專利名稱：用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法以及以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法，以及使用該方法的以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造方法。
背景技術(shù)：
嘗試以逐個的水平確定、選擇細(xì)胞，并使用所選擇的細(xì)胞。例如，對分別檢出逐個淋巴細(xì)胞的抗原特異性、進(jìn)而回收所檢出的一個抗原特異性淋巴細(xì)胞、使用所回收的一個抗原特異性淋巴細(xì)胞，例如制造抗體進(jìn)行了研究(專利文獻(xiàn)I)。專利文獻(xiàn)I中，為了檢出抗原特異性淋巴細(xì)胞，而使用微孔陣列芯片。該微孔陣列芯片中，各微孔的形狀及尺寸具有一個微孔僅容納一個淋巴細(xì)胞的形狀及尺寸。已知若在基板表面培養(yǎng)動物細(xì)胞則稱為細(xì)胞外基質(zhì)的粘接蛋白質(zhì)在細(xì)胞外形成，將細(xì)胞附著在基板表面。已知將如此附著在基板表面上的細(xì)胞剝離而利用。作為剝離方法，也已知利用電刺激(專利文獻(xiàn)2 4)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)I日本特開2004-173681號公報 專利文獻(xiàn)2日本特開2008-295382號公報 專利文獻(xiàn)3日本特開2005-312343號公報 專利文獻(xiàn)4日本特開平10-42857號公報 專利文獻(xiàn)I 4的全部記載特別地合并于此作為公開。
發(fā)明內(nèi)容
但是，利用細(xì)胞外基質(zhì)實現(xiàn)的細(xì)胞對基板表面的附著、通過電刺激進(jìn)行的細(xì)胞的剝離未用作將動物細(xì)胞分別逐個地配置在基板表面上的技術(shù)方案。本發(fā)明的目的在于提供不使用微孔就可以將動物細(xì)胞分別逐個地配置在基板表面上的新的技術(shù)方案。本發(fā)明人為了達(dá)成上述目的而進(jìn)行各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過細(xì)胞外基質(zhì)的吸附和利用細(xì)胞外基質(zhì)的部分性的電刺激進(jìn)行的剝離，可以形成可以個別附著動物細(xì)胞的培養(yǎng)基板，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。[I]用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法，含有(1)準(zhǔn)備在電極基板表面上以陣列狀具有吸附用表面的基板的步驟，
(2)在上述基板的電極表面及吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)的步驟，和
(3)對上述電極施加微弱電位，將電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離，而得到在吸附用表面上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的步驟。[2]以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造方法，含有
(1)準(zhǔn)備在電極基板表面上以陣列狀具有吸附用表面的基板的步驟，
(2)在上述基板的電極表面及吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)的步驟，
(3)對上述電極施加微弱電位，將電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離，而得到在吸附用表面 上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的步驟，和
(4)在步驟(3)中得到的基板表面上培養(yǎng)動物細(xì)胞，得到在吸附用表面上附著有動物細(xì)胞的基板的步驟。[3] [I]或[2]中記載的制造方法，其中，陣列狀的各吸附用表面的尺寸為在一個吸附用表面上可以附著一個動物細(xì)胞的尺寸。[4] [I] [3]中任意一項記載的制造方法，其中，上述基板選自非導(dǎo)電性的有機(jī)材料和無機(jī)材料。[5] [I] [3]中任意一項記載的制造方法，其中，上述基板為玻璃、塑料或陶瓷。[6] [I] [4]中任意一項記載的制造方法，其中，步驟(3)中的上述微弱電位在一0. 4V 一0. 2V 或+ 0. 2V + 0. 5V(相對于 Ag/AgCl (vs. Ag/AgCl))的范圍。[7] [2] [6]中任意一項記載的制造方法，其中，步驟⑷中的動物細(xì)胞的培養(yǎng)在對上述電極施加一 0. 4V 一 0. 2V(相對于Ag/AgCl)范圍的電位、抑制動物細(xì)胞對于上述電極的附著的同時進(jìn)行。[8] [2] [6]中任意一項記載的制造方法，其中，步驟⑷中的動物細(xì)胞的培養(yǎng)以對上述電極施加正電位、在上述電極上附著動物細(xì)胞的方式進(jìn)行，得到在吸附用表面及電極上附著有動物細(xì)胞的基板。根據(jù)本發(fā)明，可以形成可以個別附著動物細(xì)胞的培養(yǎng)基板，若使用該培養(yǎng)基板則也可以將動物細(xì)胞分別逐個地配置在基板表面上。
