法獲得的菌株不具有抗生素抗性標記物，因此可以用于進行其它基因的刪除，而不會改變現存載體的標記物。實施例3:乙酸生產路徑受到阻斷的菌株的構建為了刪除參與乙酸生產路徑的eutD基因，分別利用SEQ ID N0:9和10的引物對以及SEQ ID NOS: 11和12的引物對來擴增包含eutD的ORF的鏈(NCBI RefSeqID:NC_003030. I 的 1890304-1890770 和 1890831-1891380)。這里，作為將擴增的序列，選擇沒有NcoI和XmaI的模板。發現，每個擴增的產物中所含的ORF的兩部分沒有彼此重疊且具有相同的取向。而且，為了在兩個鏈之間插入標記物，利用SEQ ID N0:13和14的引物來擴增包含IoxP-Thlr-IoxP的pMBK0T2的部分。[SEQ ID N0S:9]:5’-CTAGCCATGGAGCATATGGGAGTGTGCTAAG-3’[SEQ ID NOS:10]:5’-CGGCCAACGCTCGCAGTCAGGTATTATCAT-3’[SEQ ID NOS:11]:5’-GCGAATGGCGAGATGAACTAGCTGATATTGCTATAA-3’
[SEQ ID N0S:12]:5’-ACGTCCCGGGCGAGTACAGTTTCATCCTTCATATC-3’[SEQ ID N0S:13]:5’-CTGACTGCGAGCGTTGGCCGATTCAT-3’[SEQ ID N0S:14]:5’-TAGTTCATCTCGCCATTCGCCATTCA-3’利用該三個擴增的鏈作為模板以及SEQ ID N0:9和12的引物進行重疊PCR，從而獲得一條鏈。將由此獲得的最終PCR產物和實施例2中制備的pCACKO (K0載體)用NcoI/XmaI消化，然后彼此連接，從而構建pCACKO-eutD載體。將該構建的載體甲基化，然后通過電穿孔轉化到丙醇丁醇梭菌ATCC 824菌株中。將轉化的菌株在2x YTGS介質中傳代培養，同時將其鋪板在含有甲砜霉素的2x YTG瓊脂上。通過菌落PCR以及SEQID N0:16和SEQ IDNO: 17和18的各引物對來檢查從該板獲得的菌落以確認Thlr標記物是否成功地插入eutDORF 中。[SEQ ID N0S:15]:5’-GAGGATAAAGAATATACGCAGG-3’[SEQ ID N0S:16]:5’-TTGCCGTCCTAAACTCTGAA-3’[SEQ ID N0S:17]:5’-CTTCCTTTGGCAATTCAAGTTC-3’[SEQ ID NOS:18]:5' -GTGGATTATGAAGCGGTGCA-3’當在基因兩側上的重組確實發生時，將菌落進行培養并鋪板，之后對其進行變性測試以驗證沒有失去參與溶劑生產的pSOLl。經驗證的菌株在2x YTGS培養基中傳代培養超過30次，之后將其鋪板在含有Th的2xYTG瓊脂上并在含有紅霉素(Em)的2x YTG瓊脂上重復，并選擇若干沒有顯示Enf的菌落。對所選擇的菌落進行與上述相同方式的變性測試,并最終選擇沒有失去pSOLl的菌落。然后，將pS0S95del_cre以與測試例3中相同的方式轉化到最終選擇的菌株中以除去插入該基因的甲砜霉素抗性基因。將該菌株傳代培養以除去pS0S95del-cre，從而制備最終的菌株(丙醇丁醇梭菌ATCC 824 A eutD)，該最終的菌株對抗生素如甲砜霉素和紅霉素敏感，像野生型菌株，且其中eutD基因被刪除。實施例4:通過額外的基因刪除和基因擴增來產生的重組菌株為了在丙醇丁醇梭菌ATCC 824 A eutD菌株中刪除選自buk、bukll和ctfB的一種或多種基因，在實施例2中制備的作為宿主微生物的菌株(丙醇丁醇梭菌ATCC 824AeutD)中，將該基因以與實施例中相同的方式刪除，從而制備重組微生物。此外，將表達乙醛/乙醛脫氫酶的丙醇丁醇梭菌ATCC 824的adhEl基因引入相應的菌株中。為了刪除額外的基因，使用以下序列SEQ ID N0:19至36。具體來說，為了刪除buk基因，使用序列SEQ ID NO: 19至24，并且為了刪除bukll基因，使用序列SEQ ID N0:25至30。此外，為了刪除ctfB基因，使用序列SEQ ID N0:31至36。
