作為用于前列腺癌診斷和分期的非侵入性標志物的循環miRNA的制作方法

專利名稱：：作為用于前列腺癌診斷和分期的非侵入性標志物的循環miRNA的制作方法作為用于前列腺癌診斷和分期的非侵入性標志物的循環miRNA本發明涉及用于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的方法，所述方法包括(a)在來自所述受試者的樣品中測定選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者前體分子的量和(b)將如此測定的量與參考量比較。此外，本發明涉及用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的方法，以及用于診斷前列腺癌的方法。本發明還涉及適合于實施本發明方法的試劑盒和裝置。在西方男性中，前列腺癌是最經常被診斷的惡性腫瘤，并占癌癥相關死亡原因的第二位。因為癌癥的發展和進展由分子改變驅動，分子特征的分析可以最終允許更好的預測個體癌癥的行為。前列腺癌具有較高的發生率，但腫瘤侵占性和長期結果是可變的。用于治療決定的高和低風險前列腺腫瘤的分離在臨床情況中仍是未解決的問題。前列腺癌的常見分類基于臨床和病理學參數，如術前前列腺特異性抗原(PSA)、直腸指檢(DRE)、經直腸的超聲檢測，以及前列腺活組織檢查的組織學分級(Gleason得分)。然而，所有這些參數在其預測能力方面都具有局限。對于PCA的檢測，前列腺特異性抗原(PSA)的廣泛使用導致越來越多的男性診斷為具有器官局限性、低Gleason-得分PCA，所述PCA是可能治愈的。然而，PSA測試的高靈敏性伴隨著低特異性，造成許多患者經歷不必要的活組織檢查。具有正常前列腺病理的男性，在血液中通常具有低于4ng/ml的PSA水平。4ng/ml和10ng/ml之間(‘灰色區’)的PSA水平具有25%的幾率具有前列腺癌。結果，在75%的病例中，在該灰色區內具有異常DRE和PSA的男性為陰性，或者似乎不需要進行活組織檢查。PSA是前列腺體積的指示物，并因此顯示出在輔助預測前列腺癌中的局限性。因此，進行前列腺組織活檢以確認診斷并評價腫瘤侵占性。使用Gleason得分(GS)系統根據其細胞分化狀態分級腫瘤組織。目前，對于臨床風險分層，GS是最可靠的預測標志物。然而，前列腺癌是多病灶疾病。因此，常常在進行活組織檢查期間漏掉了腫瘤，并且不知道活組織檢測內的腫瘤病灶是否是驅動癌癥進展的腫瘤病灶。因此，不得不在根治性前列腺切除術后升級大部分腫瘤。這種升級可能影響治療決定，因為具有高GS的腫瘤與術后生物化學復發和更差的存活相關。各個患者的治療決定與該個體中存在的前列腺癌的階段聯系。美國泌尿科學協會(AmericanUrologicalAssociation)(AUA)研發了前列腺癌擴散的常見分類。AUA系統將前列腺腫瘤分成4個階段，A至D。將階段A(前列腺內的微型癌)進一步細分成階段Al和A2。亞階段Al是局限于前列腺內一個位點的較好分化的癌。治療通常是觀察、根治性前列腺切除術或者放療。亞階段A2是在前列腺內多個位點處的中等至低分化癌。治療是根治性前列腺切除術或者放療。還將階段B(前列腺內可觸知的腫塊)進一步細分成亞階段BI和B2。在亞階段BI中，癌癥在前列腺的一葉中形成了小結節。在亞階段B2中，癌癥或者在前列腺的兩葉中都形成或發生了大的或者多個結節。亞階段BI和B2的治療是根治性前列腺切除術或者放療。階段C是涉及大部分或者全部前列腺的較大癌癥團塊，并且還可以進一步細分成兩個亞階段。在亞階段Cl中，形成連續團塊的癌癥可能已經延伸至前列腺以夕卜。在亞階段C2中，癌癥形成的連續團塊侵入了周圍組織。對這兩種亞階段的治療都是放療，使用用或不用針對癌癥的藥物。第四階段，階段D是轉移性癌癥，并也可以細分成兩個亞階段。在亞階段Dl中，癌癥在骨盆的淋巴結中存在。在亞階段D2中，癌癥涉及淋巴結以外的組織。對這兩種亞階段的治療是針對癌癥以及疼痛的全身性藥物。然而，當前的前列腺癌分期方法是有局限的。多至50%最初分期為A2、B或C的前列腺癌實際上是轉移性的階段D。轉移瘤的發現是意義重大的，因為具有轉移性癌癥的患者具有較差的預后，并需要與那些具有局限性癌癥的患者顯著不同的療法。具有局限性和轉移性前列腺癌的患者的五年存活率分別為93%和29%。miRNA是短RNA分子(19-26個核苷酸)，提示其為生物學功能的重要調節物(BushatiN，CohenSM。microRNAfunctions。AnnuRevCellDevBiol2007；23175-205)oiniRNA表達的改變可以影響重要的細胞過程，如細胞周期、增殖或凋亡，因而提供了與癌癥發展和進展的直接聯系(CalinGA，CroceCM。MicroRNAsignaturesinhumancancer.NatRevCancer2006；6(11):857-66;RosenfeldN,AharonovR，MeiriE，等人。MicroRNAsaccuratelyidentifycancertissueorigin。NatBiotechnol2008；26(4)462-9)o最近顯示，可以在血清中提取并測量穩定的游離miRNA，并且其作為潛在的生物標志物的來源。Lawrie等人首先表明，在患B細胞淋巴瘤的患者的體液中存在miRNA(LawrieCH,GalS，DunlopHM，等人。Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB—cellIymphoma0BrJHaematol2008；141(5):672-5)0Mitchell等人用小鼠模型闡明，即使當起源于上皮癌類型時，腫瘤來源的miRNA也會進入循環。在該研究中，他們還顯示，當與健康對照比較時，循環miRNA-141在轉移性前列腺癌中是升高的(MitchellPSiParkinRKiKrohEM，等人。CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection。ProcNatlAcadSciUSA2008；105(30):10513-89)。在多種其它癌癥疾病中，循環miRNA還顯不出在腫瘤患者和健康對照之間以不冋的水平存在(TanakaM，OikawaK，TakanashiM，等人，Down-regulationofmiR-92inhumanplasmaisanovelmarkerforacuteleukemiapatientsoPLoSONE2009；4(5)e5532；ChenX，BaY，MaL，等人，CharacterizationofmicroRNAsinserumanovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases。CellRes2008；18(10):997-1006；TaylorDDiGercel-TaylorC0MicroRNAsignaturesoftumor-derivedexosomesasdiagnosticbiomarkersofovariancancer。Gynecol0ncol2008；110(1):13-21)o然而，在上皮癌中的不同階段之間還沒有發現以不同水平存在的無細胞miRNA(ResnickKEiAlderH，HaganJP，RichardsonDL,CroceCM，CohnDE0ThedetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsfromtheserumofovariancancerpatientsusinganovelreal-timePCRplatform。