[圖I]表示實施例I中的電極制造順序的說明圖。[圖2]表不步驟⑵ ⑷的說明圖。[圖3]表示使用FITC標(biāo)記膠原蛋白I作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)時的圖案電極表面的圖像。[圖4]表示使用FITC標(biāo)記膠原蛋白I作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)時的圖案電極表面的圖像。[圖5]表示使用FITC標(biāo)記聚-L-賴氨酸(poly-L-lysin)作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)時的圖案電極表面的圖像。[圖6]表示實施例2中得到的培養(yǎng)動物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)24小時后的電極表面的圖像。[圖7]表示實施例3中得到的培養(yǎng)動物細(xì)胞(PC12細(xì)胞)24小時后的電極表面的圖像。[圖8]表示參考例I中的ITO電極表面對于水的接觸角的測定結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明涉及用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法，以及使用該基板的以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造方法。用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法含有以下的步驟(I) (3)，以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造方法含有以下的步驟(I) ⑷。步驟(I)
步驟(I)為準(zhǔn)備在電極基板表面上以陣列狀具有吸附用表面的基板的步驟。電極基板在絕緣性的基板的表面的一部分或全部上具有電極，例如可以為在載玻片(slide glass)上涂布氧化銦(ITO)而成的基板。但是，絕緣性基板并非意圖限于載玻片，電極并非意圖限 于氧化銦(ITO)。上述電極基板在表面上以陣列狀具有吸附用表面。吸附用表面為用于吸附細(xì)胞外基質(zhì)的電極以外的表面，由可以吸附細(xì)胞外基質(zhì)的材料構(gòu)成?？梢晕郊?xì)胞外基質(zhì)的材料例如可以為玻璃，但是若為非導(dǎo)電性的固體則不特別限定，可以為非導(dǎo)電性的有機(jī)材料、無機(jī)材料。作為非導(dǎo)電性的有機(jī)材料、無機(jī)材料，除了玻璃之外,還可以舉出例如塑料、陶瓷等。因此，作為吸附用表面，可以示例玻璃表面，但是并非意圖限于玻璃表面，可以從非導(dǎo)電性的有機(jī)材料、無機(jī)材料中適當(dāng)選擇。而且，利用顯微鏡等觀察細(xì)胞外基質(zhì)的吸附、細(xì)胞的附著狀態(tài)時，優(yōu)選基板透明。陣列狀例如指的是縱列和橫列分別以多個微小區(qū)域配置吸附用表面。對縱列和橫列各自的微小區(qū)域數(shù)目不特別限定，可以根據(jù)動物細(xì)胞的種類(尺寸)、以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的利用目的等適當(dāng)決定，例如可以在縱10 IO5X橫10 IO5的范圍。但是，并非意圖限定于該范圍。吸附用表面的形狀為矩形(三角形、正方形、長方形、多邊形等)、圓形、橢圓形等，可以適當(dāng)決定。陣列狀的各吸附用表面的尺寸可以為在一個吸附用表面上可以附著一個動物細(xì)胞的尺寸。動物細(xì)胞的尺寸根據(jù)細(xì)胞而多種多樣，因此可以根據(jù)所附著的動物細(xì)胞的尺寸適當(dāng)決定吸附用表面的尺寸。其中，例如動物細(xì)胞為HeLa時，吸附用表面的尺寸例如可以在25 IOOiim的范圍。此外，陣列狀的各吸附用表面的尺寸也可以為在一個吸附用表面上可以附著兩個以上動物細(xì)胞的尺寸。電極基板表面上的陣列狀吸附用表面可以如下形成，在基板表面上涂布電極層，將陣列狀吸附用表面用的掩模在電極層表面上形成，接著通過掩模將電極層表面蝕刻，除去掩模?；蛘撸陔姌O基板表面上形成陣列狀吸附用表面也可以如下進(jìn)行，在基板表面上通過陣列狀吸附用表面用的掩模涂布電極層，接著除去掩模。電極層的形成、電極層表面的蝕刻等可以使用常規(guī)方法適當(dāng)實施。步驟(2)
