專利名稱：加載dna的載體上的金納米顆粒、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及加載DNA的載體上的金納米顆粒，其制備方法及用途。更具體地，本發明涉及用于基因遞送的具有銳利邊緣的碳嵌入(carbon embeded)納米金顆粒。本發明還涉及用于制備所述具有銳利邊緣的碳嵌入納米金顆粒的方法和用該納米金顆粒轉化植物的方法。盡管預期碳載體具有如惰性和較佳穿刺能力等特性，嵌入的Au納米顆粒卻提供了對DNA的最佳載體。
背景技術：
在生物成分中顯示預期特性的基因操作打開了許多新的道路。病毒載體已經被鑒定為成功的基因遞送載體。由于它們具有如急性毒性、細胞免疫反應、由于插入突變引起的致癌性、有限的承載能力、對重復感染和生產的抗性以及質量控制的可選方案等局限， 非病毒載體如基于脂類、多聚化合物、糖樹枝狀聚合物和多肽等系統已經顯示為更佳的替代方案。正在研究納米顆粒，尤其是碳納米結構，用于基因遞送應用。然而，大部分研究局限于動物系統或細胞系。另一方面，植物系統的非病毒載體相對欠發達，除了如在Nature， 1987327,70-73中所述的由Sanford等人開發的新方法，其使用了采用加速的DNA包被的微小金射彈將DNA遞送進入完整的植物細胞中的粒子槍。作為對微小金結構的改進， Wang和其合作者合成了用于多重基因遞送的加載納米金的介孔二氧化硅，其公開于Nature Nanotech. ,2007,2,295-300中。盡管金覆蓋的低密度介孔二氧化硅顯示能穿透軟玉米胚， 但沒有可證明的數據表明其能穿透硬胚如一種木本樹種。最近，在雜志“Small，，2006，2，621-625中 Leng Nie 等的題為"Three dimensional functionalized tetrapodlike ZnO nanostructures for plasmid DNA delivery，，白勺論文中，報道了一種將DNA遞送進入人細胞系的模擬病毒載體衣殼的四足銳利結構，其中攜帶質粒的四足銳利尖端進入細胞，從而產生必要的轉染。類似地，Vakarelski等在Langmuir， 2007，23，10893-10896中也報道了相比于需要較低的力(0. 1-0. 2nN)來穿透胞質膜的碳納米管(直徑為20-30nm)，硅納米針(直徑為200-300nm)需要0. 7-2. OnN的力，這再次強調了銳利物體在基因遞送類應用中的功效。此處值得提及的是，關于細胞內和細胞外微生物的金屬納米顆粒合成可獲得大量文獻(參考 Narayanan，K. B.禾口 Sakthivel，N. 2010. Advances in Colloids and Interface Science. 156 [1-2] :1-13)。然而，卻沒有關于通過將納米顆粒加載于銳利邊緣的載體上的報道，其不僅能幫助DNA轉運進軟組織，也可以幫助DNA轉運進硬組織。因此，現有技術的調查顯示需要具有銳利邊緣的遺傳物質載體。而且，所述載體還應具有攜帶遺傳物質的足夠能力以及穿透硬材料但損傷較小的銳利度。所述載體的制備方法應當簡單，易于實施并且還能填補現有技術的空白及滿足本領域的需求。發明簡述發明目的因此本發明的主要目的是提供邊緣銳利的基因載體組合物。
本發明的另一個目的是提供用于基因遞送的嵌入邊緣銳利的載體中的金納米顆粒。本發明的再另一個目的是提供具有穿透硬材料的能力且對材料損傷微小的遺傳物質載體。本發明的又一個目的是提供具有較低質粒和金需求的用于基因遞送的復合載體。本發明進一步目的是提供制備具有銳利邊緣的加載DNA的載體上的納米金顆粒的方法和用其轉化植物的方法。
發明內容
