專利名稱：可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將在基板上培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)后由基板以可以増殖的狀態(tài)剝離而制備可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的方法，以及利用該方法的動(dòng)物細(xì)胞片的制備方法。特別地，本發(fā)明涉及利用該剝離方法的皮膚細(xì)胞片的制備方法。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)療中的主要治療原材料為由患者或捐贈(zèng)者提供的人細(xì)胞，為了移植治療，通過細(xì)胞培養(yǎng)使該人細(xì)胞增殖而確保充分的細(xì)胞數(shù)是不可欠缺的。很多細(xì)胞為經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)面的粘接、細(xì)胞延長(zhǎng)、和通過分裂進(jìn)行的増殖的一系列過程而増殖的貼壁依賴性細(xì)胞，通過多次傳代培養(yǎng)，可以增大細(xì)胞數(shù)。此時(shí)必要的要素技術(shù)為細(xì)胞可以粘接、延長(zhǎng)、増殖的培養(yǎng)面，以及從培養(yǎng)面的脫離控制。不僅細(xì)胞可以粘接、増殖方面是重要的，而且不對(duì)所増殖的細(xì)胞造成損傷、以可以增殖的狀態(tài)脫離也是重要的。以往已知的細(xì)胞脫離的方法有酶法、電刺激法和親水度控制法等。酶法為通過利用胰蛋白酶等蛋白酶將細(xì)胞表層的蛋白質(zhì)溶解而剝離的方法。電刺激法為通過在培養(yǎng)面流通電流、溶解細(xì)胞表層的蛋白質(zhì)而剝離的方法。親水度控制法為通過提高培養(yǎng)面的親水性而剝離的方法。這些方法中，酶法為一般的方法。但是，由于酶法將全部細(xì)胞表層溶解，其對(duì)細(xì)胞的損傷大，因此存在再粘接、増殖的效率差的問題。電刺激法為在細(xì)胞與培養(yǎng)面的接點(diǎn)局部地進(jìn)行反應(yīng)而可以進(jìn)行迅速的應(yīng)答的方法。例如專利文獻(xiàn)I中記載了，通過調(diào)整附著了培養(yǎng)細(xì)胞的電極的電位使細(xì)胞自發(fā)地剝離，可以得到損傷少的培養(yǎng)細(xì)胞。此外，專利文獻(xiàn)2中記載了對(duì)于與電極粘接的細(xì)胞，對(duì)該電極施加恒電位來進(jìn)行剝離。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)I日本特開2005-312343號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2日本特開平10-42857號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)I 2的全部記載特別地合并于此作為公開。
發(fā)明內(nèi)容
但是，專利文獻(xiàn)I和2中記載的方法中，附著在電極上的動(dòng)物細(xì)胞有時(shí)不剝離，即使在剝離的情況下，所剝離的細(xì)胞也受到損傷，增殖率低，存在增殖カ差的問題。例如在作為專利文獻(xiàn)2中記載的條件的-1. 2V (相對(duì)于Ag/AgCl(VsAg/AgCl))的恒電位下細(xì)胞剝離，但是由于易產(chǎn)生氫而細(xì)胞受到損傷，可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的比率低。
因此，本發(fā)明的目的在于提供可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法，其中細(xì)胞的粘接、増殖性優(yōu)異，同時(shí)增殖后可以對(duì)細(xì)胞不造成損傷地脫離培養(yǎng)細(xì)胞。進(jìn)一歩地，本發(fā)明的目的在于提供可以增殖的皮膚細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞片的制備方法。本發(fā)明人進(jìn)行了各種研究后發(fā)現(xiàn)，通過在從電極表面剝離培養(yǎng)細(xì)胞中使用高頻變動(dòng)電位，可以解決上述課題，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。[I]可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法，其包括(I)在至少一部分為電極的基板表面上培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的步驟,和(2)對(duì)上述電極施加高頻變動(dòng)電位、將通過培養(yǎng)而附著在上述基板表面上的細(xì)胞剝離的步驟，其特征在于，上述高頻變動(dòng)電位的頻率為IKHz IOMHz的范圍，且形成±1. OV(相對(duì)于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度，以及剝離時(shí)的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)液。