步驟(2)為在步驟(I)中準(zhǔn)備的基板的電極表面及吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)的步驟。如圖2的步驟⑵所示，在基板的電極表面以及吸附用表面(陣列電極表面)上吸附細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)可以為細(xì)胞粘接性的蛋白質(zhì)，例如可以為含有膠原、蛋白聚糖、透明質(zhì)酸、纖連蛋白、層粘連蛋白、生腱蛋白、巢蛋白等的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)可以獲得市售品。細(xì)胞外基質(zhì)對基板表面的吸附可以如下實施，將含有細(xì)胞外基質(zhì)的水溶液涂布在基板表面上，或?qū)⒒灞砻嬉猿系臓顟B(tài)浸潰在含有細(xì)胞外基質(zhì)的水溶液中，并靜置。步驟(3)
步驟(3)為通過對吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的電極施加微弱電位，將電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離，而得到在吸附用表面上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的步驟。如圖2的步驟(3)所示，在維持吸附用表面(中央部)的細(xì)胞外基質(zhì)的吸附的狀態(tài)下，施加了微弱電位的電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離。微弱電位例如在一 0. 4V 一 0. 2V或+ 0. 2V + 0. 5V(相對于Ag/AgCl)的范圍從吸附在吸附用表面上的細(xì)胞外基質(zhì)維持吸附、可以剝離電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)的觀點考慮是優(yōu)選的。微弱電位優(yōu)選例如在一 0. 4V 一 0. 2V(相對于Ag/AgCl)的范圍的微弱電位的施加可以根據(jù)吸附在電極表面上的細(xì)胞外基質(zhì)的量、細(xì)胞外基質(zhì)的種類適當(dāng)決定，例如可以在2小時 24小時的范圍實施。通過微弱電位的施加進(jìn)行剝離后，還可以根據(jù)需要洗滌基板表面，將游離的細(xì)胞外基質(zhì)除去。通過步驟(I) (3)，可以制造用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板。至此得到的用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板進(jìn)而供給以下的步驟(4)，其可以用于以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造中。步驟(4)
步驟(4)為在步驟(3)中得到的基板表面上培養(yǎng)動物細(xì)胞，得到在吸附用表面上附著有動物細(xì)胞的基板的步驟。如圖2的步驟(4)A所示，在吸附用表面上附著動物細(xì)胞。對于在基板表面上培養(yǎng)的動物細(xì)胞不特別限定，可以是例如人正常細(xì)胞、ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、CHO細(xì)胞等?；灞砻嫔系膭游锛?xì)胞的培養(yǎng)條件可以根據(jù)動物細(xì)胞的種類適當(dāng)采用公知的培養(yǎng)條件。若向基板表面供給含有動物細(xì)胞的培養(yǎng)液，在對應(yīng)于動物細(xì)胞的種類的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，則在吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)，因此在細(xì)胞外基質(zhì)上附著動物細(xì)胞，在吸附用表面上附著動物細(xì)胞。由此，制造以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板。另外，步驟⑷中的動物細(xì)胞的培養(yǎng)可以在對上述電極施加一0. 4V 一0. 2V (相對于Ag/AgCl)范圍的電位、抑制動物細(xì)胞對于上述電極的附著的同時進(jìn)行。如圖2的步驟
(4)B所示,通過對電極施加一 0. 4V 一 0. 2V(相對于Ag/AgCl)范圍的電位,抑制動物細(xì)胞對于電極的附著，在吸附用表面上附著動物細(xì)胞。例如培養(yǎng)在血清中進(jìn)行時，由于血清中含有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，通過在培養(yǎng)期間施加一 0. 2V 一 0. 4V(相對于Ag/AgCl)的負(fù)電位，可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)對電極的吸附，結(jié)果可以抑制動物細(xì)胞對電極的附著。此外，即使在無血清進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，由于動物細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，動物細(xì)胞有可能附著在電極上，此時，通過在培養(yǎng)期間施加一 0. 