考慮到具有銳利邊緣的載體和納米金的組合可以是基于基因槍的轉化的一個重要突破，我們在這里描述了用生物化學/物理學/化學轉化相結合的碳負載的金納米顆粒的制備。通過惰性加熱通過對應于ATCC18500的真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus) ITCC 6436原位合成的細胞內金納米顆粒來制備該顆粒。600°C下熱處理的細胞內金納米顆粒為了簡要的目的在本文中進一步表示為HTC-600AU。這種基質支持了金納米顆粒，從而為 DNA提供了結合的平臺，且提供了載體的最小密度，以獲得穿透植物系統中的硬細胞壁的基因槍中的閾速度。嵌入碳基質中的Au納米顆粒提供了 DNA可以結合的平臺。碳載體夾住了 Au納米顆粒并在DNA包被過程所需的超聲步驟中防止它們浸出(leach)。另一方面，在純碳材料中，由于不存在金，DNA不能結合。因此，本發明提供了加載DNA的載體上的金納米顆粒，其特征為加載DNA的載體上的金納米顆粒具有圖2A中曲線2中所示的銳利邊緣。本發明進一步提供了制備加載DNA的載體上的金納米顆粒的方法，其中步驟包括[a]將能夠合成細胞內金納米顆粒的微生物培養物接種于營養培養基中并培養以獲得生物質；[b]收獲步驟[a]中獲得的生物質，隨后在無菌條件下用無菌蒸餾水洗滌生物質；[c]將步驟[b]中獲得的經洗滌的生物質懸浮于HAuCl4溶液中并孵育2-3天，隨后在無菌條件下用無菌蒸餾水洗滌生物質；[d]將步驟[C]中獲得的經洗滌的生物質在管式爐中在惰性條件下熱處理6-8小時以獲得熱處理的碳金HTC-600AU ；[e]用乙醇洗滌步驟M中獲得的HTC-600AU ；[f]將乙醇洗滌的無菌HTC-Au-600與XHO緩沖液(基于Tris. Cl,NaC的緩沖液) 中懸浮的DNA混合；[g]用亞精胺和PEG順序平衡步驟[f]中獲得的混合物，隨后在2. 5M CaCl2中超聲處理；[h]以12000rpm離心步驟[g]中獲得的超聲處理的混合物并用無水乙醇洗滌沉淀 (pellet)兩次，最后在所需體積的乙醇中重懸以獲得加載DNA的載體上的金納米顆粒。
圖1. A 用金離子孵育前的生物質。
B 用金離子孵育后的生物質。C =SEM下真菌的細微菌絲。D SEM下的煅燒的生物質。
2. A =XRDif0曲線1 用IX IO^3M HAuCl4孵育的未煅燒的生物質；曲線2 在600°C下熱處理的碳金(HTC 600-Au)；B 生物質的拉曼譜(樣品1)；C 在600°C下熱處理的碳金的拉曼譜(HTC 600-Au)。圖3. (A)在600°C下熱處理的碳金的SEM圖(HTC 600-Au)；(B、C和D)在600°C下熱處理的碳金的TEM圖(HTC 600-Au)。注意如在C和D的 TEM圖中顯示的嵌入碳基質中的小金顆粒平面的存在；插圖D金納米顆粒的HRTEM圖表明了對應于金的111相的“d”間隔。圖4.將在Img 600°C下熱處理的碳金(HTC 600-Au)上的不同濃度的質粒DNA標準化以匹配商售微米金規格獲得的⑶S位點數。圖5.生物彈轟擊的銀合歡屬(leucaena)胚的SEM圖。A、B、C 和 D :100、30、10 和 3μπι尺寸的胚；E禾口 F 10禾口 3 μ m尺寸的以HTC 600-Au轟擊的胚；G禾口 H 10禾口 3 μ m尺寸的以微金顆粒轟擊的胚；I禾Π J :1 μ m禾Π 300nm尺寸的未轟擊的胚。圖6.生物彈轟擊的稻米愈傷組織的SEM圖。A和B是以HTC 600-Au轟擊的愈傷組織；C和D是以微金顆粒轟擊的愈傷組織。發明詳述就本發明的目的而言，“納米金加載的邊緣銳利的碳子彈”、“銳利碳質片上負載的金納米顆粒”和“HTC 600-Au”的表述方式在整個說明書中是可互換使用的，且它們可以由本領域技術人員同樣地理解的。此處所述術語“HTC 600-Au”是指用本發明的方法制備的在600°C熱處理的碳金。在本發明中，將包含銳利碳質片上負載的金納米顆粒的復合材料描述為用 Sanford和其合作者開發的基因槍進行基因遞送的替代材料。