GynecolOncol2008；NgEK,ChongWW,JinH，等人，DifferentialexpressionofmicroRNAsinplasmaofcolorectalcancerpatientsApotentialmarkerforcolorectalcancerscreening。Gut2009)。因此，存在極大的需求來鑒定反映腫瘤進展的新分子標記物，以增強前列腺癌的臨床治療。具體而言，需要允許容易且可靠分期前列腺癌的工具和方法，以及允許診斷前列腺癌的工具和方法，以及鑒定對目的在于治療前列腺癌的療法敏感的受試者。此類可靠的工具和方法還未有描述。本發明的技術困難可見為提供前述需求的工具和方法。通過權利要求和下文中所述的實施方案解決了技術問題。因此，本發明涉及患前列腺癌的受試者中前列腺癌分期的方法，包括a)測定來自所述受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA_200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量,或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，b)將如在步驟a)中測定的所述至少一種miRNA或者所述前體分子的量與參考量(或多個參考量)比較，并c)基于在步驟b)中獲得的信息對所述受試者中前列腺癌分期。本發明方法優選地是體外方法。此外，除上文明確描述的那些步驟外，其還可以包含另外的步驟。例如，另外的步驟可以涉及樣品預處理或者評價通過該方法獲得的結果。本發明方法優選地用于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌。然而，本發明方法還可以用于監測、確證和亞分類所述受試者。該方法可以手工實施或者通過自動化輔助實施。優選地，步驟(a)和(b)可以全部或者部分通過自動化輔助，例如，通過機器人和傳感器設備用于步驟(a)中的測定，或者在步驟(b)中應用計算機實現的比較。如本領域技術人員所理解，前述分期通常并非意圖對100%待分析的受試者都是正確的。然而，該術語要求該評估對于待分析受試者的統計學顯著部分是有效的。可以使用多種熟知的統計學評價工具，例如，置信區間測定、P值測定、斯氏t檢驗、Mann-Whitney檢驗等等，在不再另外費力的情況下，通過本領域技術人員測定該部分是否統計學顯著。詳細說明見于Dowdy和Wearden,StatisticsforResearch,JohnWiley&Sons,NewYork1983。優選的置信區間為至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或者至少99%。p值優選地為O.1,0.05,0.01,0.005或者O.001。優選地，本發明所考慮的概率允許該分期對于給定群組的受試者的至少60%、至少70%、至少80%或者至少90%是正確的。如本文中所用，術語“受試者”指雄性動物，優選地雄性哺乳動物和，更優選地，男性人類。然而，設想根據本發明的前述方法，其涉及的受試者應當患前列腺癌。術語“前列腺癌”在本領域是已知的。如本文中所用，該術語優選地涉及前列腺的任意增殖性病變或者異常。因此，該術語優選地包括惡變前的病變、惡性病變以及實體腫瘤和轉移性疾病(局限性轉移和更廣泛的轉移二者)。如何評估受試者是否患前列腺癌是本領域熟知的。具有PCA的升高風險的男性的臨床決定制定過程基于臨床準則的證據確定。(HeidenreichA,AusG,BollaM,等人,EAUguidelinesonprostatecancer。EurUrol2008；53:68-80)。如本文中所用，術語“分期前列腺癌”優選地指區分前列腺癌的多種階段。前列腺腫瘤階段的一般分類是本領域技術人員熟知的。簡言之，最通常使用的分期方法是腫瘤，結節，轉移(Tumour,Nodes,Metastasis)(TNM)系統,其考慮了局部腫瘤生長的4個階段,從Tl(偶發的)至T4(浸潤鄰近器官)。每一階段都描述了腫瘤病理學發展的狀態。Tl表示“偶發”狀態，其中腫瘤經尿道切除后由于偶然性檢測到或者PSA測試后通過活組織檢查檢測至IJ。在該階段，通過觸診(DRE)或者超聲不能檢測到腫瘤，但可以通過本發明方法診斷。T4表示晚期疾病，其中腫瘤已經浸潤了鄰近器官。淋巴結階段(NO-Nl)和轉移階段(MO-MlC)分別反映疾病至淋巴結和遠端位點(轉移)的臨床擴散。分級系統可以評估腫瘤中細胞間變(大小、形態和染色特性的變化)和分化(細胞如何高度分化)的程度。Gleason分級系統基于腫瘤細胞排列成可識別的腺狀結構的程度以及細胞分化的水平。Gleason系統鑒定了5種以上水平的增加的疾病侵占性，級別I是侵占性最低的癌和級別5以上是侵占性最聞的癌。如本文中所用，術語“分期前列腺癌”，優選地指區分前列腺癌的輕微和嚴重形式。在本發明的上下文中，前列腺癌的輕微形式優選地是原發性前列腺癌。前列腺癌的嚴重形式優選地是轉移性前列腺癌。因此，本發明的前述方法優選地允許區分原發性前列腺癌和轉移性前列腺癌。在本發明方法的上下文中，術語“原發性前列腺癌”優選地涉及局限性前列腺癌(例如PT2或更低)。在本發明方法的上下文中，術語“轉移性前列腺癌”優選地涉及具有轉移性腫瘤，優選地骨轉移腫瘤的前列腺癌(例如前列腺癌ρΝ+、Μ+、全身性階段)。在本發明方法的優選實施方案中，區分了高風險、中等風險和低風險。本發明方法的上下文中，處于“低風險”的受試者指患具有Gleason得分為6或者低于6的前列腺癌的受試者。本發明方法的上下文中，處于“中等風險”的受試者指患具有Gleason得分為7的前列腺癌的受試者。本發明方法的上下文中，處于“高風險”的受試者指患具有Gleason得分為8或者大于8的前列腺癌的受試者。術語“樣品”指體液樣品、分離的細胞樣品或者來自組織或器官的樣品。體液樣品可以通過熟知的技術獲得，并優選地包括血液、血漿、血清或者尿樣品，更優選地，血液、血漿或血清樣品。組織或器官樣品可以通過例如，活組織檢查獲自任一組織或器官。優選的組織和器官樣品獲自前列腺，其可以通過熟知的方法獲得，優選地通過針吸活組織檢查。分離的細胞可以通過分離技術例如離心或細胞分選，獲自體液或組織或者器官。在本發明方法的上下文中，優選的細胞是前列腺細胞。在本發明的上下文中，最優選的樣品是血液、血清或者血衆樣品。在本發明方法的優選實施方案中，通過熟知的方法進一步處理樣品，以進一步富集和/或純化如本文中所述的miRNA分子或其前體分子。進一步處理取決于標志物的性質，即待測定的標志物是miRNA還是前體分子。優選地，如果標志物是miRNA，那么(獲得樣品后)通過本領域技術人員熟知的方法富集和/或純化小RNA(例如18至24nt長度)。優選地，如果生物標志物是前體分子，(獲得樣品后)可以通過本領域熟知的方法富集和/或純化所述總RNA。對于從樣品中g集miRNA分子，可以在弟一步從樣品中純化總RNA。在弟_■步中，可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總RNA。在第三步中，可以從聚丙烯酰胺凝膠中純化小RNA部分(例如18-24個核苷酸長度)。在本發明的上下文中，還考慮從樣品中分離miRNA。