專利名稱：基于dna疫苗和嵌合體病毒的誘導抗登革熱病毒的免疫應答的方法、試劑盒、質粒和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于DNA疫苗和17D嵌合體病毒的聯合免疫或共同施藥免疫的誘導抗登革熱的免疫應答的方法。在本發明的范圍內還包括抗四種登革熱亞型的DNA疫苗，其來自包含編碼蛋白E的序列、或者僅由相應這個蛋白的區域III的序列的不同的重組質粒的構建，蛋白E來自每個登革熱病毒亞型(DENV1-4)。包含在保護范圍內的疫苗組合物包含
(a)抗四個登革熱病毒亞型的DNA疫苗，來自構建的從包含蛋白E基因或包含 僅對應于該蛋白區域III的序列的不同的重組質粒，蛋白E來自每個登革熱病毒亞型，它們都融合到質粒編碼人組織纖溶酶原激活子(t-PA)的信號肽的序列中；
(b)包含由感染克隆粘附技術修飾的黃熱病疫苗病毒17D的嵌合體病毒，編碼來自不同亞型的登革熱病毒的編碼蛋白prM和E的序列取代黃熱病毒的蛋白prM和蛋白E的序列；
(c)藥學上可接受的載體，
本發明還涉及試劑盒，包含(a)來自構建的不同重組質粒抗登革熱病毒亞型的DNA疫苗，重組質粒包含編碼來自不同登革熱病毒亞型的E蛋白的基因，或僅相應于該蛋白區域III的序列，所有這些序列融合到編碼人組織纖溶酶原激活子(t-PA)的信號肽的序列中；和(b)包含由感染性克隆粘附技術(infectious clone attainment technology)修飾的黃熱病毒疫苗病毒17D的嵌合體病毒，由編碼不同亞型的登革熱病毒的蛋白prM和E編碼的序列替代黃熱病毒蛋白PrM和E的序列。
背景技術：
在由蟲媒病毒導致的疾病之中，基于在人群中的致病率和死亡率的重要性，登革熱被認為是全球主要公共衛生問題之一，尤其是在熱帶和亞熱帶地區。它的致病原是登革熱病毒，其是由伊蚊屬傳播的，通常是由埃及伊蚊傳播。登革熱病毒(DENV)屬于黃病毒屬,黃病毒家族。存在4個從抗原學上和病原學上不同的病毒類型DENV1、DENV2、DENV3、DENV4。即使由登革熱病毒導致的原發感染誘導對感染亞型的免疫，然而并不存在抗其它病毒類型的長期交叉保護，導致不同登革熱病毒的繼發感染。登革熱病毒是由病毒包膜和復合到RNA分子的核殼組成。它的基因組包含大約10，700核苷酸和由具有陽極的單鏈RNA組成，其編碼黃病毒科蛋白的多肽前體。這個前體由細胞蛋白酶切斷，由病毒蛋白酶生長三個結構蛋白，C(殼體)、prM(膜前體)、和E(包膜)，和七個非結構蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。該翻譯的結構蛋白參與成熟的感染性病毒粒子，其非結構蛋白參與病毒復制和發展。在絕大多數的黃病毒中，登革熱病毒E蛋白(包膜)是被糖基化的結構蛋白和轉膜蛋白。這個E蛋白是在這些病毒表面發現的主要糖蛋白成分，具有大約55到60kDa的分子量，由493至501個氨基酸組成。E蛋白參與大量重要的生物活動。E蛋白作為結合蛋白，與細胞表面的受體結合，介導與宿主細胞膜的病毒膜的融合。這種蛋白還與核包膜相關，在病毒侵入時發揮重要作用。另外，E蛋白是一種強免疫原，在感染病毒的患者體內產生高抗體水平，其可以是中和過程，結合抗原決定簇，其與細胞受體作用，阻止病毒進入宿主細胞(Chang，1997; Kinney &Hung, 2001)。E蛋白是由伸長的平行延伸到病毒膜的二聚體形成。每個單體是由三個域組成域I、域II和域III。域I是中心部分，由120個氨基酸殘基組成1-51、133-193、279-296。域II是伸長的，包含由分子內部多個點聯結的兩個單體形成二聚體的區域。區域II包含以下氨基酸殘基52-132、194-280。區域III是位于碳末端的部分，代表免疫球蛋白，它的功能是結合到細胞受體上，比如，存在于未成熟的樹狀細胞的DC-SIGN。病毒/細胞的結合是通過區域III促進病毒顆粒吞噬作用介導的。區域III包含氨基酸殘基298-394。抗原決定簇在這個區域內能夠介導類型和亞類型特異性中和抗體反應。