盡管預期碳載體具有如惰性和較佳穿刺能力等的所需特性，嵌入的金納米顆粒卻提供了 DNA的最佳載體。用于制備上述復合材料的第一步包括將能在細胞內合成Au納米顆粒的微生物生物質與金離子一起孵育，導致生物質顯現寶石紅色，這表明在細胞基質內金離子被還原為 Au納米顆粒。將加入生物基質的金前體的濃度優化以獲得進入生物基質的金納米顆粒的最大加載。此外，發現測試的不同批次間煅燒后獲得的金的濃度是一致的。為了確定復合材料HTC-600 Au可以作為有效的DNA遞送劑發揮功能，以指定用于微米大小的金顆粒的普通常規方法[Bio-Rad Laboratories,Hercules,USA]用DNA包被上述合成的HTC-600 Au。最后，DNA包被的HTC-600 Au懸浮于無水乙醇中，且在使用前儲存于-20攝氏度下。用Biolistic-PDS 100/He系統以上述DNA包被的HTC-600 Au的等分試樣進行轉化實驗。在將質粒DNA至雙子葉樹種銀合歡(Leucaena Ieucoc印hala)的遞送標準化后，發現加載于HTC 600-Au(600°C下熱處理的碳金)的僅200ng質粒DNA就足以比得上利用加載于商用非生物微米金載體(圖3B)上的600ng質粒DNA所得的結果。因此，用加載于HTC 600-Au上的200ng質粒DNA進行所有其他研究。而且，根據顆粒大小分布(圖2C ；插圖) 和所用的金的重量，確定這200ng質粒DNA對應于約0. 23個質粒加載在一個金顆粒上。作為比較，加載在微米大小金上的600ng的質粒對應于載荷在各個顆粒上的約2100個質粒。 因此，很明顯，由于有更大的表面積，質粒DNA能更均勻地鋪展在HTC 600-Au上，且它們能有效地遞送至期望的位置。因此，本發明公開了包括銳利碳質片上負載的金納米顆粒的復合材料。在一個實施方式中，本發明提供了任選金屬、金屬離子或金屬氧化物納米顆粒的載體上的載體組合物。 在另一個實施方式中，發現本發明的金屬納米顆粒的載體上的載體組合物可用于許多領域，比如，但不限于，用于DNA遞送、去除金屬離子、燃料電池、抗細菌和催化作用中。在再另一個實施方式中，所述載體選自碳質材料、含氮材料、硫、含磷材料、細胞材料、生命物質及類似物。在另一個實施方式中，所述微生物優選選自施氏假單胞菌(I^eudomonas stutzeri)AG 259 ATCC 17588、海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)、鮑氏織線藻 (Plectonema boryanum)UTEX485、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α、莢膜紅細菌 (Rhodobacter capsulatus)lif (Corynebacterium)p. SH09>^ifelf |ifM (Bacillus sp·)、乳酸菌屬(Lactobacillus sp.)、輪枝菌屬(Verticillium sp.) (AAT-TS-4) (ATCC. 16312)、單端孢霉屬(Trichothecium sp.)、V. luteoalbum、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)禾口黃曲霉(Aspergillus flavus)。