[2] [I]中記載的制備方法，其中，上述剝離時(shí)的培養(yǎng)液為磷酸緩沖液(不含 Ca2'Mg2 + )。[3] [I]或[2]中記載的制備方法，其中，上述高頻變動(dòng)電位為矩形波、正弦波或三角波。[4] [I] [3]中任意一項(xiàng)記載的制備方法，其中，上述基板表面全部為電扱。[5] [I] [3]中任意一項(xiàng)記載的制備方法，其中，上述基板表面的一部分為電極，在步驟(2)中剝離電極表面上及電極附近的非電極表面上的細(xì)胞。[6] [I] [5]中任意一項(xiàng)記載的制備方法，其含有將所剝離的可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)一步傳代而維持可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的步驟。[7] [I] [6]中任意一項(xiàng)記載的制備方法，其中，進(jìn)行培養(yǎng)使細(xì)胞形成片狀，將片狀細(xì)胞以可以增殖的狀態(tài)剝離，并得到可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞片。[8] [I] [7]中任意一項(xiàng)記載的制備方法，其中，動(dòng)物細(xì)胞為皮膚細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，通過施加高頻變動(dòng)電位，可以良好地剝離附著在電極上的動(dòng)物細(xì)胞，且所剝離的細(xì)胞的増殖率高，得到増殖カ優(yōu)異的動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于利用化學(xué)上的傳代法時(shí)存在伴有變異等危險(xiǎn)性的干細(xì)胞、iPS細(xì)胞等也可以傳代。
[圖I]表示步驟(I) ⑵的說明圖。[圖2]表示參考例I中的電極制造順序的說明圖。[圖3]表不實(shí)施例I得到的電壓施加時(shí)間為O分鐘、30分鐘、60分鐘的電極表面的圖像。[圖4]表示實(shí)施例I中得到的電剝離后、將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中傳代后的電極表面的圖像。[圖5]表示比較例I中得到的電壓施加時(shí)間為O分鐘、60分鐘的圖像。[圖6]表示比較例2中得到的對(duì)培養(yǎng)基中的人皮膚成纖維細(xì)胞施加±1. 0V、3MHz的電位后的電極表面的圖像。[圖7]表示比較例3中得到的施加-I.OV (相對(duì)于Ag/AgCl)的恒電位O分鐘、60分鐘后的電極表面的圖像。
[圖8]表示比較例3中得到的電剝離后、將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中傳代后的電極表面的圖像。[圖9]表不實(shí)施例2中得到的電壓施加時(shí)間為O分鐘、30分鐘、60分鐘的電極表面的圖像。[圖10]表示參考例2中的ITO電極的表面對(duì)于水的接觸角的測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的方法含有以下的步驟⑴和(2)。步驟(I)
步驟(I)為在至少一部分為電極的基板表面上培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的步驟。作為培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的至少一部分為電極的基板，不特別限定。上述基板表面可以全部為電極，或一部分為電極、一部分為非電極(基板)。進(jìn)ー步地，至少一部分為電極的基板例如可以在電極以外的基板上設(shè)置電極層，也可以如碳電極等那樣全部為電扱。在電極以外的基板上設(shè)置電極層時(shí)，基板可以在絕緣性基板的表面的一部分或全部上具有電極。具有這種電極的基板例如可以為在載玻片(slide glass)上涂布氧化銦(ITO)而成的。但是，絕緣性基板并非意圖限于載玻片，為非導(dǎo)電性的固體即可，不作特別限定，可以為由非導(dǎo)電性的有機(jī)材料、無機(jī)材料組成的絕緣性基板。作為非導(dǎo)電性的有機(jī)材料、無機(jī)材料，除了玻璃之外，還可以舉出例如塑料、陶瓷等。電極并非意圖限于氧化銦(ITO)，可以適當(dāng)利用由公知的電極材料組成的電極。在基板上設(shè)置電極層時(shí)，可以為在基板全部表面上設(shè)置電極層、或在電極基板的表面一部分設(shè)置電極層中的任ー種，在電極基板的表面的一部分設(shè)置電極層時(shí)，電極層例如可以為陣列狀，也可以為條紋狀。