進行大量的疫苗以對抗登革熱，然而，沒一個建議的方法代表大量疫苗的所需特性，比如對抗不同的循環病毒亞型的安全和長期的保護免疫反應。發展疫苗原型的一個主要困難是包含誘導對抗四種登革熱病毒亞型的保護性免疫，但不會產生繼發后果，例如，出血熱以及盡可能使用最低數量或劑量。在發展減毒的四價疫苗上已經進行了相當的努力。最有希望的這些侯選存在于通過細胞培養途徑的減毒病毒。這些疫苗在臨床評價階段。然而，早已注意到一些并發癥。而且，存在可從基因回復或重組發生的病毒嚴重感染的潛在風險，很難去按配方制造多價的活減毒疫苗，因為在病毒復制階段中存在同源或異源干擾的可能性(Barret，2001;Kinney& Huang, 2001)。另一個用于發展對抗登革熱病毒的疫苗的戰略是構建嵌合體。這個技術已用于大量的對抗黃病毒的疫苗的研究中，包含登革熱病毒(Galler et al.，2005)。即使目前獲得的進展，仍然存在巨大的挑戰生產能夠對抗四種登革熱病毒亞型的產生同源反應的疫苗。DNA疫苗在控制感染的試劑的疫苗的發展中代表有效的技術。這個技術包含包含有抗興趣的抗原的真核表達質粒的接種，其在通過接種的生物體細胞體內合成，通過組織相容性復合物I和II (MHC I和II)表征，激活特異性免疫反應。通過宿主細胞的抗原的內源性表達似乎刺激了天然的病毒感染，能夠同時產生具有抗體生成的體液免疫反應，和具有細胞毒性的T淋巴細胞介導的細胞反應。免疫反應的這兩個形式的介導主要地或專門地產生抗體應答，并相比于減活疫苗的細胞反應，不具有帶來感染原的病原形式的反轉的風險，提供了相比于亞株疫苗的優勢。另外，DNA疫苗在溫度范圍內穩定，具有大規模生產的更低成本和允許去經評估的序列的快速選擇。最近，幾個研究組已分析了在控制黃病毒方面的DNA疫苗的使用。與這個病毒家族不同的病毒的某些研究顯示出在接種編碼黃病毒蛋白PrM和E的質粒(Phillpotts etal. , 1996; Kochel et al. , 1997;; Raviprakash et al, 2000)之后鼠類和非人類的靈長類動物中黃病毒特異性的保護免疫反應的引導。某些分析還使用包含黃病毒非結構性蛋白基因的DNA疫苗，例如日本腦炎、肝炎和登革熱病毒(Lin et al.，1998; Encke etal. , 1998; Wu et al. , 2003; Costa et al. , 2006, 2007)。最近的研究表明，包含編碼蛋白prM和E、DENVl-4病毒域III區域的基因的全序列的DNA疫苗能夠在鼠模型中產生對抗登革熱的體液免疫反應。然而，在這些研究中DNA疫苗的保護潛力僅是非直接地評估(血清中和試驗和細胞反應)，沒有實施直接的挑戰檢測在給予致死劑量的登革熱病毒而評估這種疫苗的效力(Chen et al.，2007)。通過經登革熱病毒挑戰的動物中的病毒血評估，在非人類的靈長類中檢測一些對抗登革熱的DNA疫苗(Aotus 和 Rhesus)提供了部分保護(Raviprakash et al. , 2000; Putnak et al. , 2003;Blair et al. , 2006)。關于免疫方法，本發明人強調，Putnak et al (2003)發展出一種包含其從DENV2中編碼蛋白PrM和E的基因的DNA疫苗，在鼠類和進一步免疫的獼猴類中觀察它的免疫原性。在免疫后的七個月，動物顯示出不再對抗登革熱病毒的保護。這樣，我們可以注意到到這些研究表明增加免疫反應的長度的新策略的需要。并且最近，有跡象表明DNA疫苗結合其它疫苗比相同的單獨施藥能夠產生更有效的免疫反應。 專利申請W02008/127307，出版于10/23/2008，指出對抗登革熱病毒的免疫應答方法使用初始免疫/加強免疫方法。而且特別地，W02008/127307指出包含DNA疫苗或4-價DNA疫苗純化滅活的疫苗和后續登革熱病毒免疫原劑量的加強免疫的登革熱病毒免疫原的施藥包含4-價滅活的登革熱病毒疫苗，比如，例如在其它病毒的體內復制中，一個或多個病毒干擾的可能性，如此導致不同病毒亞型的異種免疫反應。另外，文獻還指出包含編碼登革熱蛋白的基因的腺病毒的使用作為4價疫苗的加強劑，其可能意味著介導在人體內對抗登革熱免疫反應的低效價。這個現象是由于在人體內的對抗腺病毒的在先免疫反應的存在，其可以阻止攜帶登革熱病毒基因的載體腺病毒的感染，繼而影響對抗登革熱病毒的免疫應答的效力。于08/14/2008出版的專利申請US20080193477，一種采用包含在嵌合體黃病毒為基礎的登革熱疫苗后的第一黃熱疫苗的施藥的免疫方案。然而，在文獻中的其它報導顯示，黃熱疫苗病毒的免疫方法可以影響由包含登革熱病毒基因的黃熱嵌合體病毒的免疫繼而產生的免疫應答的效力。在這種情況下，在猴群中對抗登革熱病毒的中和抗體水平比在先接種抗黃熱病毒的猴群中顯著下降(Galler et al.，2005)。如在這里討論的，我們確信不論已作出的努力，仍然有必要發展更有效的DNA疫苗，能夠介導增強的免疫應答，以及使用提高這些免疫應答的聯合疫苗策略的使用的需求。