2V 一 0. 4V(相對于Ag/AgCl)的負(fù)電位，也可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)對電極的吸附，抑制動物細(xì)胞對電極的附著。進(jìn)一步地，由于動物細(xì)胞具有負(fù)電荷，也可以抑制動物細(xì)胞在上述施加了負(fù)電位的電極基板表面上的附著。由此，在施加了負(fù)電位的電極表面上不附著動物細(xì)胞，可以將細(xì)胞僅附著在欲附著動物細(xì)胞的陣列狀圖案部分。進(jìn)一步地，步驟(4)中的動物細(xì)胞的培養(yǎng)，也可以以對上述電極施加正電位、在上 述電極上附著動物細(xì)胞的方式進(jìn)行，得到在吸附用表面及電極上附著有動物細(xì)胞的基板。由于如上所述動物細(xì)胞具有負(fù)電荷，通過靜電引力，可以在施加了正電位的電極基板表面上感應(yīng)附著動物細(xì)胞。因此，若對上述電極施加正電位，則在未涂布膠原等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的部位，也可以良好地附著細(xì)胞。對于正電位，從利用靜電引力實現(xiàn)的動物細(xì)胞的感應(yīng)附著和不會對動物細(xì)胞造成損傷的觀點考慮，例如在+ 0. 2V + I. OV (相對于Ag/AgCl)、優(yōu)選在+ 0. 2V + 0. 6V(相對于Ag/AgCl)的范圍是合適的。利用本發(fā)明的方法制造的以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板例如可以用于調(diào)查動物細(xì)胞的性質(zhì)、或調(diào)查由動物細(xì)胞排出的物質(zhì)。特別是通過以陣列狀將動物細(xì)胞逐個地配置在培養(yǎng)基板表面上，可以以單一細(xì)胞水平分析通過物理化學(xué)刺激而活化的機(jī)理。進(jìn)一步地，附著在電極基板表面以及電極基板表面附近的吸附用表面上的細(xì)胞例如可以通過將頻率在IKHz IOMHz的范圍、且±1. 0V(相對于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度的高頻變動電位(波形例如為矩形波、正弦波或三角波)施加到電極上來剝離。其中，剝離時的培養(yǎng)液為磷酸緩沖液(不含Ca2'Mg2 + )從容易剝離的觀點考慮是優(yōu)選的。實施例
以下通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。實施例I
(I)電極的制造
根據(jù)以下的順序制造電極和3電極培養(yǎng)系統(tǒng)。圖I表示電極制造的順序的說明圖。I)在載玻片(圖I左上)上的中央部以6.3 7.5 Q/cm2涂布氧化銦(ITO)制造圖案電極(IcmXlcm)(圖I左下)。圖案電極如左下所示，分為4個區(qū)域制造，各區(qū)域的圖案A D如圖I的中央所示。黑色部分為玻璃表面，白色部分為ITO電極表面。2)將該載玻片的端部部分用金鋼鉆開孔，用導(dǎo)電性樹脂(Dotite、D-550、藤倉化成(株))連接導(dǎo)線和ITO電極。3)卸除 9 V'' r 'y 夕腔室玻片(Lab-tek chamber slide、177410、NalgeNunc)的腔 室部分，用水槽修復(fù)用硅粘合劑(東芝；'J ^ 一 >、TSE382-C ”了)粘接在ITO圖案電極上。4)在9 7' r 〃々腔室玻片的蓋部分的2個部位用金鋼鉆開孔，連接鉬電極和銀/氯化銀電極。5)組合蓋和腔室，完成3電極培養(yǎng)系統(tǒng)(右上照片)。(2)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的吸附
在(I)制造的3電極培養(yǎng)系統(tǒng)的電極表面上，按照以下的順序吸附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。I)將ITO圖案電極腔室在蒸餾水中超聲波洗滌5分鐘。2)向ITO圖案電極腔室內(nèi)加入IM NaOH，靜置5分鐘。3)將ITO圖案電極腔室用PBS (-)輕輕洗滌后，在凈化臺內(nèi)進(jìn)行UV殺菌處理5分鐘。4)將 0. lmg/ml 的 FITC 標(biāo)記聚-L-賴氨酸(Sigma)的 PBS (-)溶液、或 0. lmg/ml的FITC標(biāo)記膠原蛋白I (Sigma)的0. OlM HCl水溶液加入到腔室內(nèi)，37°C下靜置10分鐘。5)用PBS (_)輕輕洗滌腔室內(nèi)2次后，將ITO圖案電極腔室保存在4°C下，或立即用于實驗。(3)電位施加