[SEQ ID NOS:19]:5’-CTAGCCATGGATGTATAGATTACTAATAATC-3’[SEQ ID NOS:20]:5’-CGGCCAACGCCTATTTCATTTGCAATAATTC-3’[SEQ ID NOS:21]:5’-GCGAATGGCGCCAAGAAAAAGTATATTCCATG-3’[SEQ ID NOS:22]:5’-ACGTCCCGGGCTTCTCCTCTTAAAACTCTAAG-3’[SEQ ID NOS:23]:5，-ATTGCAAATGAAATAGCGCCATTCGCCATTCA-3’[SEQ ID NOS:24]:5’-TATACTTTTTCTTGGGCGTTGGCCGATTCAT-3’[SEQ ID NOS:25]:5’-CTAGCCATGGGGACTTTATTATGAAATTTAAAC-3’[SEQ ID NOS:26]:5’-CGGCCAACGCCACTATATATGCTGACACTCC-3’、[SEQ ID NOS:27]:5’-GCGAATGGCGCTGGAATACCTGAACTTCCTAG-3’[SEQ ID NOS:28]:5，-ACGTCCCGGGAACCCTTAAGGTTCCTTCTGC-3’[SEQ ID NOS:29]:5，-GTCAGCATATATAGTGCGCCATTCGCCATTCA-3’[SEQ ID NOS:30]:5’-AGTTCAGGTATTCCAGGCGTTGGCCGATTCAT-3’[SEQ ID NOS:31]:5’-CTAGCCATGGTCCCTATATGGCAATGGCAGC-3’[SEQ ID NOS:32]:5，-CGGCCAACGCTTAGGACTAGCGCCCATTCC-3’[SEQ ID NOS:33]:5，-GCGAATGGCGGGAGGAGACTATACAACAGTAC-3，[SEQ ID NOS:34]:5’-ACGTCCCGGGTTCTTTCTAAACAGCCATGGGTC-3’[SEQ ID NOS:35]:5，-GGGCGCTAGTCCTAACGCCATTCGCCATTCA-3’[SEQ ID NOS:36]:5，-TTGTATAGTCTCCTCCGCGTTGGCCGATTCAT-3，通過PCR利用SEQ ID NO:37和38的引物來擴增丙醇丁醇梭菌ATCC824的adhEl基因。將PCR產物在pMPlexter載體的ptb基因啟動子和ctfB轉錄終止子之間克隆。將PCR產物和pMPlexter載體用Sall/EcoRI限制酶消化，然后彼此連接。將pMPlexter的Ptb啟動子利用SEQ ID NO:39和40引物擴增，并克隆到pIMPl的PstI和SalI限制酶位點(Nair 和 Papoutsakis，J. Bacteriol. ,176:5843-5846，1994)中。利用 SEQ ID NO:4142的引物擴增終止子序列，并將該終止子序列克隆到已將ptb啟動子克隆到其中的載體的EcoRI和NdeI限制酶位點，從而制備pIMPlexter。通過以下方式構建pTHL_Adh* :通過重疊PCR將利用SEQ ID NO: 43和44引物擴增的片段和利用SEQ ID NO: 45和46引物擴增的片段連接到pTHLl-Cm載體，然后將該片段克隆到該載體的PstI和Aval限制酶位點中。突變Adh*是通過以下方式制備的人工重組蛋白質將利用SEQ ID NO: 43和46引物擴增的adhEl片段克隆到pTHLl-Cm載體中，利用NTG在該片段中引起突變，然后篩選。在利用NTG的突變Adh的篩選中，在SEQ ID NO:51的氨基酸序列的氨基酸殘基450-650中具有一個或多個突變的那些提高了丁醇的生產。本實施例中使用的Adh*是通過利用序列SEQ ID N0:43至46復制在庫中最聞頻率變異的一種而獲得。[SEQ ID NOS:37]:5，-ATAGTCGACATGAAAGTCACAACAGTAAAGG-3’[SEQ ID NOS:38]:5’-CGCGAATTCTTAAGGTTGTTTTTTAAAACA-3’[SEQ ID NOS:39]:5，-TATCTGCAGTGTGGATGGAGTTAA-3’[SEQ ID N0S:40]:5’-ATTGTCGACTTTAATCCCTCCTTT-3’[SEQ ID N0S:41]:5’-CGCGAATTCGGGCCCATATCCAATGAACTTAGACC-3’[SEQ ID N0S:42]:5’-CACCATATGGCCTAGAGCTGAAGTTAT-3’[SEQ ID N0S:43]:5’-AAAACTGCAGTTTATGAAAGTCACAACAGTAAAGG-3’