發明內容
本發明的目的在于提供一種基于DNA和嵌合體病毒17D疫苗聯合給藥或共同給藥的免疫作用的抗登革熱病毒的介導免疫應答的方法。本發明的目的還在于提供抗四種登革熱病毒亞型的DNA疫苗組合物，來自包含編碼來自登革熱病毒的每個病毒亞型(DENV1-4)的E蛋白的基因的不同的重組質粒的構建的四種登革熱病毒，或僅僅是相應于這些蛋白的域III的序列，所有這些序列融合到編碼信號肽t-PA的序列中。在本發明的目的中包含疫苗的組分由(a)來自不同重組質粒的構建的抗四種登革熱病毒亞型的DNA疫苗，不同的重組質粒包含編碼來自登革熱病毒的每個病毒亞型的E蛋白的基因，或僅是相應于這些蛋白的區域III的序列，所有的這些序列融合到編碼信號肽t-PA的序列；以及(b)嵌合體病毒，包含修飾的黃熱疫苗病毒17D，其序列編碼黃熱蛋白prM和E，被編碼不同的病毒亞型的登革熱病毒蛋白prM和E的序列所替代，藥學上可接受的載體組成。本發明進一步提供試劑盒包含(a)來自從構建的包含E蛋白基因，或僅包含相應于每個登革熱病毒亞型的這些蛋白的區域III的序列的不同的重組質粒的抗四種登革熱病毒亞型的DNA疫苗；以及(b)嵌合體病毒，包含經修飾的黃熱疫苗病毒17D，其由編碼不同亞型的登革熱病毒蛋白prM和E的序列替代編碼黃熱病毒蛋白prM和E的序列。
圖I 是顯示質粒 pcTPA, pElD2 and pE2D2 的圖；、 圖2是顯示由質粒pElD2 (A和A')、pE2D2 (B和B')和pcTPA (C和C')轉染的細胞BHK-21的免疫熒光圖，其中狀態對照顯示在A、B和C中，熒光顯示在A'、B'和C'中(1000XA和B，400 XC的增加)；
圖3A-3B是顯示pElD2的第一次試驗的結果 圖3C- 3D是顯示pElD2的第二次試驗的結果 圖4A-4B是顯示pE2D2的第一次試驗的結果 圖4C-4D是顯示pE2D2的第二次試驗的結果 圖5A- 是顯示pElD2，pE2D2, 17D-D2的同時聯合的第三次試驗的結果圖。
具體實施例方式本發明者發現在目前發展水平中登革熱病毒包膜蛋白(E)是一種強免疫原，能夠產生高水平的中和抗體的保護性應答。如此，本發明的第一個目標是發展抗登革熱病毒的DNA疫苗，其包含編碼蛋白E的沒有疏水性C末端區域，或包含插入到質粒pcTPA的這些蛋白區域III的序列，其具有人體組織血漿酶原活動子(t-PA)的信號序列。本發明還具有建立介導抗登革熱病毒的保護性免疫應答的方法的目的，基于在初免/加強免疫系統中或兩種疫苗聯合給藥的DNA疫苗和嵌合體病毒17D疫苗的聯合免疫。質粒pcTPA包含相應于人體組織血漿酶原活動子基因的信號肽(t-PA)的DNA序列。作為信號肽被識別的t-PA區域具有不同的大小。描述t-PA基因的克隆和測序的文獻(Pennica et al. , Nature, 301:214-221，1983)識別105個堿基配對的區域，其編碼第一個35個氨基酸，作為信號肽。質粒pcTPA包含69個堿基對序列，其相應于第一個23個氨基酸SEQ ID N0:8。對應于t-PA的信號肽的序列在質粒pcDNA3 (Invitrogen)中使用限制性內切酶和&oRV位點克隆。這樣，在EcoRV位點下游的任何序列將被克隆，使用這個酶的位點，其產生盲端片段；然而，結合到另一個片段上，也是一個盲端，不必需要經EcoRV消化。另外在這個位點，質粒pcTPA在EcoRV的下游保有五個限制性酶位點iBstW,Not\, Xhol, Xbal和如al),從質粒pcDNA3多克隆位點,其還可用于新序列的克隆。為了不同重組質粒的構建，包含編碼沒有其疏水C末端部分(E80%)-SEQ ID NO:6-的蛋白E的序列，或僅有對應于這個蛋白的區域III-SEQ ID NO :7 —的序列，使用NewGuinea C (NGC) DENV2 (M29095; gi :323447)的譜系。這種病毒從受感染的Vero細胞培養中獲取。