在(2)中在電極表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)后，按照以下的順序施加電位，從電極表面剝尚細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。I)向ITO圖案電極腔室內(nèi)加入5ml的PBS (-)。2)安裝連接電極的蓋，形成3電極培養(yǎng)系統(tǒng)。3)利用恒電位儀(PS_14、Toho technical research)施加恒電位，由此剝離細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。4)施加恒電位后用PBS (_)輕輕洗滌。然后用共焦激光顯微鏡(FV500、01ympus)觀察細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的分布。(4)結(jié)果
使用FITC標(biāo)記膠原蛋白I作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)時的結(jié)果如圖3和圖4所示。圖 3為在PBS(-)中施加一0. 4V、一 0. 3V、一 0. 2V、+ 0. 3V或+ 0. 4V的恒電位(相對于Ag/AgCl) 24小時時得到的電極表面的FITC的熒光圖像。在圖案化的玻璃表面(四方形)觀察到熒光，表示吸附了 FITC標(biāo)記膠原蛋白I，在其周圍的ITO電極部分未觀察到熒光，表示FITC標(biāo)記膠原蛋白I剝離。圖4為所施加的恒電位(相對于Ag/AgCl)為+ 0. 4V、施加時間在0 16小時變化時得到的電極表面的FITC的熒光圖像。0 8小時時，在圖案化的玻璃表面(四方形)的周圍的ITO電極部分也觀察到熒光，但是8 16小時時，僅在圖案化的玻璃表面(四方形)觀察到熒光，表示吸附了 FITC標(biāo)記膠原蛋白I，在其周圍的ITO電極部分未觀察到熒光，表示FITC標(biāo)記膠原蛋白I剝離。使用FITC標(biāo)記聚-L-賴氨酸(Sigma)作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)時的結(jié)果如圖5所示。圖 5 為在 PBS (-)中施加一0. 4V、— 0. 3V、— 0. 2V、+ 0. 2V、+ 0. 3V、+ 0. 4V 或+ 0. 5V的恒電位(相對于Ag/AgCl) 24小時時得到的電極表面的FITC的熒光圖像。施加一 0. 4V、一0. 3V、+ 0. 3V、+0. 4V和+ 0. 5V的恒電位(相對于Ag/AgCl) 24小時時，在圖案化的玻璃表面(四方形)觀察到熒光，表示吸附了 FITC標(biāo)記聚-L-賴氨酸，在其周圍的ITO電極部分未觀察到熒光，表示FITC標(biāo)記聚-L-賴氨酸剝離。施加一 0. 2V和+ 0. 2V的恒電位(相對于Ag/AgCl)24小時時，在圖案化的玻璃表面(四方形)的周圍的ITO電極部分也觀察到熒光。實施例2
向在實施例I中使用FITC標(biāo)記膠原蛋白I作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、在PBS(-)中施加一 0. 3V的恒電位(相對于Ag/AgCl)42小時得到的圖案電極的腔室內(nèi)，接種懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中的動物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)I X IO5細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)期間(24小時)，進(jìn)一步施加一 0. 3V的恒電位。施加電位24小時后，對細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的分布用共焦激光顯微鏡(FV500、Olympus)、相差顯微鏡(CKX-41、01ympus)進(jìn)行觀察。培養(yǎng)24小時后的電極表面的圖像如圖6所示。可知在吸附了 FITC標(biāo)記膠原蛋白I的玻璃表面(四方形)上附著了動物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)。對于100 X 100 y m2以及50 X 50 y m2，成功將細(xì)胞僅配置在玻璃基板上。直至25X25iim2也可以進(jìn)行細(xì)胞的配置控制。實施例3
向在實施例I中使用FITC標(biāo)記膠原蛋白I作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、在PBS(-)中施加+ 0. 4V的恒電位(相對于Ag/AgCl)66小時得到的圖案電極的腔室內(nèi)，接種懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中的動物細(xì)胞(PC12細(xì)胞)，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)期間(24小時)，進(jìn)一步施加+ 0. 4V的恒電位。施加電位24小時后，對細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的分布用共焦激光顯微鏡(FV500、Olympus)、相差顯微鏡(CKX-41、Olympus)進(jìn)行觀察。培養(yǎng)24小時后的電極表面的圖像如圖7所不?？芍谖次紽ITC標(biāo)記I父原蛋白I的ITO電極基板表面上附著了動物細(xì)胞(PC12細(xì)胞)。參考例I