[SEQ ID N0S:44]:5’-TAAATTATAGGGGTCACTACCAGTAACTATAAAGGCTC-3’[SEQ ID N0S:45]:5’-GAGCCTTTATAGTTACTGGTAGTGACCCCTATAATTTA-3’[SEQ ID N0S:46]:5’-CCCCCGGGGGGTTGAAATATGAAGGTTTAAGGTTG-3’結果，制得了以下菌株丙醇丁醇梭菌ATCC 824 AeutD A buk A bukll，丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 AeutD Abuk A ctfB,丙醇丁醇梭菌 ATCC824 AeutD Abuk PptbAdh,丙醇丁醇梭菌 ATCC 824 AeutD Abuk AbukIIPthlAdh* 和丙醇丁醇檢菌 ATCC 824 AeutDAbuk AbukII ActfB PthlAdh*。為了對比，以如下方式制備pTHLl-Cm載體。
以如下方式制備用于包含丙醇丁醇梭菌的硫解酶啟動子和核糖體結合位點(RBS)的外源蛋白質表達的穿梭載體。已知的是，硫解酶可以連續且穩定地表達基因，而不會受細胞生長周期顯著影響(Tummala 等人，Appl. Environ. Microbiol.，65:3793 3799,1999)。因此，在本實施例中，將硫解酶頂部的啟動子(NCBI基因ID:1119056)克隆并插入到pMP-Hldel中。pMP-Hldel是穿梭載體，其具有作為模板的pMPl，并通過在具有兩個HindIII限制酶的pMPl中除去3408位置HindIII位點同時留下在pMPl的743位置的限制酶位點來獲得。利用丙醇丁醇梭菌ATCC 824菌株的總DNA作為模板以及SEQ ID NO:47和48的引物通過PCR來擴增硫解酶啟動子。純化并回收擴增的硫解酶啟動子片段，之后用HindIII和PstI限制酶對其處理，并與經相同限制酶處理的pMP-Hldel穿梭載體連接，從而構建PTHLl載體。[SEQ ID N0S:47]:5’-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3’[SEQ ID N0S:48]:5’-AAACTGCAGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3’此外，利用pS0S95-Cm以及SEQ ID NO: 49和50的引物通過PCR來擴增氯霉素抗性基因。純化并回收擴增的基因片段，之后用HindIII限制酶對其處理，并與經相同限制酶處理的PTHLl穿梭載體連接，從而構建pTHLl-Cm載體。pS0S95_Cm可以通過將ATCC 824菌株的硫解酶啟動子克隆到PS0S95 中(Nair 和Papoutsakis，J. Bacteriol.，176:5843-5846，1994)并將氯霉素/甲砜霉素抗性基因克隆到該啟動子的下游來構建。[SEQ ID N0:49]:5，-CCAAGCTTCGACTTTTTAACAAAATATATTG-3，[SEQ ID NO:50]:5’-CCAAGCTTGACATTAAAAAAATAAGAGTTACC-3’[SEQ ID NO:51]:MKVTTVKELDEKLKVIKEAQKKFSCYSQEMVDEIFRNAAMAAIDARELAKAAVLETGMGLVEDKVIKNHFAGEYIYNKYKDEKTCGIIERNEPYGITKIAEPIGVVAAIIPVTNPTSTTIFKSLISLKTRNGIFFSPHPRAKKSTILAAKTILDAAVKSGAPENIIGWIDEPSIELTQYLMQKADITLATGGPSLVKSAYSSGKPAIGVGPGNTPVIIDESAHIKMAVSSIILSKTYDNGVICASEQSVIVLKSIYNKVKDEFQERGAYIIKKNELDKVREVIFKDGSVNPKIVGQSAYTIAAMAGIKVPKTTRILIGEVTSLGEEEPFAHEKLSPVLAMYEADNFDDALKKAVTLINLGGLGHTSGIYADEIKARDKIDRFSSAMKTVRTFVNIPTSQGAS⑶LYNFRIPPSFTLGCGFWGGNSVSENVGPKHLLNIKTVAERRENMLWFRVPHKVYFKFGCLQFALKDLKDLKKKRAFIVTDSDPYNLNYVDSIIKILEHLDIDFKVFNKVGREADLKTIKKATEEMSSFMPDTIIALGGTPEMSSAKLMWVLYEHPEVKFEDLAIKFMDIRKRIYTFPKLGKKAMLVAITTSAGSGSEVTPFALVTDNNTGNKYMLADYEMTPNMAIVDAELMMKMPKGLTAYSGIDALVNSIEAYTSVYASEYTNGLALEAIRLIFKYLPEAYKNGRTNEKAREKMAHASTMAGMASANAFLGLCHSMAIKLSSEHNIPSGIANALLIEEVIKFNAVDNPVKQAPCPQYKYPNTIFRYARIADYIKLGGNTDEEKVDLLINKIHELKKALNIPTSIKDAGVLEENFYSSLDRISELALDDQCTGANPRFPLTSEIKEMYINCFKKQP