具體而言，可以將基于苯酚/胍的裂解和基于硅膠膜的純化組合用于從血清樣品中分離無細胞的RNA。此外,可以將多種miRNA模擬物(例如,來自線蟲(c.elegans)的cel-miRNA_39、cel-miRNA-54、cel-miRNA-238，參見實施例)加入到樣品中作為純化效率的spike_in對照(MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,等人,CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection。ProcNatlAcadSciUSA2008；105(30):10513-89)。還考慮在獲得RNA樣品后實施反轉錄(特別地通過定量RT-PCR，以定量RNA，參見下文)。微RNA(miRNA)是大約21_23個核苷酸長度的單鏈RNA分子，其調節基因表達。通常還將所述miRNA稱為成熟miRNA。miRNA是非編碼RNA并，因此并不翻譯成蛋白質。它們來源于初級轉錄物(pri-miRNA),所述初級轉錄物在第一步中被加工成短莖-環(發夾)結構(pre-miRNA)，并然后成為功能性miRNA。成熟miRNA分子與對應的靶mRNA部分互補，并且該結合導致翻譯抑制或者mRNA降解。在本發明的上下文中，應當在來自受試者的樣品中測定選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*或者它們的前體分子的至少一種miRNA的量。前述miRNA是單鏈RNA分子。miRNA-375的序列顯示于SEQIDNO:1中，miRNA-141的序列顯示于SEQIDNO:2中，miRNA-200b的序列顯示于SEQIDNO:3中，miRNA-516a_3p的序列顯示于SEQIDNO4中，miRNA9*顯示于SEQIDNO:5中。如本文中所用，短語“至少一種”優選地指“一種miRNA”或者“一種以上”，特別地，兩種、三種、四種或者五種miRNA或者它們的前體。因此，考慮通過測定多種miRNA或者它們的前體的量分期前列腺癌。前述miRNA的前體分子優選地是對應的pri_miRNA和，更優選地對應的pre-miRNA。miRNA-375的pre-miRNA前體的序列顯示于SEQIDNO:6中，miRNA-141的pre-miRNA前體的序列顯不于SEQIDNO7中，miRNA-200b的pre-miRNA前體的序列顯不于SEQIDNO:8中，和miRNA-516a-3p的pre-miRNA前體的序列顯示于SEQIDN0:9中，和miRNA9*的pre-miRNA前體的序列顯示于SEQIDNO:10中。還考慮測定受試者的樣品中任一多種前述SEQIDNo的量。優選地，此類變體具有與SEQIDNO:1至10的任意一種至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者至少99%同一性的核酸序列。優選地通過Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法測定兩個或者多個核酸序列之間的同一性程度(百分比，％)。為了實施序列比對，使用為GCG軟件包(GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA5371,1991年版)的一部分的程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25,351-360,1987,Higgins1989，CABI0S，5:151-153)或者程序Gap和BestFit(Needleman1970，J.Mol.Biol.48；443-453和Smith1981，Adv.AppI.Math.2；482-489)。優選地，使用程序GAP在整個序列區域用以下設定空位權重(GapWeight):50,長度權重(LengthWeight):3,平均匹配(AverageMatch):10.000和平均錯配(AverageMismatch):0.000測定上文所列舉的以百分比)表示的序列同一性值，除非另外說明，所述設定應當始終用作為序列比對的標準設定。應當理解，在本發明的上下文中，還可以通過測定一部分pre-miRNA的量來實施診斷/區分。例如，可以通過測定來自受試者的樣品中，對應的miRNA*分子的miRNA前體分子的環，即加工自相對于成熟miRNA的發夾臂的小RNA的量來實施診斷。測定miRNA分子或者其前體分子的量可以通過任一認為合適的方法進行。在實施例中描述了用于測定所述量的優選方法。Mitchell等人也描述了優選的方法，所述文獻就其全部公開內容而言引入本文作為參考(MitchellPS,ParkinRK，KrohEM，等人，CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection。ProcNatlAcadSciUSA2008；105(30):10513-89)。可以通過使用特異性檢測待分析的miRNA或前體分子或者所述miRNA或所述前體的擴增產物的探針寡核苷酸，測定miRNA或者其前體分子的量(對于術語“擴增產物”的解釋，參見下文)。通過特異性探針寡聚核苷酸來測定miRNA或者其前體分子的量，優選地包括用與轉錄物或者其擴增產物特異結合的探針寡核苷酸與miRNA或者其前體分子或者其擴增產物雜交。在本發明的上下文中，優選地，探針寡核苷酸是對所述miRNA或其前體分子特異的單鏈核酸分子，并優選地包含與靶特異性雜交的一段核苷酸，并因此與靶多核苷酸互補。所述一段核苷酸與靶多核苷酸包含的序列區優選地具有85%、90%、95%、99%或者更優選地具有100%的同一性。如果靶分子是miRNA，那么探針寡核苷酸與所述miRNA優選地具有85%、90%、95%、99%或者更優選地具有100%的同一性。優選地，通過Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法確定兩個或多個核酸序列之間的同一性程度(百分比，％)。為了實施序列比對，使用為GCG軟件包(GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA5371,1991年版)的一部分的程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins1989，CABI0S，5:151-153)或者程序Gap和BestFit(Needleman1970,J.Mol.Biol.48；443-453和Smith1981,Adv.AppI.Math.2；482-489)。優選地，使用程序GAP在整個序列區域用以下設定空位權重(GapWeight):50，長度權重(LengthWeight):3,平均匹配(AverageMatch):10.000和平均錯配(AverageMismatch):0.000確定上文所列舉的以百分比(％)表示的序列同一性值，除非另外說明，所述設定應當始終用作為序列比對的標準設定。探針寡核苷酸可以是經標記的或者含有其他修飾,包括允許測定miRNA或者其前體分子(或者其擴增產物)的量的酶。標記可以通過本領域熟知的多種技術進行，并且取決于所使用的標記。優選的標記描述于本說明書的其他地方。在本發明方法的優選實施方案中，miRNA(或者其前體分子)的量的測定包括步驟擴增樣品所包含的miRNA(或者其前體分子)和測定因此產生的擴增產物的量。