對(duì)于本發(fā)明的方法、特別是培養(yǎng)的結(jié)果，可以將形成片狀的動(dòng)物細(xì)胞容易地剝離，而不會(huì)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞造成損傷，電極層可以考慮到動(dòng)物細(xì)胞片的所需大小(面積、尺寸)來適當(dāng)決定。例如，電極的面積例如可以為I 900cm2的范圍。此外，陣列狀例如指的是縱列和橫列分別以多個(gè)微小區(qū)域配置電極層。對(duì)縱列和橫列各自的微小區(qū)域數(shù)目不特別限定，可以根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的種類(尺寸)、以陣列狀配置動(dòng)物細(xì)胞的基板的利用目的等適當(dāng)決定，例如可以為縱10 IO5X橫10 IO5的范圍。但是，并非意圖限定于該范圍。陣列狀電極層表面的形狀為矩形(三角形、正方形、長(zhǎng)方形、多邊形等)、圓形、橢圓形等，可以適當(dāng)決定。陣列狀的各電極表面的尺寸可以為在I個(gè)電極表面上可以附著I個(gè)動(dòng)物細(xì)胞的尺寸。動(dòng)物細(xì)胞的尺寸根據(jù)細(xì)胞而多種多祥，因此可以根據(jù)所附著的動(dòng)物細(xì)胞的尺寸適當(dāng)決定電極表面的尺寸。但是，例如動(dòng)物細(xì)胞為HeLa時(shí)，電極表面的尺寸例如可以為25 100 μ m的范圍。此外，陣列狀的各電極表面的尺寸也可以為在I個(gè)電極表面上可以附著2個(gè)以上動(dòng)物細(xì)胞的尺寸。進(jìn)ー步地，各電極的間隔例如可以為25 100 μ m的范圍。此外，條紋狀的電極層例如可以為以等間隔或不同的間隔設(shè)置多個(gè)相同寬度的帶狀的電極層、以等間隔或不同的間隔設(shè)置多個(gè)不同寬度的帯狀的電極層中的任ー種。對(duì)帯狀的電極層的寬度和帯狀的電極層之間的間隔不特別限定，例如都可以獨(dú)立地為25 100 μ m的范圍。
如后所述，步驟(2)中，不僅可以將電極表面上的細(xì)胞剝離，還可以將電極附近的非電極表面上的細(xì)胞剝離，對(duì)于可以在非電極表面上剝離的細(xì)胞，與電極的距離取決于高頻變動(dòng)電位的頻率和電位，但是為約IOOym以內(nèi)。因此，在陣列狀和條紋狀中的任意ー種情況下，只要電極的間隔在上述25 100 μ m的范圍內(nèi)，則也可以剝離非電極表面上的細(xì)胞。在基板表面上形成陣列狀或條紋狀電極層可以如下進(jìn)行，例如，在基板表面上涂布電極層，將陣列狀或條紋狀電極表面用掩模形成在電極層表面上，然后通過掩模將電極層表面蝕刻，除去掩模?；蛘?，在基板表面上形成陣列狀或條紋狀電極表面可以如下進(jìn)行，在基板表面上通過陣列狀或條紋狀電極表面用掩模涂布電極層，然后除去掩模。電極層的形成、電極層表面的蝕刻等可以使用常規(guī)方法適當(dāng)實(shí)施。本發(fā)明中，對(duì)于成為制備可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的對(duì)照的動(dòng)物細(xì)胞不特別限定，例如可以為皮膚細(xì)胞、干細(xì)胞、iPS細(xì)胞等。至少一部分為電極的基板表面上的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件可以根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的種類適當(dāng)采用公知的培養(yǎng)條件。若向至少一部分為電極的基板的表面供給含有動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液，在對(duì)應(yīng)于動(dòng)物細(xì)胞的種類的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，則在存在電極表面和非電極表面時(shí)，在非電極表面上也附著動(dòng)物細(xì)胞。至少一部分為電極的基板表面上的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)可以在動(dòng)物細(xì)胞個(gè)別存在的條件下實(shí)施、在動(dòng)物細(xì)胞形成塊的條件下實(shí)施、進(jìn)ー步在動(dòng)物細(xì)胞以片狀形成塊的條件下實(shí)施。本發(fā)明中，步驟(2)中，形成塊的動(dòng)物細(xì)胞、以片狀形成塊的動(dòng)物細(xì)胞都可以以可以增殖的狀態(tài)剝離細(xì)胞。步驟(2)