在質粒pcTPA中克隆的基因E片段從受DENV2 NGC感染的Vero細胞的總DNA中經PCR放大。RNA作為合成包含靶區域的cDNA的模板，使用特異性寡核苷酸。該cDNA接著作為靶序列經PCR放大的模板，使用其它寡核苷酸包含了克隆中使用的限制性內要酶的位點。經放大的片段在瓊脂凝膠電泳中分辨，進一步收集，經樹脂純化(基因清潔(geneclean))。獲取的片段，如質粒pcTPA，經特異性限制性內切酶消化，結合T4 DNA連接酶。重組克隆在大腸桿菌DH5-a菌株中獲取，經這些質粒轉染，由限制性內切酶消化，進一步地經測序列確認。為了評價如上所述獲取的重組質粒的能力，介導沒有C末端部分的疏水區域(E80%)，或它的區域111(域III)的蛋白E的表達，在體外使用經不同質粒轉染的BHK-21細胞實施表達分析檢測這些蛋白。重組質粒從質粒pcTPA中獲取，其由質粒pcDNA3 (Invitrogen)中構建。這種載體在人細胞巨化病毒(CMV)啟動子下促進重組蛋白的表達，包含編碼人體組織血漿酶原的信號肽(t-PA)的序列，其將這些蛋白引入到細胞外空間。為了評價所感興趣的蛋白的生產，BHK-21細胞培養經重組質粒轉染，使用脂質體轉染法(lipofectamine)，根據制造商的說明指導。重組蛋白的表達是經免疫熒光法分析，如 Costa SM et al. , 2006中所描述。為了重組質粒的大規模生產和控制,大腸桿菌,使用菌株DH5_a {E. coli bacteria, strain DH5_ a )經不同的質粒轉染,在液體TB培養基中培養，37°C過夜。質粒在陽離子交換柱中使用由制造商推薦的QIAGEN tip 10. 000試劑盒經純化，在水中懸浮，在分光光度計和瓊脂凝膠電泳中定量。DNA疫苗儲存在_20°C，直至使用。本發明的DNA疫苗在分離基礎上檢測其保護性能力。這些檢測易于分析重組蛋白在體外表達的效力，評價在鼠類中產生的抗體應答，并實施致死劑量的病毒的大腦內接種的挑戰性檢測。血清中和檢測如同Cafour et al.，2001中所述用前述的病毒在Vero細胞中實施。為了評估獲取的構建，大約四個星期大的雄BALB/C鼠群經重組質粒組和對照組免疫。鼠在后腿四頭肌部位經過肌肉內(im)途徑用溶解在PBS中的這些質粒接種。在每個接種中，每個動物注射IOOPg的DNA (每條腿50呢)。在這個發明的新免疫方法中，例如，初免疫(DNA疫苗)和加強免疫(嵌合體病毒)系統或同時免疫(共同施藥)，本發明的DNA疫苗在嵌合體病毒(17D-D2)中聯合免疫。這種嵌合體是由黃熱疫苗病毒YF 17D用DENV2菌株NGC，SEQ ID NO :9的prM和E的基因取代編碼prM和E蛋白的基因而構建成的。值得強調的是，這種新免疫方法是從DENV2 DNA疫苗的構建開始，并且挑戰性檢測其是實施這些疫苗的保護性能力的介導，尤其是當序列編碼沒有疏水C末端部分的E基因時。為了嵌合體17D-D2的構建，使用Rice et al.，1989開發的黃熱感染cDNA方法，其由兩個質粒組成pYF5’ 3’ IV和pYFM5. 2。在這個方法中，考慮到在高復制數量質粒中一些病毒序列缺乏穩定性，黃熱病毒基因組在前述兩種方法中分離。這些質粒經特異性限制內切酶消化，產生的片段結合，重新組成黃熱病疫苗病毒全基因組。然而，為獲取更減毒的病毒(Marchevsky et al. , 1995),在猴子中用這個病毒的檢測表明需要對于cDNA進行基因修飾。如此的修飾通過Galler和Freire (US 6，171，854)的方法實施，導致質粒pYF5，3，IV和pYFM5. 2的新版本，分別命名為G1/2和T3/27。隨后，使用質粒pACNR1180(Ruggli et al., 1996)，其具有限制這個質粒的復制數量的復制源(P15A)，從而減少在細菌中質粒DNA的拷貝數量。質粒pACNR1180在克隆豬瘟病毒基因組時被認為是理想的質粒，其大小類似于黃熱病毒基因組，保證克隆基因組的穩定性，黃熱病毒的全基因組在經修飾的PACNR1180質粒中克隆(去除某些限制性內切酶位點)，產生PYF17D/14質粒。質粒PYF17D/14分兩步驟產生首先，質粒G1/2用作插入經修飾的pACNR1180質粒的不同片段經PCR放大的模板，產生質粒NSK7。然后，質粒NSK7用于克隆包含在質粒T3/27中的疫苗病毒17D基因組的剩余部分，產生質粒pYF17D/14。