通過測定所述擴增產物的量，可以估計miRNA分子(或者其前體分子)的量。優選地，通過使用如上文中所述的探針寡核苷酸測定擴增產物的量。如果應當測定樣品中miRNA的擴增產物的量,那么可以如由Mitchell等人所述擴增miRNA(同前文獻，參見例如文件Mitchell的圖la)。在3’和5’端連接miRNA到單鏈寡核苷酸，該單鏈寡核苷酸含有用于反轉錄和PCR的通用序列。實施連接產物的反轉錄。反轉錄后，通過PCR擴增得到的產物。在本發明方法更優選的實施方案中，所述PCR是實時PCR(RT-PCR)。因此，優選地通過定量實時PCR測定miRNA的量。術語“實時PCR”是本領域已知的。當實施實時PCR時，將在PCR反應期間監測的從PCR測定中發出的信號作為每一PCR擴增循環期間擴增產物的量的指標，與常規PCR方法相反，其中在常規PCR方法中在PCR反應的終點監測擴增產物。實時PCR通常基于熒光報道分子的檢測和定量。反應中，信號與PCR產物的量成比例增加。當實施實時PCR時，可以通過將結果與由連續稀釋(例如未稀釋的、I4、116、I64、1128)所述標志物的預定量的實時PCR產生的標準曲線比較，來測定miRNA或者其前體分子的量。此外，為了準確測定所述量，可以將所測量的量除以歸一化RNA(或者DNA)的量，其允許歸一化不同樣品之間RNA量的可能變化。歸一化RNA可以優選地是加入到樣品中的RNA(或者DNA)(spike-in,參見實施例)。此外，考慮通過原位雜交，優選地在前列腺組織樣品中測定本發明標志物的量。如本文中所用，術語“量”包括miRNA或者前體分子(或者其擴增產物)的絕對量、相對量或者其濃度，以及與其相關的任意值或參數。此類值或者參數包括通過直接測量獲得的全部特定物理或化學性質的強度信號值，例如強度值。此外，還包括通過本說明書中其他地方說明的間接測量獲得的全部值或者參數，例如，從生物讀出系統中測定的表達水平。應當理解，與前述量或參數相關的值還可以通過全部的標準數學運算獲得。如果實施實時PCR，那么特別優選地是測定Ct值(Ct:循環閾值)，其指出樣品中待分析的標志物的相對量。如何測定Ct值是本領域熟知的。通常，樣品中標志物的量越大，Ct值越低。如本文中所用，術語“比較”包括將待分析的樣品中包含的miRNA、其前體分子(或者所述miRNA或者前體分子的擴增產物)的量與在本說明書中其他地方所述的合適參考源的量比較。應當理解，如本文中所用，比較指對應的參數或者值的比較，例如，將絕對量與絕對參考量比較，而將濃度與參考濃度比較，或者將獲自測試樣品的強度信號與參考樣品的相同類型強度信號比較。可以通過手工或者計算機輔助實施本發明方法的步驟(b)中提及的比較。對于計算機輔助的比較，可以通過計算機程序，將測定量的值與存儲在數據庫中的對應的合適參考的值比較。計算機程序可以進一步評價比較的結果，即以合適的輸出格式自動提供想要的評估。基于步驟a)中測定的量與參考量的比較，可以在來自患前列腺癌的受試者的樣品中分期前列腺癌。術語“參考量”指允許在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的量。參考量可以來源于患不同階段的前列腺癌的受試者的樣品。例如，如果要區分原發性前列腺癌和轉移性前列腺癌，那么參考量可以來源于(i)患原發性前列腺癌的受試者和/或(ii)患轉移性前列腺癌的受試者的樣品。例如，如果要區分低風險、中等風險和高風險，那么參考量可以來源于(i)處于低風險的受試者，(ii)處于中等風險的受試者，和/或(iii)處于高風險的受試者的樣品。參考值還可以是獲自一組此類樣品的平均值或均值。優選地，所述參考值來自血液、血漿或血清樣品。如果參考值獲自活組織檢查的組織樣品，那么所述樣品應當包含前列腺癌組織或者基本上由前列腺癌組織組成。可以通過應用本發明的方法獲得參考結果。參考值還可以是獲自一組前述樣品的平均值或者中值。此外，還優選地，參考值可以是計算的參考值，最優選地，處于前列腺癌的多種階段(優選地前述階段)的個體的代表性群體，優選地，美國、亞洲或歐洲群體的本發明方法上下文中所述標志物的相對量或絕對量的平均值或中值。可以如在本文中其他地方所述，測定所述群體的個體的所述標志物的絕對量或相對量。如何計算合適的參考值，優選地平均值或中值是本領域熟知的。上文提及的受試者的群體應當包含多個受試者，優選地，至少5、10、50、100、1,000或10，OOO個受試者。應當理解，通過本發明方法診斷的受試者與所述多個受試者的受試者是同一物種。更優選地，“參考值”可以這樣獲得，通過測定一組參考受試者，例如一組患原發前列腺癌的受試者、一組患轉移性前列腺癌的受試者、包含待研究的受試者的群體的至少一種特征性特性的值；并通過合適的統計學方法，包括那些在本文中其他地方提及的統計學方法，例如中值、平均值、分位數、PLS-DA、邏輯回歸方法、隨機森林分類(randomforestclassification)或者其他給出閾值的方法計算參考值。閾值應當考慮診斷和預后測試的靈敏性和特異性的希望的臨床設定。可應用于個體受試者的參考量可以依據多種生理學參數，例如年齡或者亞群，以及用于測定本文中所提及的標志物的方法而改變。通過本發明方法，可以從待分析的參考樣品與(即同時地或者順次地)測試樣品一起測定合適的參考量。可以建立本文中提及的診斷標志物的參考量，并且可以將來自受試者的樣品中的標志物的量簡單地與參考量比較。診斷和/或預后測試的靈敏性和特異性不僅僅取決于測試的分析“質量它們還取決于對什么組成異常結果的定義。實際上，通常通過將變量的值對其在“正常”和“疾病”群體中的相對頻率作圖，來計算接受者操作特征曲線(ReceiverOperatingCharacteristiccurve)或者“ROC”曲線。對于任一具體的標志物，處于多種階段前列腺癌的受試者的標志物水平的分布可以重疊。在該條件下，測試不能在100%準確的情況下絕對區分，并且重疊的面積表示測試不能區分正常和疾病。選定閾值，高于所述閾值(或者低于所述閾值，取決于標志物如何隨疾病改變)認為該測試是異常的，并且低于所述閾值，認為該測試是正常的。ROC曲線下的面積是所理解的測量將允許正確鑒定疾病的概率的度量。甚至當測試結果并不需要給出準確數值時，也可以使用ROC曲線。只要可以排列結果，就可以創建ROC曲線。優選地，如果要區分原發性前列腺癌和轉移性前列腺癌，并且如果參考結果獲自(i)患原發性前列腺癌的受試者和(ii)患轉移性前列腺癌的受試者，可以基于獲自測試樣品的測試結果與前述參考結果之間的同一性或相似性的程度，即基于至少一種miRNA標志物或者其前體分子的相同或相似的定性或定量組成，實施前列腺癌的分期。在定量測定的情況下，如果特征性特性的值和強度值是相同的，那么測試樣品的結果和參考結果是相同的。如果特征性特性的值是相同的，但強度值是不同的，那么所述結果是類似的。優選地，該差異是不顯著的，并且其特征在于強度的值至少在參考值的1%-99%,5%-95%,10%-90%,20%-80%,30%-70%,40%-60%之間的區間內，參考值的50%、60%、70%、80%、90%或者95%。優選地，如果要區分低風險、中等風險和高風險，并且參考結果獲自(i)處于低風險的受試者，(ii)處于中等風險的受試者和(iii)處于高風險的受試者，那么應用相同的方法。在本發明方法的上下文中，還考慮分期基于獲自測試樣品的測試結果和前述參考結果之間的差異，即至少一種標志物的定量組成的差異。如果使用上文所述的計算的參考值，那么應用相同的方法。