步驟(2)為對(duì)培養(yǎng)而附著細(xì)胞的至少一部分為電極的基板的電極施加高頻變動(dòng)電位，將細(xì)胞剝離的步驟。將附著在電極上的細(xì)胞以及電極附近的非電極表面上的細(xì)胞通過施加高頻變動(dòng)電位來剝離。具體地說，高頻變動(dòng)電位頻率為IKHz IOMHz范圍，優(yōu)選為I 5MHz范圍，電位例如成為±1. OV(相對(duì)于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度，例如可以為±0.9V(相對(duì)于Ag/AgCl)、0.8V(相對(duì)于Ag/AgCl)等。高頻變動(dòng)電位的波形例如可以為矩形波、正弦波、三角波等。進(jìn)ー步地，施加高頻變動(dòng)電位時(shí)，剝離時(shí)的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)基是適當(dāng)?shù)?。這是由于，在含有鈣或鎂的培養(yǎng)液中即使施加高頻變動(dòng)電位，也不能將細(xì)胞電剝離。施加高頻變動(dòng)電位時(shí)，剝離時(shí)的培養(yǎng)液例如可以為磷酸緩沖液(不含Ca2 +、Mg2 + )[PBS (-) ]、Hanks緩沖鹽(不含Ca2 +、Mg2 + )等，其中優(yōu)選為PBS (-)。步驟⑵中，不僅可以將電極表面上的細(xì)胞剝離，還可以將電極附近的非電極表面上的細(xì)胞剝離，對(duì)于可以在非電極表面上剝離的細(xì)胞，與電極的距離取決于高頻變動(dòng)電位的頻率和電位，但是為約IOOym以內(nèi)。施加高頻變動(dòng)電位時(shí)，對(duì)電極上的細(xì)胞直接性地施加電位，對(duì)非電極表面上的細(xì)胞間接性地施加電位。因此，通過電位施加對(duì)細(xì)胞造成的應(yīng)カ對(duì)于非電極表面上的細(xì)胞來說相對(duì)小，即使在由于電位的施加而產(chǎn)生細(xì)胞的損傷時(shí)(這種高頻變動(dòng)電位的條件)，非電極表面上的細(xì)胞也存在損傷相對(duì)少或無損傷的趨勢(shì)。采用由于電位的施加而產(chǎn)生細(xì)胞損傷的程度的強(qiáng)的高頻變動(dòng)電位是細(xì)胞的附著牢固、難以剝離的 情況，因此在這種情況下，也可以進(jìn)行電極的形狀或配置、進(jìn)而非電極表面的選擇，積極地進(jìn)行非電極表面上的細(xì)胞的剝離，以優(yōu)先進(jìn)行非電極表面上的細(xì)胞的剝離。
本發(fā)明的方法中，如圖I所示，步驟(I)中，在基板的電極表面或電極及非電極表面上培養(yǎng)、附著動(dòng)物細(xì)胞。(A)為基板的全部為電極表面的情況，(B)和(C)為基板的一部分為電極、一部分為非電極表面的情況。任意一種情況下，步驟(I)中，通過施加高頻變動(dòng)電位，都可以將附著在電極表面或電極及非電極表面上的動(dòng)物細(xì)胞剝離。本發(fā)明的方法可以含有將所剝離的可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)ー步傳代而維持可以増殖的動(dòng)物細(xì)胞的步驟。維持動(dòng)物細(xì)胞的方法可以根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的種類適當(dāng)采用。步驟(I)中，可以以片狀的塊的方式在電極表面上培養(yǎng)、附著動(dòng)物細(xì)胞，將該片狀的動(dòng)物細(xì)胞以可以增殖的狀態(tài)剝離。因此，在再生醫(yī)療等領(lǐng)域中非常有用。實(shí)施例
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。 參考例I
(I)電極的制造
根據(jù)以下的順序制造電極和3電極培養(yǎng)系統(tǒng)。圖2表示電極制造的順序的說明圖。I)在載玻片(圖2左上)上的中央部以6. 3 7.5 Ω/cm2涂布氧化銦(ITO)制造圖案電極(IcmXlcm)(圖2左下)。圖案電極如左下所示，分為4個(gè)區(qū)域制造，各區(qū)域的圖案A D如圖2的中央所示。黒色部分為玻璃表面，白色部分為ITO電極表面。實(shí)施例中，使用該方式的圖案電扱。2)將該載玻片的端部部分用金鋼鉆開孔，用導(dǎo)電性樹脂(Dotite、D-550、藤倉(cāng)化成(株))連接導(dǎo)線和ITO電極。3)卸除ラブテック腔室玻片(Lab-tek chamber slide、177410、NalgeNunc)的腔室部分，用水槽修復(fù)用硅粘合劑(東芝シリコーン、TSE382-Cクリア)粘接在ITO圖案電極上。4)在ラブテック腔室玻片的蓋部分的2個(gè)部位用金鋼鉆開孔，連接鉬電極和銀/氯化銀電極。5)組合蓋和腔室，完成3電極培養(yǎng)系統(tǒng)(右上照片)。實(shí)施例I