所有質粒在疋coli MC1061中繁殖，經Qiagen柱純化。為構建嵌合體17D-D2，使用DENV2病毒，New Guinea菌株。cDNA以與前述DNA疫苗克隆類似的方法合成，包含登革熱病毒基因組區域，其從相應與編碼蛋白prM的基因的第一個核苷開始到對應于蛋白E的氨基酸205的序列。這個區域經PCR放大，插入質粒G1/2的限制性酶如al和艙(1的酶切位點之間，產生質粒pGl/2 DEN2。包含17D-D2全基因組的cDNA是從片段的結合而構建的由質粒pGI/2 DEN2的消化而產生的I/NsiI (啟動子SP6，黃熱病毒區域5'NTR-C和DENV2 prM_2/3E)、由質粒pYFD/Fll/12的消化而產生的Afeil/#7yl (編碼DENVl的E蛋白的3'區域和黃熱病毒基因NSl的啟始序列)，由質粒PYF17D/14的消化而產生的(其包含了黃熱病毒基因組的剩余部分)。所有這些質粒在疋 coli XL-I BLUE 中繁殖，經 Concert High Purity System(Invitrogen)純化。 全質粒經通ol線性化，通過啟動子區域SP6用于體外轉錄。在體外合成的RNA以與US6，171，854中所述的相類似方法經Vero細胞的電穿孔法用于病毒再生。除用分離的DNA疫苗接種以外，還分析了鼠經聯合免疫的免疫應答初免(DNA疫苗)和加強免疫(嵌合體病毒17D-D2)系統，和兩種疫苗類型的同時免疫(共同施藥)。在初免/加強免疫的系統中，BALB/c鼠如如所述的在最后劑量的兩個星期后受到DNA和DENV2疫苗的兩種劑量，它們經皮下(sc)或肌肉(im)途徑給予4 IoglO PFU的嵌合體病毒(17D-D2)的接種。在這個同時免疫法(共同免疫法)中，這兩種疫苗(DNA和嵌合體17D-D2)在緩沖鹽溶液(PBS)中混合，經im途徑接種，在兩周內分為兩種劑量給藥。由DNA疫苗單獨地或與嵌合體病毒一起產生的免疫應答通過產生抗體和中和抗體來進行評價。在弟_■種DNA劑量的兩周后或者在最后免疫之后的兩周通過后眼球途徑對于動物的取血。在免疫開始之前的那天獲取預免疫血清。在這個中和檢測中，DENV病毒在經過受免疫鼠血清的不同稀釋液中培養，然后，這些病毒感染Veix)細胞的能力通過溶解板(lysisplate)的形式進行評估。從這些分析中，滴定中和抗體的水平是可能的。BALB/c鼠經過不同質粒單獨地或者與病毒17D-D2聯合免疫是通過DENV2大腦內接種來挑戰的(大約4. 3 IoglO PFU,相應于3. 8的LD5tl)，在最后的DNA疫苗免疫后25天 或者在嵌合體病毒接種后10天。在挑戰之前，動物經氯胺酮-賽拉嗪的混合物麻痹。病毒的滴定如Caufour et al, 2001中所述的,在動物內接種后很快通過在Vero細胞內實施。鼠的測評是在病態的挑戰之后直至21天每天檢測，尤其是在后腿的癱瘓和致死率的發展方面。垂死的動物與在挑戰試驗后21天后存活的那些動物一起被處死。為了血清中和檢測而收集這些動物的血。本發明現將通過實施例進行闡明。以下實施例是用于解釋本發明，并代表優選方式，使用不多于常規性試驗，本領域技術人員知曉或者能夠發現如何使用其它合適的材料和技術。實施例I-表達載體pcTPA的構建新的表達質粒通過將編碼人組織血漿酶原活動子(t-PA)-SEQ ID NO :8的信號肽的序列插入到原始質粒pcDNA3 (Invitrogen)中而構建。這個序列的片段使用特異性啟動子(圖I)經PCR放大。以下是用于經PCR放大反應的寡核苷酸。限制酶切位點III和&0RV各自具有下劃線。SEQ ID NO: I -正義核苷酸鏈(TPAl)
5，GGGGAAGCTTATGGATGCAATGAAGAGG3，
SEQ ID NO:2 -反義核苷酸鏈(TPA2)
5， GGGGATATCGCTGGGCGAAACGAAGAC3，
PCR產物，包含69個pb，經消化，并在質粒pcDNA2內_ind III和&oRV酶切位點之間克隆。這個序列通過測序確認，重組質粒命名為pcTPA(圖1A)。實施例2_pElD2和pE2D2的構建