在又一個實施方式中，本發明提供了制備加載DNA的載體上的金納米顆粒(優選負載于碳質載體上)的方法，其中步驟包括(a)在含麥芽糖-葡萄糖-酵母提取物和蛋白胨肉湯的培養基中接種真菌孢子；(b)使孢子在37°C下3天萌發以產生菌絲，以獲得收獲的生物質，隨后在無菌條件下用熱壓處理的MilliQ 水洗滌生物質；(c)在HAuCl4溶液中重懸步驟(b)獲得的生物質，隨后37 °C下孵育兩天，隨后以 MilliQ 水洗滌；(d)將步驟(c)中獲得的生物質在管式爐中在氮氣流下600°C熱處理6小時以獲得產物 HTC 600-Au ；(e)用乙醇洗滌步驟(d)中獲得的HTC-600 Au并與XHO緩沖液(基于Tris. Cl， NaC的緩沖液)中懸浮的DNA混合；(f)用亞精胺和PEG順序平衡步驟(e)中獲得的混合物，隨后在2. 5M CaCl2中超聲處理；(g)以12000rpm離心如步驟(f)中獲得的超聲處理的混合物并用無水乙醇洗滌沉淀兩次，最后在所需體積的乙醇中重懸以獲得碳質載體上負載的加載DNA的金納米顆粒。在本發明的另一個實施方式中，孢子優選為對應于ATCC 18500的赭曲霉ITCC 6436的孢子。HAuCl4溶液的濃度優選為10_3摩爾。在再另一個實施方式中，將濕重為60g的經洗滌生物質懸浮于200mL 10_3M HAuCl4中。將產物熱處理從而獲得400mg HTC-600Au。在又一個實施方式中，通過惰性加熱如實施例1中例舉的由對應于ATCC18500的真菌赭曲霉ITCC 6436原位合成的細胞內金納米顆粒來制備本發明的載體組合物。這種基質負載金納米顆粒，從而為DNA提供了結合的平臺，且提供了載體的最小密度以獲得穿透植物系統中細胞壁的基因槍中的閾速度。在本發明的再另一個實施方式中，1至IOmg載體組合物與每次轟擊至少2ng DNA 的組合表明在不同物種中的不同轉化水平。在本發明的再另一個實施方式中，為了研究用于遺傳修飾細胞的本發明載體組合物，對茄科、禾本科和豆科植物進行了研究。然而，本發明方法的遺傳修飾細胞選自，但不限于，植物物種、細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞。在進一步的實施方式中，HTC 600-Au和微小金在煙草中三次重復的平均再生效率分別為41. 73%和38. 93%，其轉化效率為14. 80%和12.40%。在稻米的情況中，HTC 600-Au和微小金的再生效率分別為26. 42%和23. 25%，其轉化效率為9. 33%和8. 42%。 在銀合歡屬的情況中，由于需要更長的再生時間(6至7個月)，推定的轉基因植物仍在選擇過程中，因此再生和轉化效率還沒有得出。在另一個實施方式中，由于碳基質構成了 95%的載體，本發明中金的量和每次轉化所用的DNA減少了。而且，在模型植物煙草(Nicotiana tcAaccum)、單子葉植物稻(Oryza sativa)和雙子葉樹種銀合歡的制備材料中觀察到的更高的瞬時或穩定的GUS表達和轉化效率歸因于由SEM研究證實的這種相比于典型的Ι.Ομπι非生物載體的更小的和邊緣銳利的載體產生的更小損傷。GUS位點與HTC 600-Au有效載量的更高比例提供了降低嵌合體百分比的可能性，這是基因槍方法中的一個重要關注點。在再另一個實施方式中，金顆粒為納米尺寸的，從而為操縱更多基因荷載提供了更高的金顆粒面積。邊緣銳利的石墨樣碳也可以穿透硬植物細胞壁和核膜并將基因定位于染色質絲中。SEM圖表明用基因槍轉化后，創傷愈合非常快，這是高效轉化所需的。
實施例以下包括優選實施方式的實施例將用于說明本發明的實施，應理解所示細節是示例的方式且目的在于說明性討論本發明的優選實施方式，而不應被解釋為用于限制本發明的范圍。實施例1 在典型反應中，將分離的真菌孢子接種于含200mL麥芽糖-葡萄糖-酵母提取物和蛋白胨肉湯的500mL愛倫美式燒瓶中。使得對應于ATCC 18500的赭曲霉ITCC 6436的孢子在37°C下在振動器QOOrpm)中萌發并產生菌絲3天。其產生濕重為60g的生物質， 收獲該生物質并在無菌條件下用熱壓處理的MilliQ 水進行三輪洗滌(IOOOrpm 15分鐘)。 然后將生物質重懸于200mL IO^3M HAuCl4中，隨后在37°C下在振動器QOOrpm)中孵育2 天。以MilliQ 水洗滌生物質產物并在管式爐中在氮氣流下熱處理(600°C，6小時)。得到 400mg產物，精細研磨并鑒定。用AAS分析該樣品中的金濃度，發現為約5wt%。該樣品表示為HTC 600-Au。真菌生物質與金離子一起孵育導致生物質顯現寶石紅色，這表明在細胞基質內金離子被還原為Au納米顆粒(圖IA和B)。