使用參考例I中制造的3電極培養(yǎng)系統(tǒng)，按照以下的順序?qū)嵤﹦?dòng)物細(xì)胞的電傳代法。I)將懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞(正常人皮膚成纖維細(xì)胞)接種到3電極培養(yǎng)系統(tǒng)的ITO圖案電極腔室內(nèi)，培養(yǎng)數(shù)天。2)確認(rèn)細(xì)胞附著在電極基板上，將ITO圖案電極腔室內(nèi)置換為PBS(_)。3)利用連接了函數(shù)產(chǎn)生器(AD8624A、A&D company、Tokyo, Japan)的恒電位儀(PS_14、Toho technical research),將 3MHz、± I. OV (相對(duì)于 Ag/AgCl)的矩形波變動(dòng)電位施加到3電極培養(yǎng)系統(tǒng)中的ITO圖案電極。4)回收從電極剝離的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶后，用相差顯微鏡(CKX-41、Olympus)觀察細(xì)胞附著率及細(xì)胞増殖的有無。結(jié)果如圖3所示，表示電壓施加時(shí)間O分鐘、30分鐘、60分鐘的圖像。在3MHz、-I. OV +1. 0(相對(duì)于Ag/AgCl)的電壓施加條件下，施加30分鐘以上時(shí)，成功剝離細(xì)胞。此時(shí)，未檢出電流(無電化學(xué)反應(yīng))。電剝離后，若將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中傳代，則如圖4所示，4小時(shí)后確認(rèn)88%的細(xì)胞(99個(gè)/112個(gè))正常附著、増殖。
比較例I
除了將電壓施加條件改為3MHz、-O. 4V +0. 4(相對(duì)于Ag/AgCl)之外，在與實(shí)施例I相同的條件下，嘗試從電極剝離細(xì)胞。結(jié)果如圖5所示，表示電壓施加時(shí)間O分鐘、60分鐘的圖像。該電壓施加條件下，即使施加60分鐘，細(xì)胞也幾乎未剝離。比較例2
即使對(duì)培養(yǎng)基中的人皮膚成纖維細(xì)胞施加±1. 0V,3MHz的電位48hr，如圖6所示，由于培養(yǎng)基中的鈣或鎂的影響而細(xì)胞未剝離。比較例3 使用參考例I中制造的3電極培養(yǎng)系統(tǒng)，按照以下的順序通過對(duì)動(dòng)物細(xì)胞施加恒電位來實(shí)施剝離。I)將懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞(正常人皮膚成纖維細(xì)胞)接種到ITO圖案電極腔室內(nèi)，培養(yǎng)數(shù)天。2)確認(rèn)細(xì)胞附著在電極基板上，將ITO圖案電極腔室內(nèi)置換為PBS(_)。3)利用恒電位儀(PS-14、Toho technical research),將-I. OV (相對(duì)于 Ag/AgCl)的恒電位施加到3電極培養(yǎng)系統(tǒng)中的ITO圖案電極。4)用相差顯微鏡(CKX-41、Olympus)進(jìn)行觀察。5)利用含有O. 45%錐蟲藍(lán)的PBS (-)溶液(ICN Biomedicals,Aurora,Ohio,USA)，判別施加電位60分鐘后的動(dòng)物細(xì)胞的生死。結(jié)果如圖7所示，表示電壓施加時(shí)間O分鐘、60分鐘的圖像。該電壓施加條件下，細(xì)胞僅球形化，而幾乎未從電極基板上剝離。錐蟲藍(lán)判別的結(jié)果如圖8所示。透明發(fā)亮的細(xì)胞為活細(xì)胞。染成藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞。細(xì)胞的存活率為11%(23/217個(gè))。實(shí)施例2
除了使用相當(dāng)于圖I的(C)的電極基板之外，與實(shí)施例I同樣地進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)及剝離。圖9表示電壓施加時(shí)間O分鐘、30分鐘、60分鐘的圖像。在3MHz、-I. OV +1. 0(相對(duì)于Ag/AgCl)的電壓施加條件下，施加30分鐘以上時(shí)，成功剝離細(xì)胞。此時(shí)，未檢出電流(無電化學(xué)反應(yīng))。電剝離后，若將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中傳代，則確認(rèn)直至24小時(shí)后細(xì)胞正常附著、增殖。參考例2