兩個質粒(PE1D2和pE2D2)從pcTPA質粒中構建。質粒pcTPA是從附加有編碼人體組織血衆酶原活動子(t-PA)的信號肽的序列的質粒pcDNA3 (Invitrogen)中構建的,在限制性酶切位點(包含在質粒pcDNA3中的從人細胞巨化病毒中的啟動子區域的下游的歷'/^III e BcoRY)。質粒PE1D2是由插入編碼登革熱病毒亞型2(DENV2)的病毒核包膜蛋白(E)不具備蛋白E的C末端部分的80%的序列構建的。這個序列，包含了 DENV2全基因組的核苷酸937 和 2131 之間的核苷酸，New Guinea C (NGC)菌株(Genebank: M29095)經 PCR 放大，使用正義和反義寡核苷酸鏈，如下SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4中所述的，分別具有下劃線的限制酶切位點&oRV和XbaI
SEQ ID NO:3 - 5^GGGGGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC3^
SEQ ID NO:4 - 5^GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3^
進一步地，根據圖1B，在質粒pcTPA中序列的克隆是在限制性酶切位點&0RV和油<31之間進行的，在編碼信號肽t-PA的序列的相同的開放閱讀框，產生質粒PE1D2。質粒pE2D2經插入編碼DENV2蛋白E的區域III的序列構建，包含在DENV2 NGC菌株的(Genebank: M29095)全基因組的核苷酸1822和2131之間的核苷酸。這個序列使用如下所示的SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6的正義寡核苷酸鏈和反義寡核苷酸鏈經PCR技術放大，限制酶切位點AcoRV和ZhI各自具有下劃線
SEQ ID NO:5 - 5^GGGGGATATCGGAATGTCATACTCTATG3^
SEQ ID NO: 6- 5^GGGGTCTAGATTACGATAGAACTTCCTTTC3^
進一步地，質粒pcTPA中的序列的克隆是在限制性酶切位點&01^和ZhI之間實施，在編碼信號肽t-PA的序列的相同的開放閱讀框內，產生如圖IC所示的質粒pE2D2。每個克隆產物經測定序列確認。大腸桿菌，DH5-Q菌株，用于小規模和大規模的質粒的克隆和生產。質粒根據制造商的說明指示，通過堿性提取方法分離，經交換柱(Qiagen)純化，懸浮在無菌mi I iQ水中，儲存在-20 0C，直至使用。實施例3-嵌合體病毒17D-D2
嵌合體病毒17D-D2是通過將編碼DENV2，NGC菌株的蛋白prM和蛋白E的基因取代編碼黃熱病疫苗病毒YF17DD的膜蛋白(prM)和核包膜蛋白(E)的基因而構建的。嵌合體病毒17D-D2構建的細節可在Cafour et al.，2001找到。為了嵌合體17D-D2的構建，使用Rice et al.，1989發展的黃熱病感染性cDNA方法，其由兩個質粒組成pYF5'3'IV和pYFM5. 2。在這個方法中，考慮到大拷貝量的質粒中某些病毒的序列穩定性的缺乏，黃熱病毒基因分離在兩個前述的質粒中。這些質粒經特異性限制性內切酶消化，產生結合的片段，重新組成黃熱疫苗病毒全基因組。然而，在猴群的這個病毒的檢測表明，為獲取更減毒的病毒(Marchevsky et al.，1995)，需要對于cDNA的基因進行修飾。這樣的修飾經Galler和Freire (US6，171,854)所揭示的方法，導致質粒pYF5，3，IV and pYFM5. 2 的新版本，分別命名為 G1/2 和 T3/27。質粒 pACNR1180 (Ruggliet al., 1996)其具有限制這個質粒的復制數量的復制源(pl5A)，從而減少在細菌中的質粒DNA的拷貝數量，而使用該質粒。質粒pACNR1180被描述為一種克隆豬瘟病毒基因組的理想的質粒，其大小類似于黃熱病毒基因組，保證了克隆的基因組的穩定性。基于這些結果，黃熱病毒全基因組在經修飾的PACNR1180質粒中克隆(某些限制性酶切位點經去除)，產生質粒PYF17D/14。質粒pYF17D/14通過兩個步驟產生首先，質粒G1/2用作為插入在 經修飾的質粒PACNR1180的不同片段的經PCR技術放大的模板，產生質粒NSK7。進一步地，質粒NSK7用于克隆包含在質粒T3/27中的疫苗病毒17D基因組的其余部分，然后，產生了質粒PYF17D/14。