實施例2 記錄室溫下干燥并粒化為粉末(圖2A，曲線1)和在惰性氣體中在600°C下煅燒 (圖2A，曲線2)的生物質的XRD信號。如此制備樣品的XRD圖(曲線1)顯示了 fee金的特征性d值為約2. 36,2. 04、1. 45和1.23人的多個布拉格反射。這清楚地表明納米顆粒是剛剛通過生物質處理金離子而形成的。HTC 600-Au的峰(曲線2)比未加熱制得的樣品的峰更尖銳，表明了加熱后結晶度的改善。實施例3 通過將碳負載的HTC 600-Au的水性分體液滴置于無定形碳涂覆的銅網上并使溶劑風干來制備其TEM樣品。用以300kV加速電壓操作的"Technai G2F_30型和以200kV操作的JEM 2100儀器記錄透射電子顯微(TEM)圖像。圖3A的SEM圖像顯示了由許多平板樣材料制成的銳利顆粒。選擇該圖來突出顯示這種材料可能具有的銳利尖端/邊緣。較低放大率的TEM圖像(圖3B)表明嵌于邊緣銳利的碳基質中的50nm Au納米顆粒的存在。在圖 3C中，除了少量50nm顆粒外，還觀察到遍及碳層的大量5nm顆粒分布。在圖3D中碳的更近視圖仍然顯示了波狀邊緣，表明其中一個片突出以形成銳利邊緣的片束排列。一個分離的顆粒的HRTEM圖像(插圖3D)顯示了2.4人的“d”間隔，與(111)金平面的2.36人點陣間隔匹配。實施例4 用632. 8-nm HeNe激光激發以反向散射配置測定拉曼譜。用配備電荷耦合陣列檢測器和全息陷波濾波器的Jobin-Yvon HR800分光儀分析散射光。為了避免激光對樣品的損傷，在低激光功率OW/cm2)下進行實驗。HTC 600-Au的拉曼信號繪制于圖2C中。曲線顯示了無序碳特征性的約1590CHT1和約1350CHT1處的峰特征，分別稱為G和D峰。將數據去卷積并擬合為兩個高斯峰。根據1365CHT1和ΙδθΟοπΓ1處的峰的強度，確定HTC 600-Au中石墨平面內域尺寸(La)值為1.35nm，與無金納米顆粒的純碳樣品中的0. 90nm形成對比。HTC 600-Au中1. 35nm的平面內尺寸仍表明無定形碳基質的存在。實施例5 用具有金中空陰極燈的Chemito-原子吸收光譜儀(AAS) 201測定金濃度。用Leica Stereoscan 440型記錄掃描電子顯微(SEM)圖像。實施例6:煙草(N. tabaccum var. Anand 119)植物體外生長于不含任何植物生長調節劑的 Murashige和Skoog基礎培養基(MS培養基196 上。兩個月大植物的新鮮葉用作外植體， 并將其切成約5mm2塊，在25士2°C下在生長培養器中于黑暗中接種于含1. 4%瓊脂并補充 2%蔗糖、0.8% 6-芐氨基嘌呤(BAP)和α-萘乙酸(NAA)的MS基礎培養基(ρΗ 5.8)中用于愈傷組織誘導。按每平方英寸(psi)900磅的規格以25英寸Hg真空和間隔4小時使用爆破片(rupture disc)在將來源于葉外植體的所選擇胚發生性愈傷組織放置于90mm直徑的Petri板中央后用HTC-600AU轟擊兩次。在黑暗中孵育兩天后，將經轟擊的愈傷組織轉移至含MS基礎培養基、B5維生素、lmg/L BAP、0. lmg/L NAA、30g/L蔗糖和4g/L植物凝膠的分化培養基中一周，然后轉移至含100mg/L濃度的植物選擇標志物卡那霉素的相同培養基中。分析三輪選擇后存活的推定轉基因植株。