優選地，差異應當是根據本發明的診斷標志物的絕對量或者相對量的增加。優選地，相對量或者絕對量的增加是顯著的，即在參考值的45%-55%,40%-60%,30%-70%,20%-80%,10%-90%,5%-95%,1%-99%之間的區間之外。此外，還考慮將閾值量用作為參考量。可以將高于閾值量的測試樣品中如本文中所提及的標志物的量用于指示前列腺癌的嚴重形式，其中將低于閾值量的量用于指示前列腺癌的輕微形式。有利地，在本發明上下文中實施的研究顯示，測定來自所述受試者的血漿樣品中選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，并因此將測定的量與參考量比較，允許在患前列腺癌的受試者中可靠地分期前列腺癌。特別地，進行了篩選研究，以通過在兩個臨床風險組中監測667個人類miRNA，鑒定在血清中與前列腺腫瘤進展相關的循環miRNA。當與原發性前列腺癌比較時，在來自患轉移性前列腺癌的患者的血清中，miRNA-375,miRNA-9*、miRNA-141、miRNA-200b和miRNA-516a_3p鑒定為高豐度的。此外，使用獨立患者群組的血清樣品，在前瞻性確認研究中分析鑒定的miRNA(miRNA-375,miRNA-9*,miRNA-14UmiRNA-200b和HiiRNA-5I6a-3P)(參見實施例)。確認研究證實，選定的循環miRNA與腫瘤進展顯著相關。因此，已經顯示，在前列腺癌中，循環miRNA與臨床病理學終點相關。鑒定的miRNA與腫瘤進展相關，特別是miRNA-375，其與Gleason得分、淋巴結狀態和PT階段相關。在本發明的研究中，將循環miRNA-375與術前PSA值比較。顯示與較低風險腫瘤比較，miRNA-375在患高風險腫瘤的患者(Gleason得分>=8或者具有轉移性前列腺癌的患者)的血清中顯示出明顯更高的水平。相反，對于Gleason7和Gleason>=8腫瘤以及淋巴結狀態之間的PSA水平的比較，沒有檢測到顯著性差異。因此，相比PSA，miRNA-375允許更可靠的前列腺癌分期。miRNA-375在低、中等和高風險之間的三個逐組比較中表現出顯著的差異。此外，miRNA-375在具有淋巴結陽性狀態或者病理學階段pT3的患者的血清中具有顯著更高的豐度。為了評估PSA和miRNA-375對病理學終點的臨床預后的影響，應用了ANOVA分析(參見實施例)。總的來說，ANOVA分析顯示，miRNA-375是前列腺癌的另外的非侵入性標志物，如果應用，其有助于在臨床背景中改進治療決定。本發明方法是特別有利的，因為其可以用較小體積的血液、血清或血漿樣品實施。因此，可以避免活組織檢查。可以將上文給出的說明和定義就實際的情形應用于以下方法(除非另外指明)。此外，本發明涉及在患前列腺癌的受試者中診斷前列腺癌的方法，所述方法包括a)在來自所述受試者的血液、血清或者血衆樣品中，測定選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA_200b、miRNA-516a_3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，b)將如在步驟a)中測定的所述至少一種miRNA或者所述前體分子的量與參考量比較，和c)基于步驟b)中獲得的信息診斷所述受試者中的前列腺癌。在前述方法的上下文中的受試者應當疑似患前列腺癌。此外，還考慮，該受試者可能具有前列腺癌的傾向。如本文中所用，懷疑患前列腺癌或者具有其傾向的受試者指優選地，表現出指示前列腺癌的癥狀或者臨床病征或者參數的受試者。然而，該術語還指明顯的健康受試者，即并不表現出任一前述癥狀、臨床病征或者參數的受試者。明顯健康的受試者可以通過本發明方法研究作為預防性護理的度量或者用于群體篩查目的。如在前述方法中所用，術語“參考量”指允許在疑似患前列腺癌的受試者中診斷前列腺癌的量。參考量可以來源于(i)患前列腺癌的受試者或者(ii)來自已知未患前列腺癌的受試者的樣品。參考值還可以是獲自一組此類樣品的平均值或者中值。可以應用本發明方法獲得參考結果。備選地，但然而也是優選地，參考結果可以獲自來自已知未患前列腺癌的受試者或者已知不具有其傾向的受試者的樣品，即對于前列腺癌和更優選地，對于其他疾病，特別是癌癥疾病而言健康的受試者。同樣，如果參考值獲自活組織檢查組織樣品，所述樣品應當基本上由明顯健康的前列腺組織組成。參考值還可以是獲自一組此類樣品的平均值或者中值。優選地，如果涉及活組織檢查組織樣品，參考樣品和測試樣品可以獲自相同的受試者，即來自受前列腺癌明顯影響的區域或者來自疑似受前列腺癌影響的區域。此外，參考值還優選地，可以是計算的參考值，更優選地，明顯健康或者患前列腺癌的個體的代表性群體的如本文中所提及的標志物的相對論或絕對量的平均值或者中值，其中患前列腺癌的受試者在流行該疾病的給定群體內，優選地，美國、亞洲或者歐洲群體內。可以如本文中其他地方所述測定所述群體的個體的所述標志物的絕對量或相對量。如何計算合適的參考值，優選地，平均值或者中值是本領域熟知的。上文所提及的受試者的群體應當包括多個受試者，優選地，至少5、10、50、100、1，000或者10，000個受試者。應當理解，待通過本發明方法診斷的受試者與所述多個受試者的受試者是同一物種。更優選地，“參考值”可以這樣獲得，通過測定一組參考受試者，即一組已知患前列腺癌的受試者、一組已知未患前列腺癌的受試者、包含待研究的受試者的群體或者一組前列腺癌組織或明顯健康的組織的活組織檢查樣品的至少一種特征性特性的值，并通過合適的統計學方法，包括那些在本文中其他地方所述的方法計算參考值。可應用于個體受試者的參考量可以依據多種生理學參數，例如年齡或者亞群，以及用于測定本文中所提及的標志物的方法而改變。通過本發明方法，可以從待分析的參考樣品與(即同時地或者順次地)測試樣品一起測定合適的參考量。可以建立本文中提及的診斷標志物的參考量，并且可以將來自受試者的樣品中的標志物的量簡單地與參考量比較。診斷和/或預后測試的靈敏性和特異性不僅僅取決于測試的分析“質量它們還取決于對什么組成異常結果的定義。實際上，通常通過將變量的值對其在“正常”和“疾病”群體中的相對頻率作圖，來計算接受者操作特征曲線(ReceiverOperatingCharacteristiccurve)或者“ROC”曲線(還參見上文)。在參考結果獲自已知患前列腺癌的受試者或者群組的情況下，可以基于獲自測試樣品的測試結果與前述參考結果之間的同一性或者類似性的程度，即基于本文中所提及的至少一種標志物的相同或相似定性或定量組成，來診斷所述疾病。在定量測定的情況下，如果特征性特性的值和強度值是相同的，那么測試樣品的結果和參考結果是相同的。如果特征性特性的值是相同的，但強度值是不同的，那么所述結果是類似的。優選地，該差異是不顯著的，并且其特征在于強度的值至少在參考值的1%_99%、5%-95%,10%-90%,20%-80%,30%-70%,40%-60%之間的區間內，參考值的50%、60%、70%、80%、90%或者95%。在參考結果獲自已知未患前列腺癌的受試者或群組的情況下，可以基于獲自測試樣品的測試結果與前述參考結果之間的差異，即本文中所提及的至少一種標志物的定性或定量組成的差異，來診斷所述疾病。如果使用如上文所述的計算參考值，那么應用相同的方法。優選地，差異應當是根據本發明的診斷標志物的絕對量或者相對量的增加。優選地，相對量或者絕對量的增加是顯著的，即在參考值的45%-55%,40%-60%,30%-70%,20%-80%U0%-90%,5%-95%U%-99%之間的區間之外。