所有在萬.co7i MC1061中繁殖的質粒經Qiagen柱純化。為構建嵌合體17D-D2，使用DENV2病毒，New Guinea菌株。cDNA在與前述的DNA疫苗克隆相似的方法合成，包含登革熱病毒基因組區域，其從對應于編碼蛋白PrM的基因的第一個核苷酸至對應于蛋白E的氨基酸205的序列。這個區域經PCR技術放大，插入質粒G1/2的兩個限制性酶切位點如al和艙打之間，產生質粒pGl/2 DEN2。包含17D-D2全基因組的cDNA從片段的結合中構建由質粒pGl/2 DEN2的消化中產生的(具有啟動子SP6，黃熱病毒5’ NTR-C 區域和 DENV2 prM_2/3E)，經質粒 pYFD/Fll/12 消化產生的 Afeil/#2wl (編碼從DENVl中的蛋白E的3’區域和黃熱病毒基因NSl的初始)，經質粒pYF17D/14的消化中產生的其包含黃熱病毒基因組的其余部分)。所有質粒在疋coli XL-I BLUE中繁殖，經Concert High Purity系統(Invitrogen)純化。整個質粒沿襲ZAoI,通過啟動子區域SP6用于體外轉錄。體外合成的RNA以US 6. 171. 854的文獻中所述的類似的方法通過Veix)細胞的電穿孔法用于病毒再生。實施例4-重組蛋白的表達的評估
亞洲大頰幼鼠的腎臟(BHK-21)在體外經不同質粒轉染，從而評估重組蛋白的表達，根據制造商的說明指示使用脂質體(Invitrogen)轉染法。在轉染的BHK細胞中的蛋白El和蛋白E2的表達通過免疫熒光檢測法檢測，使用抗DENV2腹腔液體(ATCC)和鼠抗IgG的抗體經突光素(Southern biotechnology)共軛后在突光光學顯微鏡下觀察。根據圖2,僅有經質粒PE1D2和pE2D2轉染的細胞顯示熒光，表明這些構建的質粒是能夠介導登革熱病毒蛋白在哺乳動物細胞中的表達。實施例5-免疫作用
為檢測DNA疫苗單獨或者與嵌合體病毒17D-D2 —起在初免/加強免疫系統中的保護性能力，使用大約四個星期大的BALB/c鼠進行兩個獨立的試驗。經DNA疫苗免疫作用的，質粒稀釋在PBS中(IX最終濃度)中，動物經肌肉途徑(im)接種，在后腿四頭肌上以lOOPg/lOOML的DNA疫苗接種每個動物(50l^g/50ML每個腿)。用嵌合體病毒17D-D2進行免疫作用，動物經皮下途徑(sc)在足墊上接種，或者經肌肉途徑(im)在后腿四頭肌接種溶解在培養基M199 (Sigma)或者PBS中的4 IoglO PFU的病毒。質粒pcTPA用于陰性控制。第三個試驗是實施DNA疫苗和17D-D2疫苗經im途徑同時免疫(共同施藥)。在這個情況下，兩種疫苗混合在PBS的單個溶液中。動物分組(每組10個鼠)。然后動物每兩個星期接受免疫，在最后一次免疫的兩個星期后，動物經腦內途徑(ic)接受致死劑量的DENV 2 NGC(3. 8 LD50)接種的挑戰，在鼠中神經適應。進一步地，動物在病態和存活的第21天前每天接受評估(癱瘓的發展，尤其是后腿的癱瘓)。
免疫時間表如圖3中所呈現。以下的表I、表2和表3顯不免疫時間表。表I顯示初免和加強免疫方案的第一次試驗或者單獨免疫的免疫時間表。
表I
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"..........................9.....—'.............................WDENV2fe^—￥￥￥fM.......................................................................................................................表2顯示初免和加強免疫方案的第二次試驗或者單獨免疫的免疫時間表。
權利要求
1.誘導抗登革熱病毒的免疫應答的方法，其特征在于，包括給患者DNA疫苗和17D嵌合體病毒的施藥。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，通過給患者聯合施藥，在初免(DNA疫苗)和加強免疫(嵌合體病毒)系統或者兩個疫苗(以相同形式的DNA疫苗和嵌合體病毒疫苗)的同時共同施藥的免疫策略。