測定對ITO電極施加恒電位時的ITO電極的表面對于水的接觸角。測定如下進(jìn)行，在充滿環(huán)辛烷的電解槽中的ITO電極的表面上載置水滴，對施加恒電位(24小時)前后的接觸角進(jìn)行測定。結(jié)果如圖8所示。通過施加一 0. 4V和+ 0. 4V的恒電位(相對于Ag/AgCl)，對于水的接觸角降低約20 40%，可知親水性增加。由該結(jié)果推測，本發(fā)明中的通過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的恒電位施加進(jìn)行的剝離的原因之一為，電極表面的親水性增加。工業(yè)實用性
本發(fā)明對于動物細(xì)胞的培養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域是有用的。
權(quán)利要求
1.用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法，含有 (1)準(zhǔn)備在電極基板表面上以陣列狀具有吸附用表面的基板的步驟， (2)在所述基板的電極表面及吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)的步驟，和 (3)對所述電極施加微弱電位，將電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離，而得到在吸附用表面上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的步驟。
2.以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造方法，含有 (1)準(zhǔn)備在電極基板表面上以陣列狀具有吸附用表面的基板的步驟， (2)在所述基板的電極表面及吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)的步驟， (3)對所述電極施加微弱電位，將電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離，而得到在吸附用表面上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的步驟，和 (4)在步驟(3)中得到的基板表面上培養(yǎng)動物細(xì)胞，得到在吸附用表面上附著有動物細(xì)胞的基板的步驟。
3.如權(quán)利要求I或2所述的制造方法，其中，陣列狀的各吸附用表面的尺寸為在一個吸附用表面上可以附著一個動物細(xì)胞的尺寸。
4.如權(quán)利要求I 3中任意一項所述的制造方法，其中，所述基板選自非導(dǎo)電性的有機(jī)材料和無機(jī)材料。
5.如權(quán)利要求I 3中任意一項所述的制造方法，其中，所述基板為玻璃、塑料或陶瓷。
6.如權(quán)利要求I 4中任意一項所述的制造方法，其中，步驟(3)中的所述微弱電位在一0. 4V 一0. 2V或+ 0. 2V + 0. 5V(相對于Ag/AgCl)的范圍。
7.如權(quán)利要求2 6中任意一項所述的制造方法，其中，步驟(4)中的動物細(xì)胞的培養(yǎng)在對所述電極施加一 0. 4V 一 0. 2V(相對于Ag/AgCl)范圍的電位、抑制動物細(xì)胞對于所述電極的附著的同時進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求2 6中任意一項所述的制造方法，其中，步驟(4)中的動物細(xì)胞的培養(yǎng)以對所述電極施加正電位、在所述電極上附著動物細(xì)胞的方式進(jìn)行，得到在吸附用表面及電極上附著有動物細(xì)胞的基板。
全文摘要
本發(fā)明提供不使用微孔就可以將動物細(xì)胞分別逐個地配置在基板表面上的新的技術(shù)方案。提供含有下述步驟(1)～(3)的用于以陣列狀配置動物細(xì)胞的基板的制造方法、以及含有下述步驟(1)～(4)的以陣列狀配置有動物細(xì)胞的基板的制造方法。(1)準(zhǔn)備在電極基板表面上以陣列狀具有吸附用表面的基板的步驟，(2)在上述基板的電極表面及吸附用表面上吸附細(xì)胞外基質(zhì)的步驟，(3)對上述電極施加微弱電位，將電極表面的細(xì)胞外基質(zhì)剝離，而得到在吸附用表面上吸附有細(xì)胞外基質(zhì)的基板的步驟，和(4)在步驟(3)中得到的基板表面上培養(yǎng)動物細(xì)胞，得到在吸附用表面上附著有動物細(xì)胞的基板的步驟。
文檔編號C12M3/00GK102712898SQ20108004913
公開日2012年10月3日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者小山純弘 申請人:獨立行政法人海洋研究開發(fā)機(jī)構(gòu)