實施例5:利用重組菌株生產乙醇對含有IOml CGM培養基(表I)的30ml測試管進行消毒，用氮氣填充并在厭氧室中冷卻到室溫。然后,將實施例3中制備的重組微生物(丙醇丁醇梭菌ATCC 824 A eutD)接種到該測試管中并在厭氧條件下在37°C預培養，直到其達到在600nm的I. 0的吸光度。[表 I]
權利要求
1.一種制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，該方法包括，在具有こ酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，刪除編碼將こ酰CoA轉化成こ酸的酶的基因。
2.根據權利要求I的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，該方法包括進ー步刪除基因，該基因選自(a)編碼分別將こ酸和丁酸轉化成こ酰CoA和丁酰CoA、并將こ酰こ酰CoA轉化成こ酰こ酸的酶的基因，和( b)編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的酶的基因。
3.根據權利要求I或2的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，該方法包括進ー步擴增選自編碼I)こ醇脫氫酶、2)こ醛脫氫酶和3)こ醛/こ醛脫氫酶的基因的ー種或多種基因。
4.根據權利要求3的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，其中編碼こ醇脫氫酶的基因是adh，編碼こ醛脫氫酶的基因是aid，以及編碼こ醛/こ醛脫氫酶的基因是 adhEl。
5.根據權利要求3的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，其中こ醛/こ醛脫氫酶具有SEQ ID N0:51本身，或SEQ ID NO:51的450和650氨基酸序列之間的ー 個或多個突變。
6.根據權利要求I的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，其中所述宿主微生物源自梭菌種。
7.根據權利要求I的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，其中將こ酰CoA轉化成こ酸的酶是磷酸轉こ酰化酶或こ酸激酶。
8.根據權利要求7的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，編碼磷酸轉こ酰化酶的基因是eutD或pta，且編碼こ酸激酶的基因是askA或ackA。
9.根據權利要求2的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，其中分別將こ酸和丁酸轉化成こ酰CoA和丁酰CoA、并將こ酰こ酰CoA轉化為こ酰こ酸的酶是CoA移轉酶，并且其中將丁酰CoA轉化成丁酸的酶是磷酸轉こ酰化酶或丁酸激酶。
10.根據權利要求9的制備具有提高的生產丁醇能力的重組微生物的方法，編碼CoA移轉酶的基因是ctfAB或atoDA，并且編碼磷酸轉こ酰化酶的基因是ptb，并且編碼丁酸激酶的基因是選自buk和bukll的ー種或多種基因。
11.ー種具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在具有こ酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的宿主微生物中，編碼將こ酰CoA轉化成こ酸的酶的基因被刪除。
12.根據權利要求11的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在該重組微生物中進ー步刪除基因，該基因選自(a)編碼分別將こ酸和丁酸轉化成こ酰CoA和丁酰CoA、并將こ酰こ酰CoA轉化成こ酰こ酸的酶的基因，和(b)編碼將丁酰CoA轉化成丁酸的酶。