因此，參考值可以來源于已知患前列腺癌的受試者。優選地，測試樣品和參考樣品的相同或相似結果指示患者患前列腺癌。如上所述，參考值還可以來源于已知未患前列腺癌的受試者。根據本發明的診斷標志物的量大于所述參考值優選地指示患者患前列腺癌。此外，還考慮將閾值量用作為參考量。可以將高于閾值量的測試樣品中如本文中所提及的標志物的量用于指示受試者患前列腺癌，其中將低于閾值量的量用于指示患者未患前列腺癌。有利地，已經顯示，與來自未患前列腺癌的受試者的樣品比較，本文中所提及的標志物在來自患前列腺癌的受試者的樣品中是增加的。因此，測定所述標志物允許在疑似患前列腺癌的受試者中可靠的診斷前列腺癌。如果在血液、血漿或血清樣品中測定所述標志物的量，那么前述方法是特別有利的，因為可以容易地獲得這些樣品。如已在本文中其他地方所述，進展的分類和測定是重要的，以允許進行有效的和合適的治療性干預。具體而言，希望在前列腺癌進展到轉移發生階段，例如階段3a和3b之前，開始治療性干預。多種miRNA(或者其前體分子)的測定允許可靠地分期前列腺癌(參見上文)。因為前列腺癌的治療取決于前列腺癌的階段，所以這些標志物的測定允許對患前列腺癌的患者的治療做出決定。因此，本發明涉及鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的方法，所述方法包括a)測定在來自患前列腺癌的受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，b)將如在步驟a)中測定的所述至少一種miRNA或者所述前體分子的量與參考量比較，和c)鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者。就實際的情況，可以將上文中做出的定義和說明應用于前述方法(除非另外指明)。前述方法允許鑒定受試者是否對前列腺癌治療敏感，并因此測定患前列腺癌的受試者是否會受益于前列腺癌治療。合適的前列腺癌治療包括手術、放療和更優選地，全身化療。所述治療是本領域熟知的，并例如描述于HeidenreichA,AusG,BollaM，等人，EAUguidelinesonprostatecancer。EurUrol2008;53:68-80中或者NCCNClinicalPracticeGuidelinesinOncologtProstateCancer,第一版2008年中。應當理解，優選地，用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的前述方法的參考應當來源于已知經受患局限性晚期前列腺癌(PT2)或者全身性階段前列腺癌(ρΝ+、Μ+)的受試者的受試者。更優選地，測試樣品和參考樣品的相同或相似結果指示受試者在該情況下對前列腺癌治療是敏感的。備選地，參考物優選地可以來源于已知未患局限性晚期前列腺癌(ρΤ2)或者全身性階段前列腺癌(ρΝ+、Μ+)的受試者，并因此，例如來源于患局限性前列腺癌(ρΤ2)的受試者。更優選地,與所述參考物比較,miRNA或者其前體的量增加(優選統計學顯著增加)，表明受試者對前列腺癌治療是敏感的。可以在無需另外費力的情況下，通過本領域技術人員測定增加是否是統計學顯著的。本發明還涉及診斷前列腺癌的進展的方法，包括a)測定在來自患前列腺癌的受試者的第一樣品中，選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，和b)測定在所述受試者的第二樣品中至少一種miRNA或者所述至少一種miRNA的所述前體分子的量，和c)將所述第一樣品中的量與所述第二樣品中的所述量比較。與第一樣品中的量比較，在第二樣品中標志物的量優選增加，更優選地，統計學顯著的增加，指示了進展性前列腺癌。術語“前列腺癌的進展”和“進展性前列腺癌”指前列腺癌從一個階段轉變到另一個階段，優選地，轉變到更晚期。優選地，由本發明方法所涉及的前列腺癌的進展是從局限性(PT2)進展到局限性晚期(ρΤ3)或者全身性階段(ρΝ+、Μ+)。如已在本文中其他地方所述，進展的分類和測定是重要的，以允許進行有效的和合適的治療性干預。優選地，第二樣品在所述第一樣品后4-6個月內、6-12個月內、12-24個月內，和更優選地，24-48個月內獲得。如上所述，與所述第一樣品中所述標志物的量比較，所述第二樣品中標志物的量的增加指示了前列腺癌的進展。優選地，所述增加是統計學顯著的。可以在無需另外費力的情況下，通過本領域技術人員測定增加是否統計學顯著。指示前列腺癌進展的優選的增加為20%、30%40%、50%和更優選地100%。此外，本發明考慮用于監測前列腺癌治療或者針對進展性前列腺癌的治療的成功的方法。該方法也包括本發明前述方法和基于診斷結果鑒定成功的治療的步驟。應當理解，成功的治療應當導致至少一種生物標志物從患病或者晚期階段到健康或者更早期的疾病階段的減少(優選地，顯著減少)。此外，本發明還涉及適合于實施本發明方法的試劑盒和裝置。因此，本發明涉及適合于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的裝置，包括a)分析單位，其包含用于選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子的檢測試劑，其中所述分析單位適合于測定在由檢測試劑檢測的樣品中所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量，和b)包含計算機的評價單位，其包含確定植入的計算機程序，所述程序編碼用于實施獲自分析單位的測定量與參考量的比較。此外，本發明涉及適合于在疑似患前列腺癌的受試者中診斷前列腺癌的裝置，包括a)分析單位，其包含用于選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子的檢測試劑，其中所述分析單位適合于在由檢測試劑檢測的樣品中測定所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量，和b)包含計算機的評價單位，其包含確定植入的計算機程序，所述程序編碼用于實施獲自分析單位的測定量與參考量的比較。此外，本發明涉及適合于鑒定對前列腺治療敏感的受試者的裝置，包括a)分析單位，其包含選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子的檢測試劑，其中所述分析單位適合于在由檢測試劑檢測的樣品中測定所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量，和b)包含計算機的評價單位，其包含確定植入的計算機程序，所述程序編碼用于實施獲自分析單位的測定量與參考量的比較。如本文中所用，術語“裝置”指至少包含相互有效連接以允許預測的前述工具的工具的系統。在本發明方法的情況下，上文公開了用于測定本文中所提及的標志物的量的優選工具和用于實施比較的工具。如何以有效方式連接工具取決于裝置中包含的工具的類型。例如，如果應用自動測定所述標志物的量的工具，那么可以通過例如，計算機程序處理由所述自動運行工具獲得的數據，以診斷或者區分本文中所提及的疾病。優選地，在該情況下，工具由單一裝置包含。所述裝置可以因此包含用于測量樣品中標志物的量的分析單位和用于處理用于差別診斷的結果數據的計算機單位。在涉及以上本發明方法的實施方案的情況下，公開了用于檢測的優選工具。