手工去皮的稻米(本地優良的indica培育種IR64)種子用70%乙醇表面消毒3分鐘，隨后用1.5% (ν/ν)次氯酸鈉消毒10-15分鐘，再以無菌蒸餾水洗滌5-7次。然后將消毒種子置于含2.5mg/L 2，4-D的MS培養基(愈傷組織誘導培養基)上并在25士2°C下在黑暗中培養3周。在用PDS-1000/He生物彈顆粒遞送系統首次轟擊前4小時，計數50份脆弱的胚發生愈傷組織并置于裝有含滲透劑的愈傷組織誘導培養基(補充36. 4g/L甘露醇和 6. 4g/L山梨醇的愈傷組織誘導培養基)的90mm直徑的Petri板中央。如之前所進行的用爆破片轟擊外植體兩次。第二次轟擊48小時后，將愈傷組織直接轉移至含50mg/L潮霉素 B的MS愈傷組織誘導培養基上，并在25士2°C下培養15-18天。以15-18天的間隔將活躍增殖的愈傷組織在新鮮的選擇培養基上分培養三次。將潮霉素B選擇3輪后的增殖胚發生性愈傷組織轉移至MS再生培養基(分別補充3mg/L和0. 5mg/L的BAP和NAA (Sigma，USA) 的MS培養基)。在25°C下，愈傷組織于光照(110-130mM/m2/s)下培養16小時，在黑暗中培養8小時，直至產生芽。將新生的芽轉移至含30mg/L潮霉素B的MS生根培養基(半強度MS基礎鹽，MS維生素和15g/L蔗糖)中。實施例7 從豆莢中取出的一種常年生長的豆科樹種銀合歡(銀合歡樹，white popinac, subabul)的種子用1.5% (ν/ν)次氯酸鈉溶液表面消毒10-15分鐘，隨后以無菌水洗滌4次。用一把尖銳的無菌鑷子無菌分離未成熟的胚，芽尖朝上放置于含再生培養基 (1/2MS+Thia Dia Zuron) (0. 5mg/L)的90mm直徑Petri板的中央。如之前所進行的轟擊胚并在黑暗中保持兩天。胚在未選擇的情況下在上述再生培養基中生長一周后，在含IOOmg/ L卡那霉素的同樣再生培養基中進行三輪選擇，間隔為15天。將三輪200mg/L卡那霉素選擇后存活的植株轉移至含0.5mg/L細胞分裂素2ip(2-異戊烯基腺嘌呤)的1/2MS以增強轉化新芽的延長。在上述所有實施例中，用聚合酶鏈式反應確認植物轉化。轟擊的組織用SEM檢驗， 以顯現損傷和穿透效率。圖4表明僅僅200ng質粒就足以比得上與植物轉化中所用的600ng 經典非生物微米金載體的結果。還發現當每單位HTC 600-Au的DNA濃度增加時，可以獲得 GUS表達位點的更高水平，這可以優化，且非常好地用于其它植物轉化系統。因此，可以推測，通過細胞內生物源的納米顆粒的簡單熱處理制備的邊緣銳利的載體上的Au納米顆粒證明為比市場可買到的納米大小的金顆粒更佳的植物轉化非生物載體。這說明了細胞內合成的納米顆粒的獨特應用，否則，除非從基質中分離納米顆粒，其沒有應用。本發明的優點本發明提供的復合物的優點如下-由于金顆粒為納米級別，獲得了更高的金表面積，因此可以操縱更高基因載荷。-由于已知金支持高DNA包裝密度，它可能得到更高的轉化效率和低核酸酶降解。-嵌入的金也改善復合物的密度，從而使之能夠獲得必要的閾速度。-而且，邊緣銳利的石墨樣碳可以穿透硬植物細胞壁和核膜并將基因定位于染色體位點中。SEM圖像表明，轉化后細胞壁/核膜的創傷愈合非常快，這是高效轉化所需要的。
權利要求
1.加載DNA的載體上的金納米顆粒，其特征在于所述加載DNA的載體上的金納米顆粒具有圖2A中曲線2中所示的銳利邊緣。
2.如權利要求1所述的加載DNA的載體上的金納米顆粒，其中所述載體選自碳質材料、 含氮材料、硫、含磷材料、細胞材料和生命物質。
3.如權利要求1所述的加載DNA的載體上的金納米顆粒，其中載體優選為碳質。
4.如權利要求1所述的加載DNA的載體上的金納米顆粒，用于穿透細胞壁，優選用于基因遞送。