3.抗登革熱病毒的疫苗組合物，其特征在于，包含 (a)從包含編碼蛋白E的基因或僅包含對應于這些蛋白的區域III的序列的不同重組質粒的構建中產生的抗四種登革熱病毒亞型的DNA疫苗，蛋白E來自每個登革熱病毒亞型，它們都融合到編碼人組織血漿酶原活動子(t-PA)的信號肽的序列中； (b)嵌合體病毒包含經感染性克隆粘附技術修飾的黃熱病疫苗病毒17D，由編碼登革 熱病毒不同亞型的蛋白PrM和蛋白E的序列取代編碼黃熱病毒蛋白prM和蛋白E的序列；以及 (c)藥物上可接受的載體。
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述DNA疫苗包含 -質粒pEl，由插入編碼來自登革熱病毒病毒性包膜(E)蛋白80%的序列構建，不具有登革熱病毒蛋白E的C末端部分。
5.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述DNA疫苗包含 -質粒PE2，由插入編碼登革熱病毒蛋白E的包含登革熱病毒全基因組的核苷酸1822和2125之間的區域III的序列構建。
6.試劑盒，其特征在于，包含 (a)來自包含編碼每個登革熱病毒亞型的蛋白E的基因或包含僅對應于這些蛋白區域III的序列的不同重組質粒的構建的抗四種登革熱病毒亞型的DNA疫苗，它們的序列都融合到編碼人組織血漿酶原活動子的信號肽(t-PA)的序列中；以及 (b)嵌合體病毒包含經感染性克隆粘附技術修飾的黃熱疫苗病毒17D，由編碼不同亞型的登革熱病毒的蛋白PrM和蛋白E的序列取代編碼黃熱病毒蛋白prM和蛋白E的序列。
7.重組質粒，包含蛋白E基因，并且來自每個登革熱病毒亞型的蛋白E基因的序列融合到編碼t-PA信號肽的序列，其特征在于，由插入每個登革熱病毒的沒有蛋白E的C末端部分的病毒性包膜(E)的蛋白的80%的序列構建，其中這樣的序列是使用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO :4所示的正義寡核苷酸鏈和反義寡核苷酸鏈放大的，然后介導在質粒pcTPA在編碼信號肽t-PA的序列的相同的開放式閱讀框內的限制性酶EcoRV和XbaII的酶切位點之間的序列的克隆，從而產生重組質粒。
8.根據權利要求7所述的質粒，其特征在于，編碼登革熱病毒的病毒性包膜蛋白(E)的80%的序列，該病毒包膜蛋白(E)的序列包含在DENV2，New Guinea C(NGC)菌株的全基因組的核苷酸 937 和 213125 之間(Genebank:M29095)。
9.重組質粒，包含蛋白E基因，并且來自每個登革熱病毒亞型的蛋白E基因的序列融合到編碼t-PA信號肽的序列，其特征在于，由插入編碼登革熱病毒蛋白E的區域III的序列構建的，其中這樣的序列是使用如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 4所示的正義寡核苷酸鏈和反義寡核苷酸鏈放大的，在限制性酶EcoRV和XbaI酶切位點之間的，進一步地克隆在限制性酶EcoRV和XbaI酶切位點之間的序列，在編碼信號肽t_PA的序列的開放閱讀框內，從而生成重組質粒。
10.根據權利要求9所述的質粒，其特征在于，編碼登革熱病毒蛋白E的區域II的序列，包含在DENV2，NGC菌株(Genebank: M29095)的全基因組的核苷酸1822和213125之間。
全文摘要
本發明涉及一種基于DNA疫苗和嵌合體病毒17D疫苗在聯合免疫或者共同施藥的免疫誘導抗登革熱病毒的免疫應答的方法。在本發明的范圍內還包含抗四種登革熱病毒亞型的從不同重組質粒的構建中產生的DNA疫苗，重組質粒包含編碼蛋白E或者僅包含對應于這個蛋白的區域III的序列，蛋白E和對應于這個蛋白區域III的序列來自于每個登革熱病毒亞型(DENV1-4)。本發明進一步提供一種疫苗組合物，由(a)抗四種登革熱病毒亞型的DNA疫苗，(b)包含經修飾的黃熱病疫苗病毒17D的嵌合體病毒；和(c)藥物上可接受的載體，包含在本發明保護范圍內。
文檔編號C12N15/86GK102711817SQ201080052438
公開日2012年10月3日 申請日期2010年8月1日 優先權日2009年10月1日
發明者里卡多·蓋勒, 阿德里瑪·德·索薩·阿塞韋多, 阿達·瑪麗亞·德·巴塞盧斯·阿爾維斯, 馬可仕·達·席爾瓦·弗萊雷 申請人:奧斯瓦道·克魯茲基金會