在該情況下，工具是有效連接的，因為由于用戶手冊給出的說明和解釋，系統的使用者會將量和其診斷值的測定結果放在一起。在該實施方案中，工具可以表現為分離的裝置，并優選地包裝在一起作為試劑盒。本領域技術人員知道如何在不需另外費力的情況下連接工具。優選的裝置是那些不需要應用專業醫師的具體知識的裝置，例如，電子裝置，其僅需要裝載樣品。結果可以給出為參數性診斷原始數據的輸出，優選地，作為絕對量或者相對量。應當理解，這些數據需要由醫師解釋。然而，還設想專家系統裝置，其中輸出包括經處理的診斷原始數據，所述經處理的診斷原始數據的解釋不需要專業醫師。另外優選的裝置包括根據本發明方法的上文所提及的分析單位/裝置或者評價單位/裝置。此外，本發明涉及適合于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的試劑盒，包括a)用于選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA_200b、miRNA-516a_3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子的檢測試劑，和b)適合于測定由所述檢測試劑檢測的所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量的裝置，其中所述裝置還適合于實施所述量與參考量的比較。此外，本發明涉及適合于在疑似患前列腺癌的受試者中診斷前列腺癌的試劑盒，包括a)用于選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子的檢測試劑，和b)適合于測定由所述檢測試劑檢測的所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量的裝置，其中所述裝置還適合于實施所述量與參考量的比較。此外，本發明涉及用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的試劑盒，包括a)用于選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子的檢測試劑，和b)適合于測定由所述檢測試劑檢測的所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量的裝置，其中所述裝置還適合于實施所述量與參考量的比較。如本文中所用，術語“試劑盒”指優選地，以分離的或者在單一容器內提供的前述工具的集合。該容器還優選地包含用于實施本發明方法的說明書。因此，本發明涉及包含用于測量本文中所提及的標志物的工具或者試劑的試劑盒。已經在該說明書中給出了此類工具或者試劑及其使用方法的實例。該試劑盒優選地含有立即可用方式的前述工具或者試齊U。優選地，該試劑盒可以額外包含說明書，例如，用于解釋有關由本發明方法所提供的診斷的任一測定結果的用戶手冊。特別地，該手冊可以包括將測定的標志物的量分配給診斷類型的信息。在該說明書中其他地方可以發現詳細說明。另外地，該用戶手冊可以提供有關正確使用試劑盒的組分用于測定各個生物標志物的量的說明。用戶手冊可以以紙質或者電子形式提供，例如存儲在CD或者CDROM上。本發明還涉及所述試劑盒在根據本發明的任一方法中的用途。最后，本發明涉及來自患前列腺癌的受試者的樣品中的選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA_200b、miRNA-516a_3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子用于分期前列腺癌的用途。本發明還設想來自患前列腺癌的受試者的樣品的選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a_3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的用途。最后，本發明涉及來自疑似患前列腺癌的受試者的血液、血清或者血漿樣品的選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子在診斷前列腺癌中的用途。以上提及的全部參考文獻就其全部公開內容以及在以上說明書中所明確提及的其特定公開內容并入本文作為參考。附圖顯示了圖I:在來自前列腺癌患者的血清中的循環miRNA水平。368種循環miRNA的MA圖。紅色，用Limma分析鑒定的69種miRNA(p<O.05，沒有多重檢驗)。圖2:在取自患轉移性PCa(η=7)和原發性PCa(η=13)的患者的血清樣品中，循環miRNA-375的Ct值。fdr=O.036(差異表達的檢驗；在多重檢驗調整后)。圖3:基于5種循環miRNA的表達水平的45個血清樣品的聚類。表達水平在熱圖(heatmap)用顏色標示。Gleason得分:黑色,彡8或者M+;深灰色,Gleason7;淺灰色，Gleason6;NM(淋巴結狀態或者轉移)黑色，NI或者M+;淺灰色，NO;白色，NX;M(轉移)黑色，M+;淺灰色，MX。圖4:miRNA_375在45個樣品中的前驗證。通過a)風險[9個高風險腫瘤(Gleason>8或者M+),21個中等風險腫瘤(Gleason7)和15個低風險腫瘤(Gleason6)];和b)淋巴結狀態(12個腫瘤NI或者M+對21個腫瘤NO)分組血清樣品中的miRNA-375Ct值。使用Wilcoxon檢驗測定統計學顯著差異。圖5:循環miRNA的確認。通過a)風險組[9個高風險腫瘤(Gleason彡8或者M+),21個中等風險腫瘤(Gleason7)和15個低風險腫瘤(Gleason6)]分組血清樣品中的miRNACt值。現通過以下實施例說明本發明，其并不意圖限定或者限制本發明的范圍。實施例I:為了篩選與前列腺癌進展相關的循環miRNA，分析了21個血清樣品。純化RNA，并用低密度Taq-Man陣列測量667種miRNA。由于大量未測定值(768個中的610個)，將一個樣品(IGPS-20)舍棄為異常值。當與那些具有原發性前列腺癌的患者比較時，在取自具有轉移性腫瘤的患者的血清樣品中，循環miRNA的整體豐度顯示出顯著更高水平的無細胞miRNA(P=O.02,Wilcoxon檢驗)。Limma分析在該組中鑒定了69種具有更高豐度的miRNA(P<O.05，在沒有調整進行多重檢驗的情況下；圖I)。miRNA-375是頂端的標志物，并且是在具有遠端轉移的患者的血清中具有顯著更高的豐度的唯一循環miRNA(fdr=O.036;圖2)。具有轉移性前列腺癌的患者和具有原發性癌的患者的血清之間的對數倍數改變相當高(4Ct值)。全部樣品都在可測量的范圍內(Ct<40;圖I和2)。實施例2從篩選研究中挑選了miRNA-375和4個另外的循環miRNA(miRNA_9'miRNA-141、miRNA-200b和miRNA-516a_3p)，用于在獨立患者群組的45個血清樣品中進行確認。分級聚類分析顯示，5個患者表現出高水平的所選定的循環miRNA(圖3)。這些患者的腫瘤以至少一個不利的風險因子(高Gleason得分、淋巴結侵犯或者遠端轉移)為特征。相反，具有低風險譜(低等級的腫瘤、局限于器官的腫瘤)的患者顯示出低水平的5種所選定的miRNAο在樣品集合中，miRNA-141和miRNA_200b是高度相關的(Pearson；r=O.8；95%Cl=O.66)。