5.制備加載DNA的載體上的金納米顆粒的方法，其中包括步驟[a]將能夠合成細胞內金納米顆粒的微生物培養物接種于營養培養基中并培養以獲得生物質；[b]收獲步驟[a]中獲得的生物質，隨后在無菌條件下用無菌蒸餾水洗滌所述生物質；[c]將步驟[b]中獲得的經洗滌的生物質懸浮于HAuCl4溶液中并孵育2-3天，隨后在無菌條件下用無菌蒸餾水洗滌所述生物質；[d]將步驟[c]中獲得的經洗滌的生物質在管式爐中在惰性條件下熱處理6-8小時以獲得熱處理的碳金HTC-600AU ；[e]用乙醇洗滌步驟[d]中獲得的HTC-600AU；[f]將乙醇洗滌的無菌HTC-Au-600與懸浮于XHO緩沖液(基于Tris.Cl，NaC的緩沖液)中的DNA混合；[g]用亞精胺和PEG順序平衡步驟[f]中獲得的混合物，隨后在2.5M CaCl2中超聲處理；[h]以12000rpm離心步驟[g]中獲得的超聲處理的混合物并用無水乙醇洗滌沉淀兩次，最后在所需體積的乙醇中重懸以獲得加載DNA的載體上的金納米顆粒。
6.如權利要求5所述的方法，其中微生物優選自施氏假單胞菌AG259 ATCC 17588、海藻希瓦氏菌、鮑氏織線藻UTEX485、大腸桿菌DH5ci、莢膜紅細菌、棒狀桿菌p. SH09、芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、輪枝菌屬(AAT-TS-4) (ATCC. 16312)、單端孢霉屬、V. luteoalbum、赭曲霉和黃曲霉。
7.如權利要求5所述的方法，其中所述微生物優選為對應于ATCC18500的赭曲霉 ITCC 6436。
8.如權利要求5所述的方法，其中HAuCl4溶液的濃度優選為10_3摩爾。
9.如權利要求5所述的制備加載DNA的載體上的金納米顆粒的方法，優選在碳質載體上，其中包括步驟[i]在含麥芽糖-葡萄糖-酵母提取物和蛋白胨肉湯的培養基中接種對應于ATCC 18500的赭曲霉ITCC 6436的真菌孢子；( )使孢子在37°C下三天以萌發而產生菌絲，以獲得收獲的生物質，隨后在無菌條件下用熱壓處理的MiIliQ^水洗滌所述生物質；(iii)在HAuCl4溶液中重懸步驟(ii)中獲得的生物質，隨后在37°C下孵育兩天，隨后用MiIliQ 水洗滌；(iv)將步驟(iii)中獲得的生物質在氮氣流下在管式爐中600°C下熱處理6小時以獲得產物 HTC-600AU ；(ν)用乙醇洗滌步驟(iv)中獲得的HTC-6OOA11并與懸浮于XHO緩沖液(基于Tris. Cl， NaC的緩沖液)中的DNA混合；(vi)用亞精胺和PEG順序平衡步驟(ν)中獲得的混合物，隨后在2.5M CaCl2中超聲處理；(vii)以12000rpm離心步驟(vi)中獲得的超聲處理的混合物并用無水乙醇洗滌沉淀兩次，最后在所需體積的乙醇中重懸以獲得負載在碳質載體上的加載DNA的金納米顆粒。
10.基本上如本文中參照說明書所附的實施例和附圖所述的加載DNA的載體上的金納米顆粒、其制備方法及其用途。
全文摘要
本發明涉及嵌于銳利碳質載體中的DNA加載金納米顆粒，其可用于DNA更高效地遞送進入植物。這些納米金嵌入的碳基質通過生物源的細胞內金納米顆粒的熱處理來制備。在植物模型中測試DNA遞送效率。這些材料表現出轉運物質的良好分散，從而產生更多的單位面積GUS位點。復合載體的額外優點是更少的質粒和金的需求。具有制備的碳負載顆粒的植物細胞損傷非常小，這可以從與商售的微米尺寸的金顆粒相比植物再生和轉化效率的增加來判斷。這可能是由于碳載體所具有的銳利邊緣，其導致使損傷最小化的同時具有更佳的穿刺能力。
文檔編號C12N15/10GK102575247SQ201080042978
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月3日 優先權日2009年8月4日
發明者L·V·B·帕拉薩德, M·K·巴希爾, S·V·佩里亞薩米, U·A·奧薩拉薩拉 申請人:科學與工業研究委員會