測(cè)定對(duì)ITO電極施加恒電位或高頻變動(dòng)電位時(shí)的ITO電極的表面對(duì)于水的接觸角。測(cè)定如下進(jìn)行，在充滿環(huán)辛烷的電解槽中的ITO電極的表面上載置水滴，對(duì)施加恒電位(-0. 4V或+O. 4V(相對(duì)于Ag/AgCl)) (24小吋)前后的接觸角或施加高頻變動(dòng)電位(±1. 0V、3MHz、矩形波變動(dòng)電位)30分鐘或60分鐘前后的接觸角進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖10所示。通過施加-O. 4V和+0. 4V的恒電位(相對(duì)于Ag/AgCl) 24小時(shí)，對(duì)于水的接觸角降低約20 30%，與此相對(duì)地，施加高頻變動(dòng)電位30分鐘或60分鐘時(shí)降低約20 40%，可知電極的親水性在更短時(shí)間內(nèi)増加。由該結(jié)果推測(cè)，本發(fā)明中的通過對(duì)動(dòng)物細(xì)胞施加高頻變動(dòng)電位進(jìn)行的剝離的原因之ー為，電極表面的親水性增加。エ業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明對(duì)于再生醫(yī)療等必需可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的領(lǐng)域來說是有用的。
權(quán)利要求
1.可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法，其包括(I)在至少一部分為電極的基板表面上培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的步驟，和 (2)對(duì)所述電極施加高頻變動(dòng)電位、將通過培養(yǎng)而附著在所述基板表面上的細(xì)胞剝離的步驟， 其特征在于，所述高頻變動(dòng)電位的頻率為IKHz IOMHz的范圍，且形成±1. OV(相對(duì)于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度，以及剝離時(shí)的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其中，所述剝離時(shí)的培養(yǎng)液為磷酸緩沖液(不含Ca2'Mg2 + )。
3.如權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其中，所述高頻變動(dòng)電位為矩形波、正弦波或三角波。
4.如權(quán)利要求I 3中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述基板表面全部為電扱。
5.如權(quán)利要求I 3中任意一項(xiàng)所述的制備方法,其中，所述基板表面的一部分為電極，在步驟(2)中剝離電極表面上及電極附近的非電極表面上的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求I 5中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其含有將所剝離的可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)一步傳代而維持可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的步驟。
7.如權(quán)利要求I 6中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，進(jìn)行培養(yǎng)使細(xì)胞形成片狀，將片狀細(xì)胞以可以增殖的狀態(tài)剝離，并得到可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞片。
8.如權(quán)利要求I 7中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中，動(dòng)物細(xì)胞為皮膚細(xì)胞。
全文摘要
提供細(xì)胞的粘接、增殖性優(yōu)異，同時(shí)增殖后可以對(duì)細(xì)胞不造成損傷地脫離培養(yǎng)細(xì)胞的可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法，以及可以增殖的皮膚細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞片的制備方法。其為含有下列步驟的可以增殖的動(dòng)物細(xì)胞的制備方法(1)在至少一部分為電極的基板上培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的步驟，和(2)對(duì)電極施加高頻變動(dòng)電位、將通過培養(yǎng)而附著在上述基板表面上的細(xì)胞剝離的步驟。上述高頻變動(dòng)電位的頻率為1KHz～10MHz的范圍，且形成±1.0V(相對(duì)于Ag/AgCl)或更小的電位的幅度。剝離時(shí)的培養(yǎng)液為不含有鈣和鎂的培養(yǎng)液。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102695789SQ20108004911
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者小山純弘 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人海洋研究開發(fā)機(jī)構(gòu)