13.根據權利要求11或12的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中重組微生物進ー步擴增選自編碼I)こ醇脫氫酶、2)こ醛脫氫酶、和3)こ醛/こ醛脫氫酶的基因的ー種或多種基因。
14.根據權利要求13的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中編碼こ醇脫氫酶的基因是adh，編碼こ醛脫氫酶的基因是aid，且編碼こ醛/こ醛脫氫酶的基因是adhEl。
15.根據權利要求13的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中所述こ醛/こ醛脫氫酶具有SEQ ID N0:51本身，或SEQ ID NO:51的450和650氨基酸序列之間的ー個或多個突變。
16.根據權利要求11的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中所述宿主微生物源自梭菌種。
17.根據權利要求11的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中將こ酰CoA轉化成こ酸的酶是磷酸轉こ酰化酶或こ酸激酶。
18.根據權利要求17的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，編碼磷酸轉こ酰化酶的基因是eutD或pta，且編碼こ酸激酶的基因是askA或ackA。
19.根據權利要求12的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中分別將こ酸和丁酸轉化成こ酰CoA和丁酰CoA、并將こ酰こ酰CoA轉化為こ酰こ酸的酶是CoA移轉酶，以及其中將丁酰CoA轉化成丁酸的酶是磷酸轉こ酰化酶或丁酸激酶。
20.根據權利要求19的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，編碼CoA移轉酶的基因是ctfAB或atoDA，并且編碼磷酸轉こ酰化酶的基因是ptb，并且編碼丁酸激酶的基因是選自buk和bukll的ー種或多種基因。
21.—種具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中在梭菌種的微生物中，編碼磷酸轉こ酰化酶的基因(eutD或pta)或編碼こ酸激酶的基因(askA或ackA)被刪除。
22.根據權利要求21的具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，其中具有提高的生產丁醇能力的重組微生物是丙醇丁醇梭菌ATCC 824 A eutD (丙醇丁醇梭菌eutD)。
23.具有提高的生產丁醇能力的重組微生物丙醇丁醇梭菌ATCC824 AeutD AbukPptbAdh0
24.具有提高的生產丁醇能力的重組微生物丙醇丁醇梭菌ATCC824 AeutD AbukPthlAdh*。
25.具有提高的生產丁醇能力的重組微生物丙醇丁醇梭菌ATCC824 AeutD AbukAbukII PthlAdh*。
26.具有提高的生產丁醇能力的重組微生物丙醇丁醇梭菌ATCC824 AeutD AbukAbukII ActfB PthlAdh*。
27.一種生產丁醇的方法，包括以下步驟培養權利要求11、12和16-26的重組微生物以生產丁醇；和從培養基回收生產出的丁醇。
28.一種生產丁醇的方法，包括以下步驟培養權利要求13的重組微生物以生產丁醇；和從培養基回收生產出的丁醇。
全文摘要
本發明涉及具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，和使用其生產丁醇的方法。更具體來說，本發明涉及生產丁醇的能力通過操縱它們的代謝網絡而提高的重組微生物和使用其生產丁醇的方法。該具有提高的生產丁醇能力的重組微生物包括在具有參與乙酰CoA和丁酰CoA生物合成路徑的酶的編碼基因的宿主微生物中，編碼將乙酰CoA轉化成乙酸的酶的基因被刪除。通過操縱微生物的代謝流獲得的重組微生物能夠以高選擇性地生產丁醇，因此可用作用于生產工業溶劑和運輸燃料的微生物。
文檔編號C12P7/16GK102666839SQ201080052858
公開日2012年9月12日 申請日期2010年9月21日 優先權日2009年9月22日
發明者張維新, 樸軫煥, 李相燁, 李真英, 李鐘民 申請人:Gs 加德士公司, 生物普爾肯株式會社, 韓國科學技術院