對于分析，根據患者的Gleason得分、淋巴結和pT狀態分組全部血清樣品。將來自具有遠端轉移的患者的血清樣品包含在Gleason得分>8腫瘤和淋巴結陽性患者組中。在具有Gleason得分6(低風險)、7(中等風險)和>8(聞風險；圖5)腫瘤的患者中檢測循環miRNA的不同水平。然而，在全部3個逐組比較中，只有miRNA-375顯示出顯著的差異(圖4a)。此外，在具有淋巴結陽性狀態(P=O.034;圖4b)或者病理學階段pT3的患者的血清中，miRNA-375具有顯著更高的豐度(P=O.021)。具有骨轉移的3個患者在那些在血清中具有4個最高豐度值的miRNA-375的患者中。在確認研究中，與PSA組合分析循環miRNA-375。在具有高風險腫瘤(Gleason得分彡8或者具有轉移性前列腺癌的患者)的患者的血清中miRNA-375水平顯著更高(圖4a)。與此相比，PSA水平不能區分Gleason7和Gleason^8腫瘤或者不同的淋巴結狀態。然而，當與那些具有Gleason得分為7的腫瘤的患者比較，PSA水平在具有低風險腫瘤(Gleason得分3+3)的患者中顯著更低。為了評估兩種(miRNA-375和PSA)標志物對臨床-病理學終點預測的影響，應用了ANOVA分析。PSA顯著區分了Gleason6和Gleason7腫瘤(表I)，并且miRNA-375的添加進一步顯著改進了預測準確性。與此相反，Gleason7和Gleason^8之間基于PSA的比較在ANOVA分析中并沒有顯示出顯著的差異。然而，將miRNA-375引入到模型中導致預測能力的改進。此外，當加入到PSA預測模型時，miRNA-375改進了淋巴結和病理學狀態的預測。表1:AN0VA分析在ANOVA模型中有助于顯著性影響的參數的P值。第一行PSA單獨對區分不同病理學參數的影響。第二行miRNA-375對已含PSA的模型的額外影響權利要求1.用于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的方法，包括a)測定來自所述受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA_200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，b)將如在步驟a)中測定的所述至少一種miRNA或者所述前體分子的量與一種或多種參考量比較,并c)基于在步驟b)中獲得的信息對所述受試者中前列腺癌分期。2.權利要求I的方法，其中所述樣品是血液、血漿或血清樣品。3.權利要求I和2的方法，其中所述量通過定量實時PCR測定。4.權利要求I至3中任一項的方法，其中所述分期包括區分原發性前列腺癌和轉移性前列腺癌。5.權利要求I至4中任一項的方法，其中所述至少一種miRNA或者其前體分子的量大于參考量表明所述受試者患轉移性前列腺癌，并且其中所述至少一種miRNA或者其前體分子的量低于參考量表明所述受試者患原發性前列腺癌。6.權利要求I至3中任一項的方法，其中所述分期包括區分高風險、中等風險和低風險。7.用于診斷前列腺癌的進展的方法，包括a)測定來自患前列腺癌的受試者的第一樣品中選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，和b)測定所述受試者的第二樣品中至少一種miRNA或者所述至少一種miRNA的所述前體分子的量，和c)將所述第一樣品中的量與所述第二樣品中的所述量比較。8.用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的方法，所述方法包括a)測定來自患前列腺癌的受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA_200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，b)將如在步驟a)中測定的所述至少一種miRNA或者所述前體分子的量與一種或多種參考量比較，和c)鑒定對如列腺癌治療敏感的受試者。9.用于在患前列腺癌的受試者中診斷前列腺癌的方法，所述方法包括a)測定來自所述受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA_200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA的量或者所述至少一種miRNA的前體分子的量，b)將如在步驟a)中測定的所述至少一種miRNA或者所述前體分子的量與一種或多種參考量比較，和c)基于步驟b)中獲得的信息診斷所述受試者中的前列腺癌。10.適合于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的裝置，其包含a)分析單位，其包含如在權利要求I中所定義的至少一種miRNA分子或者其前體分子的檢測試劑，其中所述分析單位適合于測定由所述檢測試劑檢測的樣品中所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量，和b)包含計算機的評價單位，其包含確實嵌入的計算機程序代碼，所述程序代碼用于執行獲自所述分析單位的測定量的比較。11.適合于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的試劑盒，其包含a)如在權利要求I中所定義的至少一種miRNA分子或者其前體分子的檢測試劑，和b)適合于測定由所述檢測試劑檢測的所述至少一種miRNA分子或者其前體分子的量的裝置，其中所述裝置還適合于實施如在權利要求I至6中所定義的所述量的比較。12.來自患前列腺癌的受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA_200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子用于分期前列腺癌的用途。13.來自患前列腺癌的受試者的樣品中的選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA_200b、miRNA-516a-3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的用途。14.來自患疑似患前列腺癌的受試者的樣品中選自miRNA-375、miRNA_141、miRNA-200b、miRNA-516a_3p和miRNA9*的至少一種miRNA或者其前體分子用于診斷前列腺癌的用途。全文摘要本發明涉及用于在患前列腺癌的受試者中分期前列腺癌的方法，所述方法包括(a)測定在來自所述患者的樣品中選自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一種miRNA的量或者前體分子的量和(b)將如此測定的量與參考量比較。此外，本發明涉及用于鑒定對前列腺癌治療敏感的受試者的方法，以及用于診斷前列腺癌的方法。本發明還涉及適合于實施本發明方法的試劑盒和裝置。文檔編號C12Q1/68GK102782151SQ201080049408公開日2012年11月14日申請日期2010年10月29日優先權日2009年10月29日發明者A·黑澤,H·舒爾特曼,J·C·布拉澤,M·約翰內斯,M·費爾特,R·庫納,T·拜斯巴爾特,T·施托伊貝爾,T·施洛姆申請人:德國癌癥研究中心,漢堡-艾蓬多夫大學門診